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.2000年7月；20(14):5087-95.
doi:10.1128/MCB.20.14.5087-5095.2000。

人类Slug是一种定位于活性转录位点的阻遏物

K血液 1, S C大师, J哈里斯, J D Chen先生, Y T叶
附属公司

人类Slug是一种定位于活性转录位点的阻遏物

K血液等。 分子细胞生物学. 2000年7月.

摘要

已在脊椎动物和无脊椎动物的不同物种中鉴定出蜗牛/蛞蝓家族蛋白质。这些蛋白质含有四到六个锌指，起到DNA结合转录调节因子的作用。该家族的不同成员已被证明可以调节细胞运动、神经细胞命运、左右不对称、细胞周期和凋亡。然而，这些调节因子如何发挥作用的分子机制以及涉及的靶基因在很大程度上尚不清楚。在本报告中，我们证明人类Slug（hSlug）是一种阻遏物，调节激活物依赖性和基础转录。阻遏依赖于C末端DNA结合锌指和位于N末端的可分离阻遏结构域。该结构域可能招募组蛋白去乙酰化酶来修饰染色质并产生抑制作用。蛋白质定位研究表明，hSlug存在于细胞核内的离散病灶中。这种亚核模式与PML病灶或卷曲体不共存。相反，hSlug病灶与SC-35染色区域广泛重叠，其中一些区域被认为是活性剪接或转录的位点。这些结果使我们假设hSlug定位于激活发生的靶启动子，以抑制基础转录和激活剂介导的转录。

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数字

图1
图1
蜗牛家族蛋白质的结构关系。顶部显示的三种蛋白质，蜗牛、沃纽和蜗牛，来自果蝇.mSnail来自小鼠，三种Slug蛋白分别来自小鼠、鸡和人类。该家族的其他成员包括两条斑马鱼蜗牛、青蛙蜗牛和蛞蝓、原脊索动物蜗牛、鸡蜗牛、人类蜗牛和果蝇此处未显示划痕。三者的N终点果蝇蛋白质之间差异很大；这些区域在脊椎动物和无脊椎动物蛋白质中也有很大的差异。这个果蝇N末端（NT）盒和脊椎动物SNAG结构域是不同的基序，但都含有高碱性氨基酸残基。C-末端结合蛋白（CtBP）相互作用基序具有与P-DLS-K/R（41，42，47）相关的序列。DBD包含四到六个高度保守的锌指。
图2
图2
成人组织中hSlug的mRNA表达。这个h段塞使用全长cDNA制备放射性探针，然后将其与来自不同人类组织的mRNA杂交。分析显示与探针杂交的单个mRNA物种约为2.2 kb。卵巢中的表达相对较高，在外周血白细胞中几乎检测不到。所有其他被测试的组织都有可检测的和可变的表达水平。下面板显示了使用大鼠18S rRNA探针剥离后相同印迹的杂交，该探针与同源人类转录物交叉杂交。
图3
图3
hSlug是一种序列特异性DNA结合蛋白。含有全长或锌指结构域的hSlug蛋白的细菌提取物与含有共识SBS的双链寡核苷酸探针孵育。然后在丙烯酰胺凝胶上分析混合物。检测到一种显著的蛋白质-DNA复合物，其流动性比游离DNA慢（通道2至4，增加提取量）。在含有锌指结构域缺失hSlug的提取物中未发现该复合物（第5至7车道）。竞争试验（通道8至14）表明，野生型未标记寡核苷酸（SBS）是一种有效的竞争对手，而识别核心（SBS多用途终端)无法竞争。在类似的分析中，添加针对全长hSlug蛋白的两种抗血清（ab1和ab2），每种抗血清各一微升（第15至21道）。抗血清可消除复合物的形成，而免疫前血清（前imm1和前2）则不能。当将抗血清添加到混合物中时，也会形成流动性较慢的弱带（*），这表明形成了含有hSlug抗体的复合物。
图4
图4
hSlug抑制基础转录和激活转录。用不同的表达质粒和报告质粒组合转染人293T细胞。所用报告质粒启动子上的特定DNA结合位点如每块面板顶部所示。转染48 h后检测荧光素酶报告活性。在适当的结合位点存在下，JunD（A）和Gal4-VP16（C）显著增加了报告活性，表明转录激活。如果hSlug的结合位点不存在（A和C），添加hSlug-不会抑制转录。在SBS存在下，hSlug通过JunD和Gal4-VP16（B和D）抑制激活的转录。此外，hSlug（B和D）也显著抑制了基础转录。图E显示融合构建体，hSlug N末端与Gal4-DBD融合，抑制基础转录。报告者含有Gal4结合位点，仅Gal4 DBD即可适度激活。因此，hSlug融合对结合位点的占领将活性降低到比基础水平低得多的水平，表明活性抑制。
图4
图4
hSlug对基础转录和活化转录的抑制。用不同的表达质粒和报告质粒组合转染人293T细胞。所用报告质粒启动子上的特定DNA结合位点如每块面板顶部所示。转染48 h后检测荧光素酶报告活性。在适当的结合位点存在下，JunD（A）和Gal4-VP16（C）显著增加了报告活性，表明转录激活。如果hSlug的结合位点不存在（A和C），添加hSlug-不会抑制转录。在SBS存在下，hSlug通过JunD和Gal4-VP16（B和D）抑制激活的转录。此外，hSlug（B和D）也显著抑制了基础转录。图E显示融合结构，即hSlug N末端与Gal4 DBD融合，抑制了基底转录。报告者含有Gal4结合位点，仅Gal4 DBD即可适度激活。因此，hSlug融合对结合位点的占领将活性降低到比基础水平低得多的水平，表明活性抑制。
图5
图5
hSlug的N末端包含抑制和激活模块。使用M1和M2构建物和含有SBS的报告基因进行的转染试验表明，hSlug的N或C末端均未改变报告基因的活性。然后将hSlug的N末端的不同部分与Gal4 DBD（A）融合在框架中。这些构建物与包含四个Gal4结合位点（用于hSlug-Gal4阻遏）和七个AP1结合位点（对于JunD激活）的荧光素酶报告子共转染（B）。N端hSlug-Gal4 DBD融合（M3）有效抑制活化，证明N端存在抑制域。序列缺失表明，前32个氨基酸包含最强大的抑制域。该域在中央激活域（aa 33至94）上占主导地位。从aa 95到129的区域包含一个抑制的辅助结构域（将M3和M4与M14和M15进行比较），因为结构体M14表现出最佳的抑制活性。但是，此帮助域不足以覆盖中心域（M8）的激活。全长hSlug、M1和M2转染了另一个含有SBS靶点的报告子。
图6
图6
hSlug阻遏受HDAC抑制剂的影响。如图所示，将培养细胞与表达质粒共转染。报告质粒包含两种蛋白表达质粒的相应结合位点。转染24小时后加入HDAC抑制剂TSA；24小时后收获细胞。二甲基亚砜溶剂（−TSA）的存在并没有导致任何抑制的缓解。TSA的加入可以在一定程度上提高基础转录和激活转录，表明转录有一定的非特异性增加。然而，添加TSA后，hSlug介导的抑制作用得到了更显著的缓解（A组为5倍对2倍；B组为18倍对5倍）。这些提示HDAC可能介导hSlug的部分阻遏功能。
图7
图7
用SC-35结构域对hSlug进行染色。对产生的抗hSlug抗体进行亲和纯化并用于免疫荧光染色。hSlug主要在HeLa细胞（A至J）以及其他测试细胞类型中呈核和点状染色（数据未显示）。此外，转染293T细胞（K和L）的hSlug-HA融合蛋白也呈现点状核染色。同时进行抗SC-35（A至C）、抗PML（E至G）和抗胆红素（H至J）抗体的双重染色。PML病灶较少，且模式与hSlug不重叠（PML染色由面板F和G中的箭头指示）。SC-35的类似双重染色显示，这两种模式广泛重叠（面板A至C中的箭头显示了两个示例）。卷曲体也包含剪接因子，但用卷取蛋白双重染色显示，hSlug和卷取蛋白不会共定位（卷取蛋白染色用方框I和J中的箭头表示）。所有面板均为共焦显微镜获得的图像。
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