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.2007年2月26日；176(5):667-80.
doi:10.1083/jcb.200608010。

黏附斑激酶调节张力信号以控制肌动蛋白和黏附动力学

马库斯·肖伯 1, 斯里卡拉·拉加万, 玛丽亚·尼科洛娃, 丽莎·波拉克, H阿马利亚·帕索利, 希拉里·贝格斯, 路易斯·莱查特, 福克斯
附属公司

黏附斑激酶调节张力信号以控制肌动蛋白和黏附动力学

马库斯·肖伯等。 J细胞生物学. .

摘要

作为对α-β1整合素信号的响应，诸如黏着斑激酶（FAK）等传感器被激活，传递到特定机制并触发不同的细胞反应。通过有条件地消融皮肤表皮中的Fak和培养Fak缺失的角质形成细胞，我们表明Fak对于表皮粘附和基底膜组装是可有可无的，这两者都需要α-β1整合素。FAK也不适合在浓缩培养基中增殖/存活。相反，FAK在α-β1整合素下游调节细胞骨架动力学和协调极化角质形成细胞从表皮外植体中迁移。Fak-null角质形成细胞显示异常的肌动蛋白细胞骨架，这与强健的周围局灶性粘连和微管紧密相关。我们发现，如果没有FAK、Src、p190RhoGAP和PKL-PIX-PAK，局部粘连的定位和/或激活就会受损，导致Rho活性升高，肌球蛋白轻链激酶磷酸化，张力纤维增强。我们表明，这些FAK依赖性活动共同对控制焦点粘连的周转至关重要，在缺乏FAK的情况下，焦点粘连会受到干扰。

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数字

图1。
图1。
在缺乏FAK的角质形成细胞中，基底膜、表面整合素和细胞粘附完整。（A，A′和C）FAK和真皮-表皮交界处。新生儿WT和K14-Cre/Fak系列飞行/飞行cKO皮肤切片进行免疫荧光显微镜检查，显示抗体。抗体根据二级抗体进行颜色编码。虚线划定了表皮（Epi）和真皮（Derm）之间的边界。白色方框（A）中的区域以A′放大。β1，β1整合素；层粘连蛋白5；DNA、DAPI染色；HP，发牌；BL，基底层。（B） 表皮细胞裂解物的免疫印迹。用以下抗体检测斑点：FAK、pY397-FAK（p-FAK）和β-肌动蛋白（负荷控制）。（D） 透射电镜（TEM）显示WT和cKO表皮-真皮边界的代表性示例。注意半桥粒（Hd）的可比形态、大小和密度。BM，基底膜。（E） 半桥粒长度和频率不受FAK丢失的影响。左侧的方框和胡须图显示了数据的分布：平均值（平方）、25%（底线）、中位数（中线）、75%（顶线）、5%和95%（胡须）以及最小和最大测量值（x）。（参见图S2，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200608010/DC1，了解更多信息。）右侧的图表显示了每微米基底质膜半桥粒的总微米分析。（F） 表皮整合素表面水平的FACS定量。使用的表面特异性整合素抗体显示在每个图表的底部。活性β1对应于一种表面抗体，可特异识别β1的活性构型，而与α伙伴无关。灰色线表示二级抗体-仅为对照。（G） 按照材料和方法中的说明进行粘附性分析。注意WT和cKO角质形成细胞与FN、层粘连蛋白1、胶原4和聚-d日-赖氨酸底物。误差条反映了三次重复实验的SD。
图2。
图2。
Fak公司-在最佳生长条件下，空白角质形成细胞增殖良好。原代MK培养自假的成纤维细胞饲养层上的cKO和WT表皮（a）。一旦菌落形成，用Versene选择性地去除饲养者，在没有饲养者的情况下对MK进行传代，以进行后续研究（B-D）。（A） 代表性WT和假的喂食器上的KO菌落。（B） 细胞周期分析。在培养基中施用BrdU 4 h，然后进行收获和FACS分析。注意可比较的细胞周期曲线和BrdU掺入。（C） 增长曲线。将MKs接种在含血清的培养基中，然后每天采集细胞三次，并对细胞进行计数。误差条显示采集前在有或无血清条件下培养24小时的MK裂解物的SD.（D）免疫印迹分析。使用的抗体如左图所示；谱带大小的分子质量在右边以kD表示。
图3。
图3。
PYK2和ILK仍局限于FAFak公司-角质形成细胞缺失。WT和WT的免疫印迹分析和免疫荧光Fak公司KO MK（A）或WT和β1KO MK（B）。所使用的抗体如图所示，但卵磷脂（红色）用于标记F-actin，DAPI（蓝色）标记核染色质。磷酸化版本的FAK和PYK2是活性的。抗体根据使用的二级抗体进行颜色编码。方框中的区域被放大并显示为插图，其中省略了阴茎倍体荧光。请注意Fak公司KO MK仍显示激活的PYK2和FA放大的ILK。
图4。
图4。
缺乏FAK的角质形成细胞显示出夸大的FA-actin应激纤维网络和收缩的细胞形态。（A） 来自WT和Fak公司cKO表皮在FN上扩散48小时，并用抗FAK（绿色）、鬼笔色素（红色）和DAPI（蓝色）标记。方框区域在插图中放大，只显示防FAK染色。（B） 细胞扩散动力学的方框和胡须图，显示平均值（平方）、25%（底线）、中位数（中线）、75%（顶线）、5%和95%（胡须）以及最小和最大测量值（x）。细胞扩散的形态分析是通过测量细胞与其基质之间的平均接触面积（单位：平方微米）来进行的，如盒状和晶须图所示。n个每个时间点≥60个细胞。星号表示WT和KO之间存在显著差异(t吨测试）。请注意，传播的差异随着时间的推移而增加。*，P=0.025；**，P=0.0018；***，P=0.0006。
图5。
图5。
FAK依赖于FA大小和分布的差异。（A和B）WT和Fak公司-KO角质形成细胞的肌动蛋白（红色）、核染色质（DAPI；蓝色）和FA标记物VIN和PXN（绿色）。（C） 散点图显示VIN标记的FA的综合荧光强度及其与细胞皮层的相对位置。（D） 描述FA从皮层到中心的分布和VIN标记FA的相对荧光强度的方框和胡须图。方框和胡须图表示平均值（平方）、第25个百分位（底线）、中位数（中线）、第75个百分位数（顶线）、第5个和第95个百分位点（胡须）以及最小和最大测量值（x）。*，P=0.00003；**，P<0.00001(t吨测试）。（E–G）逆转录病毒感染和重组FAK的表达挽救了肌动蛋白细胞骨架和FA大小和分布的缺陷。（E） 代表性WT的免疫染色，Fak公司-KO和FAK获救Fak公司-KO MKs带有抗FAK（绿色）、卵磷脂（红色）和DAPI（蓝色）。插图显示FAK染色，在KO中缺失，但在FAK拯救的KO细胞中恢复。（F和G）对VIN染色的再表达FAK的KO、WT和KO细胞（RESC）的定量分析显示，在KO角质形成细胞中再表达FAK后，KO FA的大小及其相对VIN染色强度恢复。误差条表示SEM。
图6。
图6。
FAK促进FA拆卸。表达K14-GFPactin（绿色）和RFPzyxin（红色）以分别标记F-actin和FAs的原代MKs的时间推移图像。（A） WT和KO细胞产生广泛的跛足和种子焦点复合体（箭头所示）。在KO MKs中，跛足优先在应力纤维异常网络和扩大的FA（箭头）周围形成。这导致细胞形状更加狭窄。（B） 不典型的厚肌动蛋白束（绿色）聚集在扩大且动态性较低的FAFak公司KO MKs公司。箭头标记FA在0分钟的位置。请注意，FA通常在30分钟后缩回（箭头），但在KO MK中，FA经常长时间保持在同一位置。（C） 描述WT和KO MK之间FA组装和拆卸差异的盒须图。方框和胡须图表示平均值（平方）、第25个百分位（底线）、中位数（中线）、第75个百分位数（顶线）、第5个和第95个百分位点（胡须）以及最小和最大测量值（x）。（D和E）箱须图描述了WT和KO MKs之间FRAP的半衰期和GFP-PXN的流动分数的差异。n个10个单个细胞上≥5个粘附。（F） WT和KO MKs中GFP-PXN的典型光漂白和回收动力学。
图7。
图7。
FAK控制细胞骨架组织和皮肤外植体的定向迁移。（A） WT和cKO皮肤外植体的相控图像（棕色；左侧）。与WT外植体相比，FAK缺陷外植体（cKO）的表皮突起严重减少。白色虚线表示前缘；黄色箭头表示外植体与其前缘之间的距离。（B） 皮肤外植体表皮生长的量化。三个独立实验的平均值±SD。（C和D）肌动蛋白（红色）和E-钙粘蛋白（绿色）或PXN（绿色）的免疫染色显示，细胞、肌动蛋白纤维和FA高度极化并朝向WT的前沿，而不是cKO外植体。棒材，20μm。（E）Fak公司KO-MKs在含有成纤维细胞条件培养基的Boyden室中从顶部向底部迁移的能力显著降低。三个独立实验的平均值±SD。P=0.0003，双尾t吨测试。
图8。
图8。
FAK调节p190RhoGAP和Rho/ROCK信号。（A–C）在有或无血清/生长因子培养的MKs中Src（pY418-Src）酪氨酸磷酸化状态的免疫沉淀和免疫印迹分析（A）；血清饥饿状态下p190RhoGAP的酪氨酸磷酸化Fak公司KO MKs（B）；MLC磷酸酶（MYPT）和MLC（pMLC）调节亚单位的磷酸化，反映了Rho/ROCK介导的张力增加（C）。（D和E）增强型pMLCFak公司KO与WT MKs。标记有磷酸化MLC抗体（pMLC；pSer 19 MLC；绿色）、MLC抗体和核染色质（DAPI；蓝色）的代表性细胞的免疫荧光显微镜。pMLC和MLC的定量比值成像显示WT与KO角质形成细胞中pMLC水平升高。（P=1.59E-05，双尾t吨测试；n个≥52个细胞）。误差条表示SEM。
图9。
图9。
FAK和张力信号成分之间的相互作用决定了FA的大小和定位。在使用ROCK抑制剂Y27632或MLCK抑制剂ML7处理12小时之前，将（A和B）WT和KO MKs镀在FN上12小时。三个独立实验的平均值±SD。免疫荧光显微镜（A）和定量分析（B）表明，ROCK或MLCK抑制可放松收缩的肌动蛋白细胞骨架，抑制VIN标记的强健FA，并促进细胞在KO-MKs中的扩散。黑色星号表示WT和KO之间存在显著差异（P≤0.05），绿色星号表示处理细胞与未处理细胞之间存在显著差别（P≤0.05）。（C） 盒子和胡须图显示了在5μM Y27632、5μM诺卡唑、5μM ML7或2μM泡状抑制素存在下VIN染色的FA的相对集成荧光强度。方框和胡须图表示平均值（平方）、第25个百分位（底线）、中位数（中线）、第75个百分位数（顶线）、第5个和第95个百分位点（胡须）以及最小和最大测量值（x）。n个每种情况≥10。通过方差分析和Tukey事后检验，绿色星号表示处理细胞与未处理细胞之间的显著差异（P≤0.05），黑色星号表示治疗之间的显著差别（P≤0.05）。
图10。
图10。
在缺乏FAK的情况下，FA的PKL和PAK活性降低。（A） 免疫印迹分析显示PKL水平降低，而PAK或PAK相互作用的鸟嘌呤核苷酸交换因子（βPIX；肌动蛋白为对照）水平无显著差异。（B） 免疫荧光显微镜显示PKL、βPIX、PAK和磷酸化（活性）PAK（p-PAK）定位于WT MKs的FAs，而Fak公司KO-FA仍含有βPIX，但PKL、PAK和p-PAK染色严重减少。磷脂（红色）标记F-actin，DAPI（蓝色）标记染色质。
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