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单元格元数据。作者手稿；将于2020年12月3日在PMC上市。
以最终编辑形式发布为：
单元格元数据。2019年12月3日；30（6）:1152-1170.e13。
2019年11月14日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.cmet.2019.10.007
预防性维修识别码：PMC7185476号
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院1576950
PMID：31735592

选择性过硫化物检测显示S公司-硫水合物

贾斯米娜·齐瓦诺维奇,1,2,14 艾米莉亚·库鲁西斯,1,2,14 约书亚·B.科尔,三 比卡什·阿迪卡里,1,2 比尔贾纳·布沙克,1,2 索尼娅·肖特·鲁克斯,1,2 杜尼娅·彼得罗维奇,1,2 Jan Lj公司。米利科维奇,1,2,16 丹尼尔·托马斯·洛佩兹,4 Youngeun Jung（荣智健）,5 马尔科·米勒,6 莎拉·米切尔,7 米洛舍维奇,6 何塞·爱德华多·戈麦斯,1,2 莫兰·本哈尔,8 布鲁诺·冈萨雷斯-佐恩,4 伊万娜·伊万诺维奇-伯马佐维奇,9 罗伯塔·托雷格罗萨,10 詹姆斯·米切尔,7 马修·怀特曼,10 格恩特·施瓦兹,三 所罗门·H·斯奈德,11,12,13 宾杜·D·保罗,11 凯特·S·卡罗尔,5和米洛斯·菲利波维奇1,2,15,*
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摘要

地球上的生命在亿万年前出现在富含硫化氢的环境中，并伴随着H介导的蛋白质过硫化2S演变为一种信号机制。蛋白质过硫化(S公司-硫水合）是活性半胱氨酸残基的翻译后修饰，可调节蛋白质结构和/或功能。过硫化物由于其反应性和与半胱氨酸的相似性，很难标记和研究。在这里，我们报告了一种简单的策略，即使用基于十溴酮的探针进行化学选择性过硫化物生物偶联，以实现广泛实用的生物样品中的高选择性、快速和稳健的过硫化物标记。使用这种方法，我们表明过硫化是一种进化上保守的修饰，细胞利用过硫化波来分解磺酰化并防止不可逆半胱氨酸过氧化保护蛋白质功能。我们报告了一种与年龄相关的过硫化下降，这种下降在进化边界上是保守的。因此，通过饮食或药物干预来增加过硫化与延长寿命和提高应对应激刺激的能力有关。

关键词：硫化氢、蛋白质过硫化、过氧化氢、磺酰化、磺酰基化、磺化、氧化还原信号、老化、热量限制

简介

尽管一个多世纪以来一直被认为是有毒气体，但硫化氢（H2S） 是地球上出现生命所需的基本成分之一(Patel等人，2015年). 早期厌氧菌在H2富S环境，甚至使用H2S代替水用于第一个光合作用过程(Filipovic等人，2018年;王，2012). 20年前H2S作为细胞产生的重要信号分子重新融合(Filipovic等人，2018年;Paul和Snyder，2012年;萨博，2007年;王，2012). H基因缺失2产硫酶胱硫醚γ裂解酶（CSE）可导致高血压(Yang等人，2008). 接触H的动物2S进入暂停的类似动画的状态(黑石，2005)而饮食限制诱导的应激抵抗力和寿命延长依赖于细胞内H2S生产(Hine等人，2015年). 尽管H的有益作用2S、 在过多的病理状态下观察到(Filipovic等人，2018年;Paul和Snyder，2012年;萨博，2007年)，这些影响的机制仍然缺乏特征。然而，它在半胱氨酸残基（称为蛋白质）的氧化翻译后修饰（oxPTM）中的作用S公司-硫水合或过硫化被认为是其主要的有益作用机制之一(保罗和斯奈德，2015年).

半胱氨酸是一种罕见的氨基酸残基，经常出现在蛋白质的功能位点中，代表蛋白质功能的氧化还原控制位点(Marino和Gladyshev，2010年;Paulsen和Carroll，2013年). 例如，过氧化氢（H2O（运行）2)信号通过半胱氨酸残基氧化为硫酸（PSOH），而一氧化氮信号的一部分可以用半胱氨酸来解释S公司-亚硝化作用(Foster等人，2009年;Paulsen和Carroll，2013年). 多种化学方法已被用于标记和研究半胱氨酸修饰，导致了广泛的基础和应用进展(Furdui和Poole，2014年;Paulsen和Carroll，2013年). 然而，过硫化蛋白（PSSH）及其在细胞信号传导中的作用仍然没有得到充分研究，因为PSSH具有很强的反应性，其反应性与半胱氨酸残基相似(Cuevasanta等人，2015年;Filipovic等人，2018年;潘和卡罗尔，2013年). 因此，这使得设计选择性标记工具变得困难，阻碍了对这种特定oxPTM功能的更好理解。目前的方法依赖于用亲电试剂封闭硫醇和过硫化物，然后用还原剂释放后者，但这种方法与许多警告有关(Dóka等人，2016年;Filipovic等人，2018年;Reisz等人，2013年).

然而，由于其亲核性增强，过硫化物容易与活性氧物种（ROS）反应，而H2S本身就是一个可怜的ROS清除剂(Cuevasanta等人，2015年;Filipovic等人，2018年;Ono等人，2014年). 鉴于ROS在信号传递中起着重要作用(2007年杜特雷和托莱达诺;芬克尔，2011年)和老化(芬克尔和霍尔布鲁克，2000年)，很容易推测H的一般有益作用2S是进化保守的，通过蛋白质过硫化传递。

为了更好地理解过硫化体内，我们探索了一种现象，即如果首先转化为混合芳香二硫化物，蛋白质过硫化物可以被某些亲核试剂选择性标记。在这里，我们报道了一种新的、基于二甲基酮的方法的开发，该方法可以实现来自广泛来源材料的蛋白质的化学选择性过硫化物生物结合在体外和体内使用这种新方法，我们报告过硫化在基于过氧化氢的信号转导中起着不可或缺的作用。我们还发现，蛋白质过硫化随着年龄的增长而减少，并通过跨越进化边界延长寿命的干预措施来维持，因此可能发挥以前未被认识到的防止衰老的保护作用。

结果

dimedone开关方法的发展

为了能够使用亲核取代标记过硫化物，需要首先将PSSH转化为混合二硫化物(Wedmann等人，2016年;Zhang等人，2014年)这样，S-S键中的一个硫具有更高的亲电性(图S1A). 尽管它们在硫酸标记中具有选择性(Klomsiri等人，2010年;Paulsen和Carroll，2013年;Yang等人，2014年)，基于二聚酮的探针(图1A)可能是第二步的优秀候选人，成为亲核分子。它们是另外有吸引力的候选者，因为有过多的这些探针具有不同的报告部分，并且已经过彻底的测试(Furdui和Poole，2014年;Paulsen和Carroll，2013年). 然而，对于用于PSSH标记的基于二甲基萘的探针，初始步骤需要使用一种试剂，该试剂不仅能与PSSH和硫醇反应，而且还能阻断含硫酸。4-氯-7-硝基苯并呋喃（NBF-Cl）符合这些标准。它被用作阻断和检测硫醇、胺和磺酸的工具(Bernal-Perez等人，2012年;埃利斯和普尔，1997年)在与PSSH反应时应形成混合二硫化物(图1B). 我们通过监测低分子量过硫化物的标记来启动我们的研究，N个-甲氧羰基青霉胺过硫化物（nmc-PSSH(阿尔托和加勒登，2014年)) (图1C). Nmc-PSSH容易与NBF-Cl反应，导致412 nm处的特征吸光度最大值(图1D). 接下来，添加等摩尔量的dimedone导致412 nm峰快速消失，表明确实发生了转换(图1E). 反应混合物的ESI-TOF MS/MS分析证实，两种主要产物是NBF-SH和标记为nmc-PSSH的双酮(图1C,图S1B–F类).

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探索过硫化物标签的dimedone开关策略。

（A）（上）用二甲酮标记亚硫酸。（下）基于二聚酮的探针的结构。

（B）提议的dimedone过硫化物标签切换策略。在第一步中，蛋白质与4-氯-7-硝基苯并呋喃（NBF-Cl）反应，标记过硫化物、硫醇、亚硫酸和氨基。与氨基反应产生特征性的绿色荧光。在第二步中，NBF标签由一个基于十氟酮的探针进行切换，选择性标记过硫化物。

（C）与100μM N-甲氧羰基青霉胺过硫化物（nmc-PSSH）和100μM NBF-Cl的模型切换反应，然后是500μM二甲酮。MS分析显示4-硫代-7-硝基苯并呋喃（535 nm）和dimedone标记的nmc-青霉胺形成，在MS/MS条件下，其沿蓝色或红色虚线分解。括号中给出的数字表示已计算米/z观察到的离子。

（D）100μM nmc-PSSH与100μM NBF-Cl（pH 7.4，23°C）反应的时间分辨光谱。箭头显示NBF-Cl消失，nmc-PSS-NBF加合物在412 nm处出现。

（E）向反应混合物中添加200μM dimedone后的时间分辨光谱变化，如(D类)（pH 7.4，23°C）。插图：添加替米酮后412 nm最大吸光度衰减动力学。

（F-G)将23μM HSA-SSH与100μM NBF-Cl在磷酸盐缓冲液（50 mM，pH 7.4）中与1%十二烷基硫酸钠在37°C下反应30分钟，然后添加200μM地美酮。UV-Vis光谱变化(F类)和动力学痕迹(G公司)显示了422nm吸光度的衰减和535nm峰值的出现。

然后，我们以人血清白蛋白（HSA）为模型评估了dimedone开关法的选择性(Cuevasanta等人，2015年). HSA含有17个二硫化物和1个游离硫醇，因此它既是一种良好的控制手段，也是一种含有氧化半胱氨酸的蛋白质的例子。HSA-SH及其磺酰化（HSA-SOH）和过硫化（HSA-SSH）形式与NBF-Cl反应，生成具有不同最大吸光度的产品，与文献报道的产品非常吻合(埃利斯和普尔，1997年) (图S1G,我,K（K）). 随后添加dimedone仅导致HSA-SSH示例中的标记切换(图1F,​、G、，G公司,图S1H,J型)导致HSA-SS-NBF吸光度损失，并形成HSA-S-dimedone和NBF-SH产品。电泳分离处理过的样品，然后用抗dimedone抗体进行免疫印迹(Seo和Carroll，2009年)仅为HSA-SSH发出正信号(图2A). 为了确认天然过硫化物的标记，我们使用硫代硫酸盐硫转移酶（TST，也称为铑）作为模型，该酶在催化循环期间形成过硫化物(Filipovic等人，2018年). 抗dimedone抗体免疫印迹法(图2B)和ESI-TOF-MS(图2C)显示TST标有dimedone。

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蛋白质过硫化物的标记和鉴定。

(A至B)二甲基酮开关法对蛋白质过硫化物的选择性。人血清白蛋白（HSA，一)和TST(B）被用作模型。用兔抗Dimedone多克隆抗体进行dimedon标记。Ponceau S染色用于蛋白质负荷。

（C）解卷积质谱20μM铑（黑色）、用100μM NBF-Cl处理过的铑（蓝色）和先用100μM NBF-Cl-处理过的罗德（红色）。

（D）细胞PSSH水平的凝胶内检测。在添加或不添加10 mM NBF-Cl的情况下对HeLa细胞进行裂解，并在添加或未添加DAz-2的情况下探索过硫化物标记，然后使用CuAAC对Cy5-炔烃进行标记。凝胶也用考马斯亮蓝染色。火灾假彩色被用来在视觉上增强信号。绿色荧光对应于总蛋白质负荷（NBF-蛋白质加合物）。

（E）MEF细胞用或不用20 mM NBF-Cl样品进行裂解，然后用或不使用20 mM DTT进行处理，并使用CuAAC标记DAz-2/Cy5-炔烃。

(F-G公司)不同H处理的HeLa细胞蛋白质过硫化水平2S供体：200μM Na2S（高2S） 持续45分钟，200μM GYY4137持续2小时，200 nM AP39持续2小时，2 mM D-半胱氨酸（D-Cys）持续1小时。Cy5/488信号的比率用于定量(G公司). 数据显示为3个单独实验的平均值±标准偏差。**与对照组相比，p<0.01。

(H（H）)用于红细胞内源性过硫化蛋白质组分析的方案的示意图。

有了这些数据，我们设想dimedone开关方法可以将各种有效载荷安装到感兴趣的蛋白质上，从而实现特定的识别/可视化。我们首先使用了DCP-Bio1，一种生物素化的双烯酮(图1A). HSA和GAPDH的过硫化物呈阳性染色(图S2A,B类)Cy5-streptavidin检测到。用链霉亲和素磁珠分离样品，然后在凝胶内检测NBF-Cl标记氨基的绿色荧光(图1B)显示了PSSH的选择性标记，但没有显示其他oxPTM(图S2A,B类).

接下来，我们测试了该方法是否可以用于蛋白质组分析。TST过硫化物用DCP-Bio1标记开关，并进行胰蛋白酶或糜蛋白酶消化。MS/MS序列覆盖率为结构的95%(图S2C,支持数据集S1,S2系列)只有C248，在酶的活性部位以过硫化物的形式存在，被发现被DCP-Bio1标记(图S2C). 其他半胱氨酸残基和几个赖氨酸残基仅用NBF标记(支持数据S1,S2系列)，根据中的反应方案图1B.

我们还测试了通过铜（I）催化叠氮烷基环加成（CuAAC，点击化学）安装Cy5-荧光部分直接在凝胶中检测PSSH的可能性。除了标记半胱氨酸外，NBF-Cl还与氨基反应，产生特征荧光λ前任488 nm(Bernal-Perez等人，2012年). 将市售TST（已部分以过硫化物形式存在）与硫代硫酸盐（TS）或二硫苏糖醇（DTT）孵育，以分别形成完全过硫或还原TST。将20μM还原或过硫化TST与50μM NBF-Cl混合，并使用DAz-2/Cy5 CuAAC可视化过硫化物。一方面，虽然两者都未经治疗（1号车道，图S2D)和硫代硫酸盐处理（车道3，图S2D)TST显示Cy5信号，尽管负载相同，但完全过硫化酶的绿色荧光信号显著降低。另一方面，完全还原酶的绿色荧光信号更强（通道2，图S2D)这表明，在低NBF-Cl/蛋白质比率下，基于维度的探针引起的转换可能会影响绿色荧光的强度(图S2D)，所以我们选择使用至少10倍的NBF-Cl(图S2E). 过量使用NBF-Cl还提供了使用绿色荧光作为总蛋白质负荷测量的机会，因此可以通过测量Cy5/488荧光信号比来量化过硫化水平。点击化学的不同成分在被NBF-Cl堵塞的样品中没有引起任何非特定标签(图S2F).

为了能够标记细胞提取物，我们必须确保该方法显示出足够的选择性。之前已经证明了dimedone探针对亚硫酸的选择性，并且与二硫化物没有交叉反应，S公司-可以观察到亚硝基硫醇、HNE修饰的半胱氨酸或任何其他亲核中心(Charles等人，2007年;Klomsiri等人，2010年;Yang等人，2014年). 事实上，对dimedone的非靶点进行盲目蛋白质组学搜索并没有发现任何不需要的标记(Yang等人，2014年). 然而，在十元开关标记中，（i）NBF-Cl对亚硫酸的不完全阻断和（ii）磺胺的潜在干扰可能代表可能的警告(图S2G).

为了确保有效和选择性标记，我们决定在变性条件下进行细胞裂解，这将允许所有半胱氨酸和胺残基快速展开并暴露于NBF-Cl。大量过量的NBF-Cl和37°C培养应为快速和完整标记和阻断提供有效的动力学推动。蛋白质的去折叠也会使环磺胺暴露于更多的水，因为它们与硫酸处于平衡状态，所以这种平衡将转向硫酸(Gupta和Carroll，2016年). 此外，NBF-Cl已被证明能与环亚砜酰胺有效反应(图S2G) (Gupta和Carroll，2016年). 尽管如此，我们还是使用了蛋白质酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）作为模型系统，PTP1B形成稳定的环亚砜酰胺(Paulsen和Carroll，2013年). 经H处理的PTP1B2O（运行）2（形成亚硫酸和环状亚砜酰胺的混合物）用DAz-2（具有双正交叠氮化合物基团）标记，然后如预期的那样通过CuAAC反应与Cy5-炔烃偶联，但如果它首先与NBF-Cl反应（通道1和2，图S2H). 然而，只有当PTP1B首先与NBF-Cl反应，然后与DAz-2/Cy5 CuAAC反应（车道3，图S2H). 当NBF-Cl步骤被省略时，标签缺失（通道4，图S2H).

在细胞裂解液中进一步证实了该方法的选择性。用NBF-Cl裂解HeLa细胞，用DAz-2/Cy5 CuAAC切换标签，只有在使用所有试剂时，才能标记和凝胶内检测到红色荧光信号(图2D,图S2I). 在缺少NBF-Cl的对照样品中几乎检测不到任何信号(图2D)，确认裂解、孵育和蛋白质沉淀(图S2I)已经足以去除可能未被NBF-Cl覆盖的活性亚磺酸和环状亚磺酰胺。我们发现，用5mM NBF-Cl裂解已经足以产生最大的过硫化物信号(图S2J). 用DTT处理细胞裂解液，以减少NBF-Cl与过硫化蛋白反应中形成的二硫键，消除检测到的Cy5荧光(图2E)，确认了中提出的dimedone开关方法的化学机制图1B.用dimedone溶解以捕集所有含硫酸(图S2K)然后用NBF-Cl和DCP-Bio1标记(图S2L)或DAz-2/Cy5 CuAAC(图S2M)为了切换标签过硫化物，显示了在过硫化物标记之前去除亚硫酸不会影响检测到的信号，进一步证实了我们的dimedone切换方法与亚硫酸和/或环亚砜酰胺没有交叉反应(图S2K–M（M）). 此外，用不同来源的H处理HeLa细胞2S使细胞内过硫化水平增加了几倍(图2F,​，G）。G公司). 200 nM线粒体靶向H2S供体AP39诱导了与200μM Na相当的增加2S、 证实该化合物具有强大的药理潜力(图2F,​，GG公司).

我们使用DCP-Bio1作为开关标签来鉴定人类红细胞中内源性过硫蛋白(图2H,表S1). 在56种已鉴定的蛋白质中，超过一半的蛋白质先前被鉴定带有氧化的半胱氨酸残基。在缺乏血红蛋白的红细胞（RBC）中，这些蛋白质容易被半胱氨酸氧化(Delobel等人，2016年)或用二胺处理(Zaccarin等人，2014年)，在过氧化物酶原II缺陷小鼠的红细胞中(Yang等人，2012年)或被发现直接过硫(瓦伦丁等人，1987年). 更重要的是，这两种酶都参与H2红细胞中硫的生成也被发现是过硫的：3-巯基丙酮酸硫转移酶（MPST或MST）和甲硫醇氧化酶。已知前者在催化循环中形成过硫化物(Yadav等人，2013年)而后者同时产生H2O（运行）2和H2S公司(Pol等人，2018年)，促进半胱氨酸残基首先氧化为硫酸，然后形成过硫化物。此外，过氧化物酶原在催化循环中会形成一种硫酸(Wood等人，2003年)，也被发现过硫。还值得注意的是，所有确定的肽，甚至那些不在选择标准范围内的肽（至少2个可靠肽和−10logP>50），都来自含半胱氨酸的蛋白质，表明这种方法具有很高的选择性。

过硫化在进化上是保守的，并由H控制2转硫途径产生S与半胱氨酸分解代谢

虽然初步研究表明细胞内过硫化物的主要来源是氢2S、 主要由CSE生产(图3A) (Filipovic等人，2018年;穆斯塔法等人，2009年;Paul和Snyder，2012年)最近的研究结果质疑了这一点，声称过硫化物是在蛋白质翻译过程中合成的，与转运途径或半胱氨酸分解代谢无关(图3A) (Akaike等人，2017年). 来自CSE的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的过硫化水平显著降低−/−动物(图3B). 有趣的是，由于胱硫醚-β-合酶（CBS，图S3A,B类). 亨廷顿病（HD）是一种神经退行性疾病，由亨廷顿蛋白中多聚谷氨酰胺重复序列的扩增引发，CSE在HD中显著降低(Paul等人，2014年). HD纹状体细胞系模型（STHdh公司第7季度/第7季度和ST卫生部2011年第11季度/2011年第1季度)由于含有7个和111个聚谷氨酰胺重复序列，我们现在表明，CSE的缺乏导致ST中几乎检测不到的PSSH水平卫生部2011年第11季度/2011年第1季度单元格(图3C). 众所周知，CSE是H的主要来源2此单元格类型中的S(Paul等人，2014年;Sbodio等人，2016年). 此外，胱氨酸转运体系统x的抑制c（c）−用橡皮素也会导致蛋白质过硫化的损失(图3D). 此外，高尔基体应激源莫能菌素通过药物诱导CSE过度表达(Sbodio等人，2018年)另一方面，导致细胞内过硫化的增加(图3E).

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细胞内过硫化在进化上是由H保守和控制的2S产生酶。

（A）细胞内H2半胱氨酸γ裂解酶（CSE）和半胱氨酸β合成酶（CBS）催化硫的生成，通过通过半胱氨酸分解代谢途径中的3-巯基丙酮酸硫转移酶（MPST）。Hcy：同型半胱氨酸；半胱氨酸：半胱氨酸；3MP:3-巯基丙酮酸；CAT：半胱氨酸转氨酶；DAO：D-氨基酸氧化酶。

（B）野生型（WT）和CSE MEF细胞中的PSSH水平−/−老鼠。Cy5/488信号的比率用于量化。n=4.**p<0.01 vs.WT。数据显示为平均值±标准偏差。插图：CSE水平的Western blot分析。n=3。

（C）ST中的PSSH水平卫生部第7季度/第7季度和ST卫生部2011年第11季度/2011年第1季度细胞。n=4。**与Q7相比，p<0.01。插图：CSE蛋白表达水平的代表性蛋白质印迹。n=3。

（D）1和10μM Erastin（18.5小时）对WT MEF细胞中PSSH水平的影响。n=4.**与对照组相比，p<0.01。

（E）对照组（C）和用1μM莫能菌素（Mone）处理的WT MEF细胞中的PSSH水平（18小时）。n=3.**与对照组相比，p<0.01。插图：CSE蛋白表达水平的代表性Western blot。n=3。

（F）PSSH水平大肠杆菌没有（WT）或带有phsABC操纵子（pSB74质粒），该操纵子编码硫代硫酸盐还原酶并导致H2S生产。两株菌株均用或不用硫代硫酸盐处理（TS，37°C下4小时）。n=3.*与对照组相比，p<0.05，**p<0.01。

（G）野生型PSSH水平（N2），cth-1型和mpst-3秀丽隐杆线虫突变体。~每个样本16000条蠕虫。Cy5/488信号的比率用于量化。n=3.**与对照组相比p＜0.01。

（H）野生型PSSH水平(年1w个118)黑腹果蝇以及CSE过度表达水平不同的苍蝇。每个样品3-4只苍蝇。n=3.*与WT相比，p<0.05，**p<0.01。

（一）野生型（C57BL/6J）和CSE肾脏提取物中的PSSH水平−/−老鼠。n=3只动物。**与WT相比，p<0.01。

（J）健康人体供体红细胞膜和细胞液中的蛋白质过硫化。

（K）WT和CSE细胞内过硫化蛋白水平的共焦显微镜图像−/−MEF是否经过200μM Na处理2S（高2S） 或2 mM D-Cys持续1小时。Cy5信号对应于过硫化蛋白，488 nm信号对应于NBF加合物。细胞核DAPI染色。比例尺20μm。

（左）类似抗体微阵列的方法来研究特定蛋白质的过硫化状态。所列十种蛋白质的方法示意图（下部）和实际读数（上部）。WT、CSE的细胞裂解物−/−比较用D-Cys（2 mM，1小时）处理的WT MEF。结果显示为3个独立实验的平均值±SD。

（米）人类MnSOD（PDB:1pl4）两个亚基的带状结构，突出半胱氨酸残基和含锰活性位点。

（N）过硫化MnSOD保护其免受H2O（运行）2-诱导失活。用细胞色素c作为报告分子来测量SOD活性，细胞色素c被黄嘌呤/黄嘌呤-氧化物系统产生的超氧物还原。结果显示为3个独立实验的平均值±标准偏差。

我们将筛选范围扩大到不同的门和regna，发现在所有门和rega中，内源性过硫化都由H控制2通过转硫途径或半胱氨酸分解代谢产生的S(图3A). 我们使用了大肠杆菌用编码硫代硫酸盐还原酶的phsABC操纵子（pSB74质粒）转化的菌株，导致H增加2S生产。与对照组相比，用硫代硫酸盐处理这些细菌导致细菌蛋白质过硫化增加两倍(图3F). 另一方面，cth-1型和最大功率标准-3的突变体秀丽线虫（分别缺少CSE和MPST，图3G)PSSH水平较低。黑腹果蝇苍蝇过度表达CSE(Snijder等人，2015年)显示PSSH水平增加(图3H)，而CSE的肾脏−/−小鼠的过硫水平降低(图3I). 最后，在人红细胞的膜和细胞质中都可以观察到内源性过硫化，证实了蛋白质组数据(图3J,表S1).

dimedone开关方法也成功应用于共焦显微镜下细胞内过硫化物的可视化(图3K,图S3C). 缺乏CSE的MEF几乎没有检测到细胞内PSSH水平，而2S和D-半胱氨酸处理使这些水平增加了几倍。独立于CSE，两个H来源2S提高了PSSH水平，强调了H的重要作用2蛋白质过硫化物形成中的硫(图3K,图S3C). 此外，宽场荧光反褶积显微镜首次提供了细胞内过硫化的高分辨率图像(图S3D–F类). PSSH信号散布在整个细胞中，甚至在细胞核中也能观察到一些信号。半胱氨酸处理细胞中的PSSH信号似乎主要定位于线粒体，这与D-半胱氨酸是半胱氨酸通过MPST分解代谢途径的底物这一事实一致(涉谷等，2013) (图S3F).

dimedone开关方法的广泛适用性：抗体微阵列

为了进一步展示dimedone开关方法的适用性，我们使用了抗体微阵列样方法，将特定蛋白的抗体固定在NHS激活的表面上(图3L). 由于样品同时具有绿色和红色荧光，分别反映总负荷和PSSH水平，因此可以用这种方法分析感兴趣的蛋白质，并评估其PSSH含量。我们选择了针对一系列蛋白质的抗体(图3L)已显示过硫化，或在其催化循环中形成过硫化物。总的来说，CSE的缺乏降低了靶蛋白的PSSH水平，而D-半胱氨酸处理增加了PSSH，尽管效率不同。该方法的选择性再次得到证明，据报道，酶在H2硫氧化，如硫化物：醌氧化还原酶（SQOR或SQR）和TST，在进一步的D-半胱氨酸处理后显示出较高的内源性PSSH水平，变化最小。然而，在缺乏CSE的细胞中观察到这些酶的稳态过硫化物水平显著降低。除了已经证明过硫化的蛋白质外（GAPDH、HSP70、Keap 1、β-actin、Parkin）(穆斯塔法等人，2009年;Vandiver等人，2013年;Yang等人，2013;Zhang等人，2014年)这种方法可以观察到锰超氧化物歧化酶（MnSOD）也可以被过硫(图3L). 与原核生物不同，大多数真核生物MnSOD至少有一个半胱氨酸残基(图3M,图S3G)并表现出H对产品的强烈抑制作用2O（运行）2(Hearn等人，2001年). 我们对人重组MnSOD的实验表明，在15分钟内暴露于3倍过量的H2O（运行）2，抑制MnSOD活性（0.15±0.06×10三U/mg vs.2.91±0.07×10三对照组U/mg），而联合治疗时H过量5倍2S挽救了酶活性（1.92±0.07×10三单位/毫克）(图3N). H处理人重组MnSOD的MS/MS分析2O（运行）2和H2S和dimedone开关法标记（使用DCP-Bio1作为开关剂）证实C193确实过硫(图S3H,我,数据集S3,S4系列). 其他研究指出，相同的半胱氨酸残基对氧化还原敏感(Matsuda等人，1990年). 此外，与对照组（15±4%/亚单位）相比，过硫化的MnSOD对过氧亚硝酸盐引起的酪氨酸硝化反应更具弹性（每亚单位硝化反应的产率为3±2%(Szabó等人，2007年).

过硫化与H有内在联系2O（运行）2

对于H2为了能够修饰半胱氨酸残基，需要一种氧化剂——H可以发挥这种作用2O（运行）2.蛋白质亚磺酰化，作为H的结果2O（运行）2生产，代表一个重要的信号事件(Paulsen和Carroll，2013年;Poole等人，2004年). 然而，应控制PSOH的形成，以防止半胱氨酸残基过度氧化为亚硫酸盐（PSO2H） 和磺酸（PSO三H） 导致蛋白质功能丧失(图4A). 先前的研究表明，蛋白PSOH与H的反应速度快两个数量级2S、 与pH值为7.4的谷胱甘肽相比(Cuevasanta等人，2015年)我们对红细胞中过硫化蛋白的蛋白质组学分析表明，与已知的磺酰化蛋白有显著重叠(表S1). 我们假设H的反应2带有PSOH的S可以代表H的组成部分2O（运行）2-诱导氧化还原信号和将PSOH还原为硫醇的主要途径。为了测试这一点，我们首先暴露了CSE+/+野生型（WT）和CSE−/−MEF至H2O（运行）2100μM H时2O（运行）2未诱导WT细胞中PSOH水平的明显增加，CSE中检测到磺酰化的大量增加−/−随着暴露时间的增加而减少(图4B). 500微米高2O（运行）2需要在WT细胞中产生相同数量的PSOH(图4B). 这种作用可以通过用100μM H预孵育细胞而完全消除2S捐赠者，GYY4137(图S4A). 相反，当用100和500μM H处理时，WT细胞中的PSSH水平随时间而增加2O（运行）2但在CSE中仍然很低−/−单元格(图4C). 亚硫酸选择性探针（PSO）的研究进展2H）(Akter等人，2018年)使我们能够测试缺乏内源性H的细胞中亚磺化的变化2在CSE中观察到亚磺化反应的总体强烈增加−/−100μM H处理的细胞2O（运行）215分钟，但这个PSO2H在30分钟后恢复正常，表明这些半胱氨酸要么被过氧化，要么被硫氧还蛋白还原(Akter等人，2018年) (图4D). 500微米高2O（运行）2仅对WT细胞中选定的一组蛋白质的亚磺化作用增加。CSE的磺化−/−细胞，由500μM H引起2O（运行）2，似乎略低于100μM剂量，可能是因为它们具有较高的敏感性，并且对磺酸的半胱氨酸氢氧化作用更强。

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内源性H2S控制H引起的半胱氨酸氧化2O（运行）2.

（A）H之间氧化还原转换的拟议机制2O（运行）2-诱导硫醇氧化和过硫化。

（B-D）WT和CSE中的半胱氨酸oxPTM水平−/−100或500μM H处理的MEF细胞2O（运行）215分钟和30分钟。（B）蛋白质磺酰化（PSOH）（用DCP-Bio1标记，用链霉亲和素488可视化）。GAPDH被用作负荷控制。n=4。(C类)蛋白质过硫化（PSSH）（标记为DAz-2:Cy5作为切换剂）。Cy5/488信号的比率用于量化。n=3。(D类)蛋白质亚磺化（PSO2H） （用BioDiaAlk标记，用链霉亲和素Cy5可视化）。GAPDH被用作负荷控制。n=5。PSOH和PSSH值归一化为未处理细胞中的水平。**与未经处理的WT细胞相比，p<0.01；#与未经治疗的CSE相比，p<0.05−/−细胞。

（E）DJ-1的过硫化、亚磺酰化、亚磺酰基化和磺酰基化。WT和CSE−/−用100μM H处理MEF细胞2O（运行）215或30分钟，标记PSSH、PSOH和PSO2H、 用固定在琼脂糖珠上的抗DJ-1抗体进行免疫沉淀，用抗生物素抗体进行免疫印迹。用于磺化DJ-1（DJ-1-SO三H） ，使用DJ-1的C106磺酸抗体选择性。n=4.**p<0.01 vs.未经治疗的体重。#p<0.05，##p<0.01.vs.未治疗的CSE−/−细胞。

解决内源性H2S控制H2O（运行）2-在分子水平上诱导半胱氨酸氧化，我们监测氧化还原敏感蛋白DJ-1（也称为PARK7）中半胱氨酸的氧化状态。已知DJ-1中的C106会氧化为亚硫酸钠(Akter等人，2018年)甚至是磺酸(Fernandez-Caggiano等人，2016年)，而我们的蛋白质组学分析也将DJ-1确定为过硫化的靶标(支持表S1). WT和CSE−/−用100μM H处理MEF细胞2O（运行）2持续15分钟和30分钟，标记PSOH（使用DCP-Bio1）、PSSH（将DCP-Bio 1用作切换试剂）和PSO2H（使用BioDiaAlk）和免疫沉淀。同时，使用对DJ-1的C106磺酸有选择性的抗体，我们评估了DJ-1-SO三这些样品中的H水平(图4E,图S4B). H（H）2O（运行）2WT细胞的处理导致DJ-1的过硫化（在15和30分钟内）增加，磺酰化和磺酰化度（PSO）增加三H） 30分钟后。然而，在CSE中−/−在用H处理的细胞中，PSSH水平已经很低的细胞继续下降2O（运行）2DJ-1-SOH、DJ-1-SO的基本水平2H和DJ-1-SO三未经治疗的CSE的H值要高得多−/−与WT相比，DJ-1-SOH随H降低2O（运行）2CSE治疗−/−电池，DJ-1-SO2H和DJ-1-SO三H水平继续增加(图4E,图S4B)确认缺少H2S捕捉PSOH会导致半胱氨酸过氧化。综合这些数据，证实过硫化由内源性H控制2S生产，是H不可或缺的一部分2O（运行）2-诱导蛋白质的氧化还原变化。

PSSH波随PSOH形成：对RTK-H的影响2O（运行）2信号

受体酪氨酸激酶（RTK）激活最能说明PSOH信号的重要性(芬克尔，2011年;Paulsen等人，2011年;Sundaresan等人，1995年)因此，我们寻找PSOH和PSSH之间的时间相关性(图5A). 用100 ng/ml上皮生长因子（EGF）处理的HeLa细胞，在最初的5-15分钟内，PSOH急剧上升，30分钟后降至基础值(图5B). 然而，PSSH水平遵循相移曲线，水平最初在5分钟时下降，然后在30分钟时达到最大值(图5B). 这与所有三个H的表达增加密切相关2含EGF的产S酶(图S4C).

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RTK信号中的蛋白质过硫化波。

（A）表皮生长因子受体（EGFR）激活触发的信号事件示意图。Nox：NADPH氧化酶；AQP：水通道蛋白。

（B）用100 ng/mL EGF处理HeLa细胞5、15、30或60分钟后，分析蛋白质磺酰化（用DCP-Bio1标记，用链霉亲和素488显示，用β-微管蛋白作为负荷控制计算水平）和蛋白质过硫化（使用以Cy5为报告分子的二聚酮开关法，水平以Cy5/488荧光读数的比率计算）。（顶部）PSSH水平的In-gel荧光和PSOH水平的Western blot。（底部）暴露EGF后PSSH和PSOH的时间动态变化。n≥3。数值表示为平均值±标准偏差。**p<0.01与对照（0）。

（C）在EGF处理之前，用GYY4137（100μM）预处理30分钟，在HeLa细胞中，PSSH和PSOH随着EGF暴露时间的变化而变化。n≥3。数值表示为平均值±标准偏差。**p<0.01与对照组相比。

（D）在EGF治疗之前，用2 mM抑制剂、氨基氧乙酸（AOAA）和丙炔甘氨酸（PG）混合物（1:1，30分钟）预处理HeLa细胞中，PSSH和PSOH的定量随着EGF暴露时间的变化而变化。n≥3。数值表示为平均值±标准偏差。**p<0.01与对照组相比。

（E）量化HUVEC中PSSH和PSOH的变化，作为VEGF（40 ng/mL）暴露时间的函数。n≥3。数值表示为平均值±标准偏差。**p<0.01与对照组相比。

（F）不同胰岛素浓度对神经母细胞瘤（SHSY5Y）细胞PSSH水平的影响及其与胰岛素暴露时间的关系。n≥3。数值表示为平均值±标准偏差。**p<0.01与未经治疗相比，##p<0.01 100 nM对200 nM。

（G）用100 ng/mL EGF处理HeLa细胞30分钟后EGF受体过硫化，用抗体微阵列载玻片检测两种不同抗体。每种抗体均呈五倍体。进行了2次技术复制。数值表示为平均值±标准偏差。**p<0.01 vs.未经治疗（0）。

（H）EGF受体酪氨酸1068（Y1068）的时间依赖性磷酸化作为对EGF的反应。HeLa细胞在暴露于EGF（100 ng/mL）之前，用GYY4137（100μM）预处理2小时或不预处理。n=3.**p<0.01 GYY4137治疗组与未治疗组。

（一）用xCELLigence RTCA DP系统实时测量活细胞中EGF受体的激活。用GYY4137（100μM，30 min）或2 mM AOAA和PG的混合物（1:1，30分钟）预处理HeLa细胞。通过添加150 ng/mL EGF启动EGF受体激活。n=4。数值表示为平均值±标准偏差。**p<0.01与未经治疗的对照组相比。

（J）EGF信号传导中不同激酶过硫化的抗体微阵列分析。用100 ng/mL EGF处理HeLa细胞30分钟。每种抗体呈五倍体。进行了2次技术复制。

（K）与肌动蛋白重塑、细胞骨架调节和细胞运动有关的蛋白质靶点的示意图，发现在100 ng/mL EGF处理30分钟的细胞中，蛋白质靶点被过硫酸化。

为了证实PSOH和PSSH之间的相互作用，我们用GYY4137预处理HeLa细胞(图5C,图S4D)或混合CSE和CBS抑制剂（丙炔甘氨酸和氨基氧乙酸，图5D,图S4E)持续30分钟，分别增加或减少细胞内H2S和PSSH水平。GYY4137预处理确实诱导了PSSH的增加，在EGF刺激下，这些水平在30分钟内持续上升，而PSOH最初下降，并保持低水平不变(图5C,图S4D). 相反，内源性H的药理抑制2硫的生成导致PSOH水平急剧上升，在5分钟达到峰值，并在15分钟完全消除，这可能是由于半胱氨酸过度氧化，因为PSSH水平仍然很低且没有变化(图5D,图S4E). 这些结果强烈表明，过硫化是细胞通过磺酰化分解信号的固有机制。同时，由于这两种标记方法都使用了基于dimedone的探针（用于在切换代理中使用的PSSH），这些数据再次证实了dimedon切换方法可以区分PSSH和PSOH。

然后我们测试了其他RTK途径。用40 ng/ml的血管内皮生长因子（VEGF）处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后，PSOH和PSSH的相移曲线相似，其中PSOH在5 min时达到峰值，15 min后已恢复到基础水平，而PSSH在15 min时达到高峰，即使在30 min后也保持较高水平(图5E,图S4F). 在暴露于VEGF 15分钟的细胞中，PSSH增加了~9倍，这与高H值一致2这些细胞所具有的S生成速率(Filipovic等人，2018年;Lin等人，2013年). 用胰岛素治疗神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y），再次产生PSSH水平的明显峰值，峰值时间和变化强度与胰岛素剂量直接相关(图5F,图S4G). 暴露于100 ng/mL胰岛素2分钟后，观察到磺酰化的急剧峰值，随后出现过硫化波，在5分钟达到峰值(图5F,图S4G,H（H）). 当使用200 ng/mL时，检测到更大振幅的PSSH波，峰值时间为2分钟，可能是由于更强更快的H2O（运行）2较高胰岛素剂量产生的流量(图5F,图S4G). 细胞内磺酰化动力学以相移方式先于PSSH波(图S4H). 最后，我们使用了WT和CSE−/−MEF并用100 ng/ml EGF处理。WT中PSSH的时间分布与HeLa细胞中观察到的非常相似，并且在CSE中受到抑制−/−单元格(图S4I,J型). 另一方面，CSE中的磺酰化作用更强−/−单元格(图S4I,J型).

接下来，我们将注意力转向了解这些过硫化波的生物学相关性。EGF受体活化受磺酰化调节(Paulsen等人，2011年)因此，我们重点研究过硫化是否以及如何控制EGF信号的持续时间。我们首先使用市售的EGFR途径抗体微阵列板寻找EGFR的过硫化。两种不同EGFR抗体的五聚体显示，EGF处理HeLa细胞30分钟后，EGFR过硫化显著增加(图5G). EGFR的过硫化对下游信号传导具有功能性影响。半胱氨酸磺酰化激活的Y1068的磷酸化在GYY4137预处理的HeLa细胞中严重受损(图5H). 相应地，在活细胞中监测到的EGF受体的激活也显示了用CSE和CBS抑制剂（PG和AOAA）预处理的细胞中更强的受体激活，GYY4137预处理可以降低这种效应(图5I). 此外，H的抑制作用2即使在没有EGF刺激的情况下，增加EGFR磺基化半衰期的S生成也会导致细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化显著增加(图S4K).

许多对EGFR信号传导重要的含半胱氨酸的磷酸酶已经被证明是磺酰化的(Paulsen等人，2011年). 这对PTEN、PTP1B和SHPTP2尤其如此，我们现在发现它们也已实现(图S4L). 此外，使用EGFR通路抗体芯片，我们还评估了EGFR下游激酶的过硫化状态(图5J,数据集S5). 暴露于EGF后，许多蛋白质靶点的过硫化状态增加。有趣的是，除了肌动蛋白外，参与细胞骨架重排和细胞运动调节的激酶也受到特别影响(图5J,​、K、，K（K）,图S4M–R（右）). 综上所述，这些数据表明，蛋白质过硫化物的形成代表了控制H启动的细胞信号的氧化还原开关2O（运行）2和PSOH的形成。

蛋白质过硫化作为半胱氨酸过氧化的解救途径

虽然蛋白质磺酰化（甚至某些蛋白质的磺化）代表一种信号事件，但H的不可控生成2O（运行）2或者任何ROS都会导致半胱氨酸过度氧化和功能丧失(图6A). 我们最初的假设是，由于其尺寸小、扩散性强和生产流量大(Cuevasanta等人，2012年;Filipovic等人，2018年;维维茨基等人，2012年)，H2S可以作为细胞防御半胱氨酸过氧化的第一道防线(图6A). 形成的过硫化物比单独的半胱氨酸要好得多，并且可以清除(Cuevasanta等人，2015年)更多的有害氧化剂。由于它们的S-S键可还原，随后产生的S-硫胱氨酸应该很容易被二硫还原酶还原，例如硫氧还蛋白（Trx）(图6A)创造一条还原途径，将其再循环回硫醇形式。已经证明，色氨酸可以还原在3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐还原酶活性部位形成的S-硫胱氨酸(Palde和Carroll，2015年).

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蛋白质过硫化的细胞保护作用。

（A）蛋白质过硫化保护作用的拟议机制。Trx-硫氧还蛋白，TrxR-硫氧还原酶。

（B）的模型反应S公司-硫氰酸盐（SSC）与人硫氧还蛋白（hTrx）。

（C）10μM人重组Trx（黑色）和用10μM处理的Trx的去卷积MS光谱S公司-硫氰酸盐（SSC）（红色）。

（D）10μM C35S-Trx MS在与10μM SSC反应之前（黑色）和之后（红色）的反褶积，显示经SSC处理的样品中出现TrxS-S-Cys加合物。

（E）的绘图k个光突发事件 与。与人重组Trx反应的SSC浓度。通过测量因半胱氨酸氧化而在Trx中诱导的构象变化，对反应进行荧光测量。数值表示为平均值±标准偏差。n=3。

（F）H的毒性2O（运行）2WT和CSE−/−MEF公司。数值表示为平均值±标准偏差。n=3，**p<0.01，与对照组相比。

（G-H）使用碘化丙啶（FL2A通道）对细胞死亡进行流式细胞术分析。不同酿酒酵母菌株培养过夜，调整OD600=2，在没有或有10 mM和20 mM H的情况下生长27小时2O（运行）2左上象限用于测量死亡细胞。每次测量分析150000个细胞。n=2.**与同一组未经处理的细胞相比，p<0.01，##与BY4742细胞的相应治疗相比，p<0.01。

（I-J）N2的存活曲线，cth-1型和mpst-3秀丽隐杆线虫暴露于60 mM百草枯的菌株(我)和5 mM亚砷酸钠(J型). N> 80条蠕虫。实验一式三份。**与对照组相比，p<0.01。

（K）短期（3小时）预先暴露于GYY4137（500μM）或AP39（100 nM）对cth-1秀丽隐杆线虫用60 mM百草枯处理的突变体。N> 80条蠕虫。实验一式三份。**与对照组相比，p<0.01。

为了解决过硫化物氧化的可逆性，我们使用S-硫胱胺（SSC）作为模型系统(图6B). 如左向质量位移（Δ米/z=−2），对应于二硫键的形成(图6C). 当用相同量的SSC孵育具有催化活性的C32S突变体时，没有观察到光谱变化(图S5A); 当与C35S突变体孵育时，该突变体最初与底物反应，但不能完成催化循环，导致Trx与半胱氨酸的二硫加合物的特征(图6D,图S5B). 估计速率常数为6.1±0.2×104M（M）−1秒−1(图6E,S5C系列)比色氨酸与过硫化半胱氨酸反应高一个数量级，比色氨酰与胱氨酸反应高两个数量级(Wedmann等人，2016年). 与硫氧还蛋白还原酶（TrxR）结合，反应也比与胱氨酸结合更快(图S5D). 然而，硫氧还蛋白相关蛋白（TRP14）在切割SSC方面不如人类Trx有效(图S5E).

然后我们评估了不同生命系统的过硫化水平与它们抵抗压力的能力之间的关系。CSE公司−/−MEF生长较慢，对H更敏感2O（运行）2与WT电池相比(图6F);酿酒酵母事实证明也不例外。尽管半胱氨酸和H略有不同2S代谢(图S5F)，的酿酒酵母突变体Δcys3（CSE）显示生长迟缓(图S5G)PSSH和H较低2S级(图S5H,我). 该突变体还被发现对H更敏感2O（运行）2比野生型(图6G,​，H）。H（H）).Δcys4另一方面，（哥伦比亚广播公司）的H值略高2S和PSSH水平(图SH,我)被认为对H有更强的抵抗力2O（运行）2(图6H).

我们还测试了秀丽线虫不同的ROS诱导应激源。cth-1型（CSE）和mpst-3秀丽隐杆线虫突变体对百草枯的敏感性增强(图6I)约50%cth-1型动物在暴露后4小时内死亡（相比之下，约80%的动物在N2下存活）。另一种ROS应激源亚砷酸钠也被证明对cth-1型与N2相比的突变体(图6J). 增强的灵敏度cth-1型对百草枯和亚砷酸盐进行H预处理可以解救2S供体增加细胞内PSSH水平(图6K,图S5J,K（K）). 即使是N2在暴露于百草枯或亚砷酸盐后，仅用GYY4137或AP39预处理3小时，也显示出更好的存活率(图S5J,K（K）).

蛋白质过硫化随着老化而减少

随着老化，活性氧的产生和去除之间存在不平衡，导致氧化损伤增加(Balaban等人，2005年;芬克尔和霍尔布鲁克，2000年;利奥切夫，2013;Redman等人，2018年). 此外，两项独立的定量蛋白质组学研究发现秀丽线虫，CSE在老化过程中降低(Aging等人，2015年;Narayan等人，2016年). 在这里，我们测试了细胞内PSSH的保护池随年龄下降的假设，并与特定物种内个体的寿命相关。而cth-1秀丽隐杆线虫突变体的中位/最大寿命总体上没有显著缩短，它们最初的死亡率要高得多(图S6A).Mpst-3型突变体的PSSH库更低(图3G)，寿命明显缩短(图S6A). 此外，野生型N2蠕虫的过硫化水平从成年后第1天到第7天逐渐降低(图S6B). 为了证实这种现象的进化保守性，我们观察了1、3、6、12和24个月大的Wistar大鼠。在大脑提取物中，从6个月龄开始，观察到蛋白质过硫化水平降低，24个月龄大鼠的过硫化水平比1个月龄的大鼠低约50%(图7A). PSSH的减少与所有三个H蛋白表达的丢失相关2产S酶(图7B,图S6C). 我们还观察到蛋白质过硫化和H2大鼠心脏S-生成酶水平（CSE，MPST）与年龄的关系(图7C)而在12个月龄和24个月龄大鼠的肝脏中，PSSH、CSE和CBS水平呈下降趋势，但无显著差异(图S6D).

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蛋白质过硫化的抗老化性能。

（A）1个月、3个月、6个月、12个月和24个月龄雄性Wistar大鼠脑提取物中过硫水平的变化，以Cy5/488信号的比率计算。数值表示为平均值±标准偏差。n=3/年龄组。*p<0.05，**p<0.01 vs 1个月（1m）。

（B）1月龄、12月龄和24月龄雄性Wistar大鼠皮层CSE、CBS和MST表达水平的免疫组织化学分析。图像代表3只动物/实验组，放大20倍。

（C）雄性Wistar大鼠1个月、12个月和24个月大心脏的蛋白质过硫酸水平（上图）。CSE、CBS和MPST在1、6、12和24个月龄雄性Wistar大鼠心脏中的表达水平（下图）。图像代表3只动物/实验组。

（D）PSSH和PSO2来自同一供体但在31岁和48岁时收集的人类成纤维细胞中的H水平。巯基修饰的量化，在y轴上标记为PSX，表示n=3的平均±SD。**与31岁相比，p<0.01。

（E）N2的生存曲线，吃-2,吃-2；cth-1型和吃-2；最大功率标准-3双突变体。n>100每行。N2=17.8±0.5天；吃-2=24.5±0.9天；吃-2；cth-1型=20.3±0.6天；吃-2；最大功率标准-3=20.2±0.7天。对于吃-2；cth-1型与。吃-2和吃-2；最大功率标准-3与。吃-2p<0.001。

（F）N2中的过硫化水平，吃-2,吃-2；cth-1型和吃-2；mpst-3秀丽隐杆线虫突变体。数值表示为平均值±标准偏差。每条车道使用约16000条蠕虫的蛋白质提取物。n=3.**与N2相比p<0.01，##p<0.01与。吃-2.

（G）N2和N2的存活曲线cth-1型在缺乏或存在5 mM 2-脱氧-D-葡萄糖（DOG）的情况下生长的突变体。n=每条线110。N2=14.2±0.4天，N2 5 mM DOG=17.2±1.0天；cth-1型=13.3±0.4天；cth-1型5 mM狗=13.7±1.0天。N2 vs.N2 5 mM DOG p=0.005；对于cth-1型与。cth-1型5 mM DOG p=n.s，对于N2与。cth-1型p=0.0565。

（H）喂食7月龄和20月龄小鼠的衰老诱导的PSSH变化随意（AL）和喂食热量限制饮食（CR）的小鼠。n=每组5只动物。**与7月龄AL小鼠相比，p<0.01。

（一）腹腔注射D-葡萄糖（2 g/kg体重）的2月龄和12月龄雄性小鼠肌肉组织中PSSH的时间依赖性变化。每组n≥3只动物。**对照组与2个月大的小鼠相比p<0.01，##2月龄小鼠与12月龄小鼠相比p<0.01。

（J）经1 mM硫代硫酸盐处理和未经处理的N2蠕虫的过硫化水平。n=3.**与对照组相比，p<0.01。

（K）N2的生存曲线秀丽线虫和用1 mM硫代硫酸盐处理的N2。每组n>160。N2=18.5±0.3天，1 mM硫代硫酸盐=20.3±0.4天。p<0.0001

最后，作为一个验证概念的实验，我们分析了来自同一个体但收集于不同年龄段（31岁和48岁）的人成纤维细胞中的过硫化和亚磺化水平。结果显示PSSH水平下降，PSO增加2H（H）(图7D)根据我们的假设(图6A).

饮食限制延长寿命是由于蛋白质过硫化增加所致

最近的研究表明，饮食限制（DR）会增加内源性H2S生产(Hine等人，2015年;Mitchell等人，2016年)这种增加与多种益处有关，包括延长不同物种的寿命。然而，H2S对灾难恢复益处的贡献仍然很差。我们测试了DR通过增加蛋白质过硫化部分增加寿命的假设。我们从开始秀丽线虫通过使用吃-2DR的遗传模型比N2对照组吃得少，寿命长。附加删除cth-1型或最大功率标准-3缩短了吃-2突变恢复到控制水平(图7E). 有趣的是，这与这些蠕虫的总PSSH池非常一致；吃-2突变体的PSSH水平大约是N2的3倍，而双突变体的PSSH水平接近或甚至低于N2(图7F). 此外，2-脱氧-D-葡萄糖（DOG）处理野生型N2蠕虫诱导的寿命延长在cth-1型和mpst-3型突变体(图7G).

接下来，我们观察了喂食7个月和20个月大的C57BL/6J小鼠随意（AL）或从2个月大开始每天限制30%的热量（CR）。肝脏过硫水平随着年龄的增长而下降，但与AL相比，这两个CR组的过硫水平更高(图7H).

考虑到葡萄糖和胰岛素耐受性受年龄影响(Fink等人，1983年)我们已经观察到过硫化是胰岛素信号传导的一个组成部分(图5F)我们监测了受攻击的年轻和老年雄性小鼠（2月龄和12月龄）的PSSH变化i.p公司.葡萄糖注射液。老年小鼠的过硫化程度降低，H降低2产S酶(图S6E)很明显。在接受葡萄糖治疗的幼鼠的肌肉组织中观察到过硫化的峰值，但在12个月大的动物中观察到了过硫化的峰(图7I)表明随着年龄的增长，过硫化能力的丧失也会影响胰岛素信号传导，CR对葡萄糖负荷的有益影响(Fontana等人，2010年)部分原因可能是过硫化增加。

最后，我们测试了增加过硫化物水平的药物干预是否可以延长寿命。我们选择测试FDA批准的治疗药物硫代硫酸钠，它不释放H2S本身，但表现出与H相似的有益效果2S公司(Snijder等人，2015年). 我们观察到，用硫代硫酸盐、TST或两者都处理细胞裂解液会使过硫化水平增加数倍(图S6F).秀丽线虫在添加1 mM硫代硫酸盐的培养基上生长，显示出较高的过硫化水平(图7J)因此，我们决定测试它对寿命的影响。事实上，在添加1 mM硫代硫酸盐的培养基上生长的蠕虫的中位寿命显著增加（约15%）(图7K).

讨论

dimedone开关法的通用性和选择性

通过结合商用和特性良好的化学品，我们的新型dimedone开关方法是一种简单、通用和稳健的方法，用于选择性标记蛋白质过硫化物，从而能够在蛋白质上安装各种基团，并使用各种检测方法。此外，我们的化学方法允许对可通过过硫化控制的代谢途径进行大规模分析，并识别新的氧化还原开关。基于dimedone的探针的多功能性也允许通过质谱以位点为中心识别和定量过硫化物，就像蛋白质磺酰化一样(Yang等人，2014年). 通过CuAAC安装不同的荧光团以及显微镜分析中几乎无法检测到的非选择性背景也有可能进一步探索组织切片中的蛋白质过硫化。最后，使用简单的凝胶内检测可以避免与柱分离和蛋白质印迹转移相关的所有问题，这些问题通常用于其他过硫化物检测方法。

过硫化是H的组成部分2O（运行）2信号或/和作为拯救半胱氨酸的进化保守途径

当生命在H中出现时2富硫环境(奥尔森和斯特劳布，2016年)在广泛辐射的条件下，水的光解形成ROS(Liang等人，2006年)保护半胱氨酸残基是必要的。过硫化物的形成是最简单的答案。在过硫化物中，硫原子被氧化，但同时硫被脱质子和高度亲核，ROS的还原速度比相应的硫氧化物快至少一个数量级(Cuevasanta等人，2015年;Filipovic等人，2018年). 换句话说，当半胱氨酸被氧化形成过硫化物时，它同时形成一种强还原剂。

H（H）2O（运行）2现在被广泛认为是一种信号分子(2007年杜特雷和托莱达诺;Holmström和Finkel，2014年;Yang等人，2014年). 已经发现大约1000个半胱氨酸位点被磺酰化，这就提出了如何拯救这些位点的问题。在我们的研究中，在磺酰化后观察到过硫化波，作为对RTK激活的响应，证实过硫化是RTK信号传导的一个组成部分。最近的一项研究表明，大量蛋白质也会进一步氧化为亚硫酸(Akter等人，2018年). 我们的结果表明，没有H2S/过硫化蛋白质即使在H2O（运行）2在正常细胞中不引起变化的浓度。这个被忽视的现象质疑了H是否在哪个浓度范围内2O（运行）2作为不含H的信号分子2秒。

我们证明，随着细胞年龄的增长，由于H的丢失，其过硫化水平降低2S产生酶。与ROS反应，过硫化物将形成S公司-我们发现硫氧还蛋白可以很容易地将磺酸盐还原为硫代酯(图6A). 这种用于保存蛋白质中半胱氨酸残基并防止其功能丧失的拯救环可能是一种进化残余物，在所有生命形式中用作一般保护机制。最能证明这一点的是，低PSSH水平的不同生命形式对氧化应激源的敏感性增强，以及一旦细胞内PSSH池增加，即使通过短期预处理H2S捐赠者。这种统一机制解释了DR的有益作用，已知DR会导致H2S生产过剩(Hine等人，2015年)以及蛋白质过硫化的药理学增加导致的寿命延长。因此，我们的结果进一步加强了ROS衰老理论(Redman等人，2018年).

值得一提的是，除了一般的保护外，特定蛋白质的过硫化还可能导致其功能的改变(Filipovic等人，2018年;保罗和斯奈德，2015年;Vandiver等人，2013年)正如我们观察到的MnSOD的情况，其活性在过硫化后保持不变。DR可能导致ROS减少(Redman等人，2018年)也可能部分与ROS去除酶的更好活性有关。

除衰老外，蛋白质过硫化的一般保护作用也可能转化为许多其他疾病状态。HD和神经退行性变与CSE表达密切相关，通过药物干预提高CSE水平，如莫能菌素治疗，显示出良好的治疗效果(Paul等人，2014年;Sbodio等人，2016年,2018). 我们的研究报告显示，HD细胞中的过硫减少以及通过上调CSE表达而增加的PSSH水平可以对此提供一般性解释。总的来说，我们的数据为微调靶向治疗方法以提高健康寿命和寿命提供了一个良好的起点。

研究的局限性

在这项研究中，我们报告了一种新的化学选择性方法来标记蛋白质过硫化及其广泛的适用性。我们证明过硫化具有保护作用，可将半胱氨酸从过氧化中解救出来。然而，这种修改在多大程度上只是保护性的，还是监管性的，目前尚不清楚。定量、以位点为中心的蛋白质组学分析结合过硫化蛋白质的代谢组学和靶向结构分析，将阐明这种翻译后修饰的功能影响。

此外，H的交织性质2O（运行）2和H2我们的工作中描述的S信号值得进一步调查。我们证明这是受体酪氨酸激酶信号传导的情况，但H2O（运行）2信号转导与许多其他生理过程有关。H的作用2为了将PSOH/PSSH开关定位在信号方案中的全局位置，仍需进一步研究这些路径中S通过过硫化的情况。

最后，我们证明过硫化物会随着年龄的增长而减少，增加过硫化物的药物或饮食干预可以延长寿命。如何和为什么H2产硫酶随着年龄的增长而减少，以及过硫化增加与寿命甚至健康寿命延长相关的确切机制仍有待了解。然而，我们在这里描述的dimedone开关方法允许我们进一步挖掘这些似乎只是更清晰画面的开始的过程。

STAR方法

引线触点和仪表可用性

本研究未产生任何新试剂。有关资源和试剂的更多信息和请求应发送给首席联系人Milos Filipovic，并由其完成(rf.srnc.cgbi@civopilif.solim公司)

实验模型和受试者详细信息

单元格行

HeLa细胞和神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）均来自ECACC。HeLa细胞在37°C和5%CO的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM、高糖和丙酮酸钠）中培养，补充2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素和10%小牛血清2.

SH-SY5Y细胞在37°C和5%CO条件下，在Ham’s F12:DMEM（1:1）培养基中培养，补充2 mM谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素和10%小牛血清2.

C混合人脐静脉内皮细胞（HUVEC）取自德国PromoCell，并在37°C和5%CO的内皮细胞生长培养基试剂盒（C-22110，PromoCel，德国）中培养2.

小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）由雄性野生型（WT）和CSE产生−/−小鼠，并使用SV40T抗原永生化(Sbodio等人，2016年). MEF细胞在DMEM（高糖）中培养，补充2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素和10%小牛血清，37°C和5%CO2.

纹状体祖细胞系ST卫生部第7季度/第7季度表达野生型亨廷顿蛋白和STHdh公司2011年第11季度/2011年第1季度来自M.MacDonald（马萨诸塞州波士顿马萨诸塞总医院）。细胞保存在补充有2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素和10%小牛血清的DMEM（低血糖，无丙酮酸）中，温度为33°C和5%CO2.

人类成纤维细胞系AG08790（31岁）和AG14245（48岁——17年前从同一男性供体AG08790-活检中获得的培养物）来自科里尔医学研究所。成纤维细胞在37°C和5%CO条件下，在补充有2 mM L-谷氨酰胺和10%小牛血清的DMEM中培养2.

秀丽线虫

本研究中使用了以下菌株：野生型Bristol N2，cth-1（ok3319）V,mpst-3（tm4387）伏,吃-2（tm5786）II,eat-2（tm5786）II；cth-1（ok3319）V,eat-2（tm5786）II；mpst-3（tm4387）伏.原始隔离VC2569cth-1（ok3319）V由Caenorhabditis Genetics Center提供，而原始分离株FX04387mpst-3（tm4387）伏和FX19451吃-2（tm5786）II由MITANI实验室通过日本MEXT的国家生物资源项目提供。所有突变菌株在使用前至少露头4次。使用标准技术构建双突变菌株(布伦纳，1974年;苏尔斯顿和霍奇金，1988年)用PCR检测两种突变的存在。除非另有说明，否则使用标准线虫生长培养基（NGM）培养板在20°C下培养蠕虫秀丽线虫技术(Stiernagle，2006年)有足够的食物(大肠杆菌OP50–1）使用前至少两代。

酿酒酵母

除非另有说明，酵母细胞在液体YPD培养基（1%酵母提取物、1%杆菌肽和2%葡萄糖）中生长。

大鼠

实验中使用的雄性Wistar大鼠在塞尔维亚贝尔格莱德“Siniša Stanković”生物研究所繁殖并饲养，在恒定的实验室条件下（22±2˚C，12-12小时光暗循环）。有食物和水随意健康对照动物在1个月、3个月、6个月、12个月和24个月时被斩首。所有动物程序均符合EEC关于保护用于实验和其他科学目的的动物的指令（86/609/EEC），并得到贝尔格莱德大学“Siniša Stanković”生物研究所实验动物使用伦理委员会的批准。

雄性C57BL/6J小鼠（AL和CR实验）

所有实验都是在哈佛医学区机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准下进行的。雄性C57BL/6J小鼠在6个月龄（幼年）和19个月龄时从Charles River Laboratories（CRL）的NIA老化群体资源处获得。小鼠被允许在该设施中适应一个月，以确保装运后的重量稳定，因此牺牲时为7个月大（幼年）和20个月大。如前所述，开始热量限制（CR）(Turturro等人，1999年)（从14周龄开始，CR以逐步下降的方式开始，在15周龄时增加到25%的限制，在16周龄时模仿全部40%的限制，并在动物的整个生命周期中保持。随意性（AL）动物喂食NIH-31饮食，而CR动物喂食强化NIH-31食物(Turturro等人，1999年). 有关CRL畜牧业条件的其他详细信息，请参阅：https://www.nia.nih.gov/research/dab/aged-ratoth-colonies-handbook/barrier-environmental-information（https://http://www.nia.nih-gov/researc/dab/aged-ratota-colonies-handbook-barrier-环境信息）.

在老鼠的一生中，它们都被单独关在标准的鼠笼中。到达哈佛大学后，小鼠被安置在HSPH的屏障设施中，置于带有玉米芯被褥、一只雏鸟和一间牧羊棚的微型隔离器笼子中。小鼠可以免费获得水，也可以获得AL NIH-31或强化NIH-31（CR小鼠每天1粒）。CR小鼠每天早上7:00至8:00通过将定量食物喂到笼子的地板上来喂养。在第二天发放新的口粮之前，所有剩余的食物都被清除了。小鼠被关在12/12小时光/暗循环（7am-7pm）的房间内，温度为20-23°C，相对湿度为30%-70%。每周使用完全无菌技术更换笼子，并在II级层流更换站按要求进行局部更换。

雄性C57BL/6J小鼠（葡萄糖耐量试验）

除了葡萄糖耐量试验外，动物被安排在12小时的光照-暗照时间内，并随意进食和饮水，在葡萄糖耐量实验中，小鼠在注射葡萄糖之前挨饿过夜。所有动物都按照美国国立卫生研究院的建议进行了治疗，并得到了约翰斯·霍普金斯大学动物护理委员会的批准。

方法详细信息

除非另有说明，否则所有化学品均购自Sigma Aldrich。所有缓冲液均用纳米纯水制备，并用Chelex-100树脂处理，以去除微量金属离子。纳2按照建议制备和处理S溶液(Wedmann等人，2014年). 如前所述，合成了Nmc-青霉胺(阿尔托和加勒登，2014年). 吗啉-4-碘-4-甲氧基苯基（吗啉基）亚磷酸二硫代酯（GYY4137）和（10-oxo-10-（4-（3-硫氧基）-3小时-1,2-二硫醇-5-基）苯氧基）癸基）三苯基溴化鏻（AP39）是根据(Alexander等人，2015年;Le Trionnaire等人，2014年).

蛋白质特异性oxPTM的制备

HSA-SH、HSA-SOH和HSA-SSH的制备

减少HSA（HSA-SH）

将1 g HSA溶解在10 ml dH中2O，并使用浓HCl调节至pH值3。然后将木炭（0.5 g）添加到溶液中，并在冰上搅拌1 h。将溶液离心（16000 x克，30 min，4°C），收集上清液并离心（26000 x克，30分钟，4°C），然后使用22μm过滤器在冰上过滤。然后，通过添加5 mMβ-巯基乙醇并在室温下培养1小时或在4°C下培养过夜来降低该浓度。使用具有30mM磷酸盐缓冲液的基于Sephadex 10的凝胶过滤色谱过滤所得溶液。收集、合并含有HSA的组分，并使用UV/Vis分光光度法测定蛋白质浓度，使用摩尔消光系数ε280=35279百万−1厘米−1.

磺化HSA（HSA-SOH）

磷酸盐缓冲液中减少的HSA-SH与10倍的过量H孵育2O（运行）2按照制造商的指示，在37°C下放置15分钟，然后使用生物旋柱（BioRad）进行清洁。

过硫化HSA（HSA-SSH通过HSA-TNB）

将磷酸缓冲液中还原的HSA-SH与20倍过量的埃尔曼试剂在室温下培养1小时，并持续混合。在Sephadex G10柱上用30 mM磷酸盐缓冲液清洗所得溶液。H的1.5当量2将S添加到1当量的HSA-TNB中，并在37°C下培养15分钟或在冰上培养1小时。立即通过生物螺旋柱清洗溶液，以获得HAS-SSH。制作完成后，HSA-SSH被放在冰上并立即使用。

过硫化GAPDH的制备

如HSA衍生物所述，制备过硫化GAPDH。

若丹糖（TST）修饰物的制备

降低TST（TST-SH）

牛TST（Sigma-Aldrich）在37°C下用100倍过量的DTT处理30分钟，然后按照制造商的指示使用迷你生物pin柱（BioRad）通过凝胶过滤进行清洁。

过硫化TST（TST-SSH）

牛TST（主要以过硫化物的形式存在）与10倍过量的硫代硫酸钠在37°C的10 mM Tris缓冲液（pH 8）中培养30分钟，然后按照制造商的指示使用微型生物旋柱（Bio-Rad）进行清洁。

提纯蛋白质的Dimedone开关法

蛋白质与5或10 mM NBF-Cl在50 mM PBS（40 mM Na）中培养2高性能操作4，10 mM NaH2人事军官4和135 mM NaCl，pH 7.4），在37°C下添加SDS（最终浓度2%）30分钟。然后通过甲醇/氯仿沉淀沉淀溶液；样品/MeOH/CHCl三添加4/4/1（v/v/v）并离心（14000 x克，15分钟，4°C）。获得的蛋白质颗粒将位于有机层和水层之间，两层均被抽吸，H2O/甲醇/氯甲烷三将4/4/1（v/v/v）加入蛋白颗粒并离心。再次抽吸上清液，然后用甲醇清洗颗粒2-3次。将颗粒重新悬浮在含有2%十二烷基硫酸钠的50 mM PBS中，在37°C下与50μM二甲酮或DCP-Bio1孵育1小时，如前所述用甲醇/氯仿沉淀，并重新悬浮在含2%十二烷基磺酸钠的PBS中。然后将1当量的补充有10%β-巯基乙醇的Laemmli（4X）缓冲液（BioRad）添加到3当量的样品中，用于SDS-PAGE，并在95°C下煮沸5分钟，避光。

对于一些实验，仅在50 mM PBS中重新溶解DCP-Bio1标记的样品，在室温（RT）下用中性粒（Thermo Fischer Scientific）培养2小时，并连续混合。然后用添加0.01%吐温-20的10体积PBS清洗珠子，并通过将珠子在添加10%β-巯基乙醇（1X与PBS）的最小体积的Laemmli缓冲液中煮沸，以洗脱结合蛋白，用于SDS-PAGE 5分钟。样品用SDS-PACE溶解，凝胶在固定缓冲液中固定30分钟，避光保护。在Typhoon FLA 9500（GE Healthcare）上记录凝胶，Cy5信号为635nm，NBF-Cl信号为473nm。

dimedone与LMW过硫化物开关反应的ESI-TOF-MS

对maXis 5G，Bruker Daltonic（德国不来梅）进行质谱分析，这是一种ESI-TOF MS，分辨率至少为40000 FWHM。检测处于正离子模式。将100μM nmc-过硫化青霉胺与100μM NBF-Cl在碳酸氢铵缓冲液（pH 7.4，23°C）中混合，并监测15分钟的反应，然后添加500μM二甲酮，再监测15分钟。

DCP-Bio1标记过硫化蛋白模型的质谱

如前所述，用DCP-Bio1标记的蛋白质过硫化物开关，并通过SDS-PAGE进行解析，按照前所述方案，用胰蛋白酶或糜蛋白酶切除并消化蛋白质带(Crouzet等人，2017年). 在Thermo Scientific Q Exactive Orbitrap质谱仪上，结合Proxeon Easy-nLC II HPLC（Thermo Fisher Scientistic）和波尔多蛋白质组学平台上的Proxeon纳米喷雾源，通过LC-MS/MS分析消化肽。将消化后的肽装入100微米x 25毫米的Magic C18100º5U反相捕集器，在用75微米x 150 mm Magic C18 200º3U反相柱分离之前，在线脱盐。使用120 min梯度洗脱肽，流速为300 nL/min。在350–1600 m/z范围内进行MS测量扫描；使用top 12方法获得MS/MS光谱，其中MS光谱中的前12个离子受到高能碰撞解离（HCD）。使用2 m/z的隔离质量窗口进行前体离子选择，使用27%的归一化碰撞能量进行碎片化。动态排除时间为5秒。使用PEAKS Studio（BSI，加拿大）进行肽鉴定(Zhang等人，2012年). 搜索设置为：前体Δm耐受性=10ppm，片段Δm耐受性=0.2Da，缺失裂解物=2，赖氨酸修饰：NBF（163.0012），半胱氨酸修饰：NBF（163.0012），DCP-Bio1（394.1557），或水解DCP-Bio1（168.0786）。

红细胞裂解液中过硫化蛋白的蛋白质组学分析

根据《赫尔辛基宣言》提供知情同意书的本研究参与者的9 mL外周全血在柠檬酸盐中采集，并立即按照先前描述的方案进行处理(Pasini等人，2006年)改性后，裂解缓冲液中含有5 mM NBF-Cl。在4°C下用裂解缓冲液培养30分钟后，用SDS（最终浓度为2%）添加额外的NBF-C1（最终浓度15 mM NBC-Cl），并培养30分钟。如前所述，进行甲醇/氯仿沉淀，所得蛋白颗粒在添加0.1%十二烷基硫酸钠的50 mM PBS中再溶解。通过在RT下与Pierce™NeutraAvidin™琼脂糖（Thermo Fisher Scientific）在搅拌下孵育2小时，预先去除内源性生物素化蛋白质。随后在Pierce™一次性柱（Thermo Fisher Scientific）上去除树脂，并用甲醇/氯仿沉淀得到溶液。将所得蛋白颗粒在补充有2%SDS的50 mM PBS中再溶解，并在37°C下与50μM DCP-Bio1孵育1.5小时。用甲醇/氯仿沉淀溶液，并在补充有0.1%SDS的50mM PBS内再溶解。蛋白质溶液与Pierce™高容量NeutraAvidin™琼脂糖（Thermo Fisher Scientific）在4°C下搅拌培养过夜。然后将样品送至RT并加载到色谱柱上。用8个50 mM PBS柱体积、添加0.001%吐温-20、2个50 mM-PBS柱容量、最后用1个H柱体积的树脂清洗树脂2O.清洗后，从柱中收集树脂，并在室温下与2.25 M氢氧化铵孵育，搅拌过夜。然后用甲酸中和样品，并测定蛋白质浓度。添加1当量的酶消化缓冲液（对于胰蛋白酶消化：100 mM碳酸氢铵缓冲液；对于糜蛋白酶消化：10 mM Tris和10 mM CaCl2pH值7.8）。以1:50（wt:wt）的酶底物比进行消化，并在37°C下搅拌培养过夜。再次将酶以1:20（wt:wt）的酶-底物比添加到溶液中，并在37°C下搅拌5小时。然后将所得肽样品冷却至pH 3，并加入浓缩液。HCl，并在波尔多蛋白质组学平台进行分析。胰蛋白酶消化肽在Thermo Scientific Q Exactive Orbitrap质谱仪上通过LC-MS/MS、Proxeon Easy-nLC II HPLC（Thermo Fisher Scientistic）和Proxeon纳米喷雾源进行分析。样品在300-μm ID x 5-mm C上分离18PepMapTM预柱和75μm ID x 25 cm纳米Viper C18，2μm，100 Au–Acclaim®PepMap RSLC色谱柱，使用4–40%的B（A:H）梯度2O/MeCN/HCOOH，95/05/0.1，B:H2O/MeCN/HCOOH，20/80/0.1）。使用120 min梯度洗脱肽，流速为300 nL/min。在3501600 m/z范围内进行MS测量扫描；使用top 12方法获得MS/MS光谱，其中MS光谱中的前12个离子受到高能碰撞解离（HCD）。使用2 m/z的隔离质量窗口进行前体离子选择，使用27%的归一化碰撞能量进行碎片化。动态排除时间为5秒。使用PEAKS Studio（BSI，加拿大）进行肽鉴定。搜索设置为：前体Δm容差=10 ppm，片段Δm容差=0.2 Da，缺失劈理=2，−10logP（P）>50，赖氨酸修饰物：NBF（163.0012），半胱氨酸修饰物：NBAF（163.00 12），DCP-Bio1（394.1557），或水解DCP-Bio 1（168.0786）。

凝胶内过硫化检测（Dimedone开关法）

DAz-2:Cy-5点击混合的制备

制备的1 mM DAz-2（Cayman Chemical）、1 mM氰化物5炔烃（Lumiprobe）、2 mM铜（II）-TBTA络合物（Lumirobe）和4 mM抗坏血酸的最终浓度就地，依次添加到与30%（体积/体积）乙腈混合的15 mM PBS缓冲液中。在室温下将溶液混合过夜，然后用20 mM乙二胺四乙酸（EDTA）淬火，并在室温下混合2小时。

PTP1B过硫化

人重组PTP1B以1 mg/mL从Abcam购买。蛋白质在生物旋柱（BioRad）上脱盐，浓度调整为10μM。样品要么未经处理，要么暴露于50μM H2O（运行）2，或50μM H的组合2O（运行）2和H2在37°C下放置15分钟。然后将样品脱盐，并在37°C的HEPES缓冲液中加入或不加入1mM NBF-Cl进行处理，缓冲液中添加2%十二烷基硫酸钠，处理时间为1小时。在biospin柱上进行脱盐步骤后，用20μM DAz-2:Cy-5 Click Mix在37°C下处理相同样品30分钟。未反应的试剂通过生物旋柱上的脱盐去除，样品与添加10%β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液混合。

细胞裂解液中的过硫化物检测

细胞在10 cm的培养皿中生长至80–90%的汇合度，然后分别用冷的15 mM PBS轻轻清洗两次。1 ml冷的HEN裂解缓冲液（50 mM Hepes，1 mM EDTA，0.1 mM Neocuproine，1%IGEPAL和2%SDS，调节至pH 7.4，1%蛋白酶抑制剂）补充5 mM 4-氯-7-硝基苯并呋喃咱（NBF-Cl）然后添加到单元格中。轻轻刮去细胞，收集裂解物，用注射器和针头均质，并立即放置在37°C下孵育30分钟，避光。如前所述，进行甲醇/氯仿沉淀，以防光照。然后在50 mM Hepes（Euromedex，调节pH 7.4）中重新溶解获得的蛋白质颗粒，并添加SDS（2%最终浓度）。完全溶解后，使用DC测定法（BioRad）测定蛋白质浓度，并将其调整至约3 mg/ml。DAz-2:Cy-5点击混合物（最终浓度25μM），按照上述方法制备，添加到调整样品中，并在37°C下孵育30分钟，避光。然后用甲醇/氯仿沉淀样品，用SDS（最终浓度2%）在Hepes中重新溶解获得的蛋白颗粒。将蛋白质浓度调整为2–2.5 mg/ml，制备样品用于SDS-PAGE并记录，如前所述。

对于H2用200μM Na进行S供体治疗2S处理45分钟，200μM GYY4137处理2小时，200 nM AP39处理2小时和2 mM D-半胱氨酸处理1小时。用1μM和10μM橡皮素处理细胞18.5小时，进行橡皮素治疗。用1微米莫能菌素处理18小时。

对于硫代硫酸盐和TST处理的HeLa裂解液中的PSSH标记，使用添加有1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM EDTA、1%IGEPAL和2%SDS，调节至pH 7.4）对细胞进行裂解，如前所述。裂解物通过TCA沉淀沉淀；将100%TCA储备溶液添加到样品中以获得20%TCA的最终混合物。将混合物在冰上培养10分钟，然后离心（30000 x克，10 min，4°C），并抽吸上清液。然后用冷丙酮清洗蛋白质颗粒并离心（30000 x克，10分钟，4°C）两次，然后晾干。蛋白质颗粒在50 mM Hepes中再溶解，并在37°C下用或不用500μM硫代硫酸盐、5μM硫硫酸硫转移酶（TST）或两者的联合处理处理1小时。接下来，向混合物中添加10 mM NBF-Cl，在37°C下培养1小时，并通过甲醇/氯仿沉淀进行清洁。然后用DAz-2:Cy5预浸混合物对样品进行开关标记，并按照前面所述进行SDS-PAGE处理。

大肠杆菌裂解液中的过硫化物检测

实验室菌株大肠杆菌用pSB74质粒转化MG1655，该质粒含有澳大利亚广播公司的操纵子肠杆菌伤寒血清型2S生产。作为阴性对照，大肠杆菌用空载体（pTrc99a）转化。两种菌株都在补充了50 mg/ml氨苄西林的TSA平板上划线，并在37°C下培养过夜。第二天，将每个菌株的一个菌落接种到补充有50mg/ml氨苄青霉素的TSB培养基中，并在37°C下搅拌（100rpm）生长，作为起始接种物。将每种过夜培养物中的10μl转移到添加了适当抗生素的10 ml新鲜TSB培养基中。在37°C下搅拌（120 rpm），用或不用20 mM硫代硫酸钠处理两个菌株4小时。培养时间结束后，以5000 rpm的转速离心4 min，用冰镇PBS洗涤样品，并将其重新悬浮在补充有1%蛋白酶抑制剂和25 mM NBF-Cl的HEN裂解缓冲液中。通过超声波在冰上破碎细胞，在190 MHz下20秒，停顿2 min，然后在37°C下培养1小时，避光保护。然后沉淀样品，并按照前面描述的方法处理蛋白质颗粒，以进行过硫化物标记，使用50μM DAz-2:Cy5预浸混合物，在37°C下避光1小时。

酿酒酵母裂解液中过硫化物的检测

200μL酵母细胞株WT，Δcys3,Δcys4和Δtum1与添加有1%酵母蛋白酶抑制剂和20 mM NBF-Cl的1 mL HEN裂解缓冲液混合。将混合物滴入液氮中，并使用研钵和杵与玻璃珠一起研磨，达到细粉稠度。样品转移到2 ml试管中并离心（1500 x克，4°C下15分钟）。收集上清液，并在37°C下孵育1小时，避光。沉淀后，如前所述，用50μM DAz-2:Cy5预浸混合物在37°C下处理蛋白质颗粒45分钟。

秀丽隐杆线虫裂解液中过硫化物的检测

如前所述，通过在碱性漂白剂中溶解妊娠雌雄同体获得同步胚胎群体(Emmons等人，1979年). 通过离心将胚胎洗去碱性漂白剂后，将其置于标准NGM琼脂平板上，接种大肠杆菌OP50–1，约4000个胚胎/平板。在第1天，不同菌株（N2，cth-1型,最大功率标准-3,吃-2,吃-2；cth-1型,吃-2；最大功率标准-3)使用M9缓冲液从NGM板（4个板/株）中收集到15 ml猎鹰中，并清洗三次。将蠕虫颗粒冷冻在液氮中，并在每个试管中添加500μl玻璃珠。将样品以6.5 m/s的速度放入打球器（FastPrep-24，MP Biomedicals，California，USA）中35秒，然后以同样的速度再进行20秒的循环。向每个试管中添加添加有1%蛋白酶抑制剂和20 mM NBF-Cl的HEN裂解缓冲液，并在4°C下以13000 rpm离心15分钟。收集上清液并在37°C下孵育45分钟。然后沉淀样品，并对蛋白质颗粒进行过硫化物标记，并按照前面所述进行处理。按照上述方法获得同步胚胎群体，并将其置于标准NGM琼脂或添加1 mM硫代硫酸钠的NGM琼脂糖平板上大肠杆菌OP50–1。然后在20°C下培养平板，直到蠕虫达到第1天的成虫阶段。如前所述，从平板中收集蠕虫并进行处理以进行过硫化物标记。为了检测老化N2蠕虫（第1天、第3天和第7天）中的过硫化物水平，将同步胚胎群体放置在接种了大肠杆菌OP50–1的标准NGM琼脂平板上。将L4期蠕虫转移到含有25μM 5-氟-2'-脱氧尿苷（FUdR）的NGM琼脂平板上。转移后的一天，用M9缓冲液收集蠕虫并过滤（细胞过滤器40μm，ClearLine），以去除虫卵。如前所述（成年后第1天），直接对蠕虫进行溶解和加工，以进行过硫化物标记，或将其放回含FUdR的平板上，并在相应的时间（成年后的第3天和第7天）生长，同时每2-3天过滤并转移到新鲜的FUdR-平板上。

果蝇裂解物中过硫化物的检测

作为野生型控件年1w个1118 果蝇已使用行。Eip55E型(果蝇CSE)-过度表达的线条是格罗宁根大学（University of Groningen）Ody Sibon教授的一份礼物。用50μL HEN裂解缓冲液（辅以1%蛋白酶抑制剂和20 mM NBF-Cl）在冰块上，将3-4只整只苍蝇在肥皂匀浆器中研磨。在30000 x克培养20分钟，上清液在37°C下培养30分钟，避光。然后对样品进行沉淀，并对蛋白质颗粒进行过硫化物标记，并按照前面所述进行处理。

小鼠肾裂解物中过硫化物的检测

CSE公司+/+和CSE−/−产生C57BL/6小鼠，并对其进行了特征分析(Markó等人，2016年). CSE公司+/−雄性和雌性被繁殖以获得WT和CSE−/−同窝的人。老鼠可以自由享用标准的食物和水。小鼠被置于12:12小时的光暗循环中。这些老鼠的肾脏是Maik Gollasch教授（Charité医学院）赠送的礼物。将5–10 mg肾组织与500μL HEN裂解缓冲液（补充有1%蛋白酶抑制剂和20 mM NBF-Cl）在冰块中均匀化。以30000倍离心分离匀浆克培养20分钟，上清液在37°C下培养30分钟，避光。然后对样品进行沉淀，并对蛋白质颗粒进行过硫化物标记，并按照前面所述进行处理。

大鼠组织裂解液中过硫化物的检测

斩首后，立即将大脑、心脏和肝脏取出，并在液氮中快速冷冻。使用分散系统（Ultra-Turax T25，Janke&Kunkel，IKA-Labortechnik，德国）在冰上以8000 rpm的速度将器官切碎并均匀化，HEN裂解缓冲液中添加1%蛋白酶抑制剂和20 mM NBF-Cl。在37°C避光培养1小时后，沉淀样品，进行过硫化标记处理（使用50μM DAz-2:Cy5预浸混合物），如前所述。

饮食限制（AL和CR）后衰老小鼠肝脏中过硫化物的检测

实验当天，小鼠被带到手术室（上午6点30分），并放在干净的笼子里。AL小鼠的食物被转移到料斗中，CR小鼠按照常规在早上7点喂食，每只小鼠在笼底放一粒颗粒。他们被允许进食2小时，然后从上午9点开始，用异氟烷（氧气中的2-5%）麻醉小鼠，并进行心脏穿刺抽血。进行颈部脱位以确保安乐死，并切除组织并在液氮中快速冷冻。从颈部脱位到肝脏切除和快速冷冻，这段时间不超过30秒（实验中未禁食小鼠）。用手术刀将20 mg肝脏切成小块，放入1 ml HEN缓冲液中，补充1%蛋白酶抑制剂和20 mM NBF-Cl，然后使用冰上分散系统和标有50μM DAz-2:Cy5预取混合物的开关将其均质，并如上所述进行处理。

葡萄糖耐量试验后小鼠骨骼肌中过硫化物的检测

对2月龄和12月龄小鼠进行葡萄糖耐量试验（GTT），在注射D-葡萄糖（i.p.2 g/kg体重）之前禁食16小时。在注射前和注射后的指定时间点（15分钟和60分钟）通过尾静脉出血记录血糖水平，使用Ascensia Contour血糖仪和测试条。在指定的时间点，通过断头处死小鼠，分离骨骼肌并在液氮中快速冷冻。用手术刀将20 mg冷冻肌肉切成小块，置于2 ml HEN缓冲液中，补充1%蛋白酶抑制剂和20 mM NBF-Cl。然后使用冰上分散系统将悬浮液均质，并进行过硫化标记处理（50μM DAz-2:Cy5预浸混合物），如前所述。

人红细胞裂解物中过硫化物的检测

红细胞裂解物以两种方式制备，以获得膜和胞浆。用含有5 mM NBF-Cl的5体积的10 mM磷酸盐缓冲液在4°C下溶解填充的红细胞30分钟，并频繁地旋转。离心20分钟后（30000 x克)从细胞膜颗粒中分离上清液。将SDS（最终浓度为2%）和10 mM NBF-Cl（最终浓度）添加到上清液中，并在4°C下再培养60 min。用含有5 mM NBF-Cl的PBS清洗膜芯3次，然后在含有5 mM-NBF-Cl和SDS（最终浓度为2%）的PBS中重新悬浮，并在37°C下培养30分钟。如前所述，沉淀并处理膜蛋白和胞浆蛋白以进行过硫化标记（50μM DAz-2:Cy5预浸混合物）。

共聚焦显微镜和表观荧光反卷积显微镜检测过硫化

WT和CSE−/−MEF细胞按照制造商的说明在从Ibidi®（德国马丁斯里德）获得的μ-Dish（35 mm，高玻璃底，81158）中生长。2 mM D-半胱氨酸和200μM Na的处理2S（高2S） 在37°C下进行1小时以上。处理后，用温无菌PBS清洗细胞两次，并在37°C下用1 mM NBF-Cl在PBS中培养30分钟。通过在−20°C下与冰镇甲醇孵育20分钟，然后在−-20°C下用冰镇丙酮渗透5分钟来进行固定。用PBS清洗培养皿，并在37°C下在2 ml PBS中与额外的1 mM（最终浓度）NBF-Cl孵育1小时。用PBS清洗细胞过夜并搅拌，然后用10μM（最终浓度）DAz-2:Cy-5点击混合物在2 ml PBS中在37°C下培养1小时。对于阴性对照，将细胞与不含DAz-2制备的10μM DAz-2:Cy-5点击混合物一起孵育。用PBS清洗过夜后，用甲醇清洗细胞3×10 min，然后用PBS进行额外清洗。DAPI染色是通过用300 nM DAPI（最终浓度）在2 ml 15 mM PBS中培养细胞，搅拌5 min，避光，然后用15 mM PBS轻轻清洗细胞5次。使用配备氩激光（458、476、488、514 nm）、二极管激光（405 nm）和氦氖激光（633 nm）的共聚焦徕卡TCS SP5显微镜获得图像。使用x40油物镜。为了检测免疫荧光的共同定位，分别在同一焦平面上取单个光学切片，并使用ImageJ将相应的3个通道（405 nm（DAPI）、488 nm（NBF加合物）和633 nm（Cy5表示PSSH））合并为8位RGB tifffile。Z-使用x 100油物镜在Olympus IX81倒置荧光显微镜上拍摄叠加图像，用于图像反褶积。

过硫化检测的抗体阵列样方法

将每种抗体添加到带有3D-NHS表面（PolyAn，Berlin）的96孔板的适当孔中，最终体积为50μl，PBS缓冲液（150 mM Na）中2高性能操作4/NaHPO公司4和50 mM NaCl，pH 8.5）。此外，在阴性对照孔中，TBST中50μl 5%BSA（137 mM NaCl和20 mM Trizma碱，pH 7.4，补充0.1%吐温）和0.002%NaN三已添加。盖上平板并在4°C下搅拌培养过夜。丢弃溶液，用15 mM PBS缓冲液补充液（含0.01%吐温）冲洗微孔5次，使用多通道，将干净的平板与纸巾倒置，以完全去除液体。然后用50 mM乙醇胺在100 mM Tris中在pH值为9的室温下搅拌2小时，堵住所有微孔。丢弃封闭溶液，用5%BSA在TBS中用0.01%吐温-20重新封闭微孔，在室温下搅拌1小时。如上所述再次清洗水井。在完全去除液体后，将100μl处理过的样品加入适当的孔中，并在4°C下搅拌培养过夜。清洗后，在台风FL9500上以473 nm和635 nm的波长记录平板。

对于WT、CSE的实验−/−用D-半胱氨酸MEF细胞处理WT，获得裂解物并标记过硫化物，如前所述，并在浓度为0.3 mg/ml的50 mM Hepes中再溶解。使用以下抗体：1。β-肌动蛋白（0.04 mg/ml，sc-47778，Santa Cruz Biotechnology）；2.β-微管蛋白（0.04 mg/ml，T0198，Sigma-Aldrich）；3.GAPDH（0.04 mg/ml，G8795，Sigma-Aldrich）；4.热休克蛋白70（0.04 mg/ml，ab5439，Abcam）；5.KEAP1 P586（0.0062 mg/ml，4678，细胞信号）；6.eNOS（0.0025 mg/ml，32027，细胞信号）；7.帕金（0.04 mg/ml，sc-136989，Santa Cruz Biotechnology）；8.SOD-2（0.04 mg/ml，sc-137254，Santa Cruz Biotechnology）；9.抗-TST（0.04 mg/ml，GTX114858，GeneTex）；10.抗-SQR（0.04 mg/ml，HPA017079，Sigma-Aldrich）。

用于HeLa细胞裂解物的实验，以与时间相关的方式用EGF处理并如上所述进行标记。使用了以下抗体：PTEN（1:1000，sc-7974，Santa Cruz Biotechnology，）；2.PTP1B（1:1000，sc-133259，Santa Cruz Biotechnology）；3.SH-PTP2（0.04 mg/ml，sc-7384，Santa Cruz Biotechnology）；4.EGFR（0.04 mg/ml，sc-03-G，Santa Cruz Biotechnology）。

MnSOD过硫化和活性实验

人重组MnSOD购自Creative BioMart。如前所述，使用细胞色素c测定SOD活性(Liu等人，2007年). 13μM MnSOD的SOD活性，用3倍过量的H预处理的MnSOD2O（运行）2（15分钟，37°C）和MnSOD预处理，其中H的过量量为3倍2O（运行）2和H的5倍超额2测量S。过氧亚硝酸盐是按照既定方案制备的(Filipovic等人，2012年)利用特征光谱特性评估酪氨酸硝化：430nm处的吸光度增加归因于随着pH值降低而观察到的特征位移（从430 nm到357nm）导致硝基酪氨酸的形成(Filipovic等人，2012年).

蛋白质磺酰化检测

在分别处理后，细胞在添加1%蛋白酶抑制剂和100μM DCP-Bio1的冷HEN裂解缓冲液中进行裂解。轻轻刮去细胞，收集裂解液，用注射器和针头将其均质，并立即放置于37°C下孵育1小时。如前所述，进行甲醇/氯仿沉淀，并用SDS将所得蛋白颗粒重新溶解在50 mM Hepes中（最终浓度为2%）。如前所述，为SDS-PAGE制备蛋白质颗粒。使用SDS-PAGE解析样品后，在硝化纤维素膜上进行蛋白质转移，然后在添加0.1%吐温（PBST）的PBS中用5%干毫升封闭，并在50 mM PBS（1:10000，21832，Thermo Fisher Scientific）中用链霉亲和素蛋白DyLight 488孵育1小时，避光。使用Typhoon FLA 9500（GE Healthcare）在473 nm处记录硝化纤维膜。然后使用0.04M NaOH剥离膜，搅拌培养5分钟两次，然后用PBST清洗（5次，5分钟），如前所述进行封闭，并用GAPDH或β-微管蛋白培养作为负荷控制。在RT下清洗膜并与相应的次级辣根结合抗体孵育2小时。然后使用G:Box Chemi-XT4（Syngene）上的Clarity™Western ECL底物（BioRad）清洗膜并进行可视化。

蛋白质亚磺酰化的检测

分别处理后，在添加1%蛋白酶抑制剂和5 mM NBF-Cl或20 mM NEM的冷HEN裂解缓冲液中裂解细胞。轻轻地报废细胞，收集裂解物，用注射器和针头匀浆，并立即放置在37°C下分别孵育30分钟或1小时。进行甲醇/氯仿沉淀，重新溶解获得的蛋白质颗粒，并按照前面所述调整蛋白质浓度。样品在室温下用1mM BioDiaAlk处理1小时，避光。通过添加1 mM DTT（在4°C下培养过夜）或通过甲醇/氯仿沉淀来终止反应。然后将3当量的样品与1当量的补充有10%β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液（4X）混合，并在55°C下培养20分钟。使用SDS-PAGE解析样品后，进行蛋白质转移，然后在PBST中封闭5%干牛奶，并与Cy5-Streptavidin（1:4000，21832，Thermo Fisher Scientific）孵育1小时，避光。使用台风FLA 9500（GE Healthcare）在635 nm处记录硝化纤维素膜。如上所述，GAPDH用作加载控制。

细胞的受体酪氨酸激酶激活

激活条件

对HeLa和MEF细胞进行EGF（PromoKine）治疗，对SH-SY5Y细胞进行胰岛素治疗，细胞培养在80–90%的细胞培养皿中。VEGF（PromoCell）治疗采用在T25烧瓶（Greiner）中培养的HUVEC，70%–80%汇合。对于预处理，用补充有100μM GYY4137或抑制剂混合物（PG和AOAA各1 mM）的完整培养基替换培养基，并在37°C和5%CO下培养230分钟，然后用温热的无菌PBS清洗。随后，用完整的培养基（如上所述）替换培养基作为对照，并用相应的处理补充培养基（100或200 ng/ml EGF；100 nM或200 nM胰岛素；40 ng/ml VEGF）。如前所述，在处理后，用冷PBS清洗细胞两次，然后裂解细胞以进行过硫化物或硫酸标记。

HeLa细胞EGFR的实时活性

细胞以1×10接种4在平衡的E-Plate VIEW 16 PET（ACEA Biosciences，San Diego，USA）中培养细胞/微孔，并在37°C和5%CO条件下培养过夜2接下来，在实验前将细胞在无血清完全培养基中培养4小时，并用100μM GYY4137或抑制剂混合物（PG和AOAA，各1 mM）进行预处理，如图所示。在细胞中记录基础受体酪氨酸激酶活性20分钟，在添加150 ng/ml EGF后，使用xCELLigence RTCA DP系统（美国圣地亚哥ACEA生物科学公司）在2小时内进一步记录细胞，整合时间为1分钟。

抗体微阵列检测EGFR通路激酶过硫酸化

使用EGF途径磷酸化抗体阵列评估与EGFR途径相关的蛋白质的过硫化，该抗体阵列由214个与EGF途径（满月生物系统，CA）相关的抗体组成，重复执行。将玻璃条（条形码：4000026018、4000026019、4000026022和4000026023）与RT平衡1小时并干燥45分钟。然后用5%的BSA在TBST中以55 rpm的转速在RT下摇晃45分钟，将其堵塞。然后用TBST（两次）、TBS（两次2O（5次）。如前所述，经或不经100 ng EGF处理30分钟的HeLa细胞裂解液，并标记有过硫化物。然后用SDS（最终浓度为2%）将样品溶解在50 mM Hepes中，并用1%的BSA在TBS中进一步稀释60倍至6 ml。然后将玻璃条浸没在样品中，并以55 rpm的转速摇晃培养2小时。如前所述清洗载玻片，使其干燥，并在473 nm和635 nm下记录，使用Typhoon FLA 9500（GE Healthcare）。对每种抗体（玻璃条上的五倍体）的每个点的过硫化物水平进行平均。对于内标物GAPDH和β-肌动蛋白，其cy5（635nm）信号的强度调整为473nm信号。

免疫印迹法

用冷PBS将未经处理或专门处理的细胞洗涤两次，并在添加1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中收获。将细胞刮除，收集裂解物，用注射器和针头均质，并在30000 x克在4°C下保持5分钟。将透明裂解液转移到新试管中。使用DC分析（BioRad）测定裂解液的蛋白质浓度。蛋白质样品通过SDS-PAGE进行解析，并转移至硝化纤维素膜（GE Healthcare）。

使用的初级抗体：CBS（1:1000，sc-133154，Santa Cruz Biotechnology），MPST（1:4000，HPA001240，Sigma Aldrich），CTH（MEF细胞，1:4000），CTH（HeLa细胞，1:1000，sc-374249，Santa Cruz Biotechnology），p-ERK（1:1000，sc-7383，Santa Cruz Biotechnology），总ERK（1:1000，sc-271269，Santa Cruz Biotechnology），DJ-1（1:250，sc-55572，Santa Cruz Biotechnology）、DJ-1在C106氧化（1:1000，HCA024，BioRad）和β-微管蛋白（1:5000，T0198，Sigma-Aldrich）。物种特异性辣根缀合的二级抗体（1:5000，Santa Cruz Biotechnology）用于抗原检测，并使用Clarity™Western ECL底物（BioRad）在G:Box Chemi-XT4（Syngene）上进行可视化。

免疫沉淀法检测DJ-1过硫化、硫酰化和H后硫酰化2O（运行）2治疗

MEF电池（WT和CSE−/−)用100μM H处理2O（运行）2如前所述，对样品进行15或30分钟的oxPTM标记；使用NBF-Cl检测过硫化物，并与DCP-Bio1切换；使用DCP-Bio1进行硫酸标记；对于亚硫酸，使用NEM标记，然后使用BioDiaAlk标记。然后用SDS（最终浓度0.01%）在50 mM Hepes中沉淀蛋白质并以1 mg/ml的速度再次悬浮。样品在4°C下用抗DJ-1琼脂糖偶联抗体培养过夜（Santa Cruz Biotechnology，sc-55572 AC）。培养后，通过离心收集琼脂糖树脂（2000 x克，10分钟），并用添加0.001%吐温（3次）和10 mM TBS（两次）的10mM TBS清洗。用3.5%十二烷基硫酸钠在10 mM TBS中于95℃从树脂中洗脱DJ-1蛋白10 min。然后将其与补充有10%β-巯基乙醇（3当量样品：1当量缓冲液）的Laemmli缓冲液（4X）混合，并在55°C下培养过夜。通过离心（30000 x克，20 min），上清液通过SDS-PAGE溶解。进行蛋白质转移，然后在TBST中阻断1%的BSA。使用单克隆抗生物素-过氧化物酶结合抗体（1:1000，Sigma-Aldrich）进行检测，并在G:Box Chemi-XT4（Syngene）上使用Clarity™Western ECL底物（BioRad）进行可视化。

Trx催化还原S-硫氰酸（SSC）

人TRP14和Trx1基因的克隆与突变

通过从人成纤维细胞分离的mRNA中产生cDNA，获得了人TRP14的遗传序列。使用正向引物5'-ACCATCAC通过PCR扩增目标序列GGATCC公司自动液位计GCCCGCTATGAGGAGG-3'，含有BamHI限制性位点（下划线）和起始密码子（粗体），与反向引物5'-CCGG组合GGTACC公司G公司TTA公司ATCTTCAGAGAGAACACACTCTCCACA-3“3”包含一个KpnI限制位点（带下划线）和一个终止密码子（黑体字）。通过商业测序（GATC Biotech）验证了目标带的序列。将PCR产物连接到pQE80-L表达载体（Qiagen）中。人硫氧还蛋白1（Trx1）在大肠杆菌使用pET28a表达载体。采用PCR介导的定点突变法对C32S和C35S变异体进行诱变，并以Trx1-pET28a表达质粒为支架。

人TRP14和Trx1的表达与纯化

大肠杆菌用相应的表达质粒转化BL21（DE3）Rosetta细胞，并在37°C、140 rpm的LB培养基中培养，补充必要的抗生素，并生长至OD600= 0.5. 使用最终浓度为250μM的异丙基-β-ᴅ-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白质表达。TRP14的表达温度和旋转速度分别为30°C和120 rpm，Trx1变体的表达温度为18°C和120rpm；表达时间约为16小时。收集细胞并在添加完整的无EDTA蛋白酶抑制剂（Roche）的裂解缓冲液（50 mM磷酸钾，pH 7.4，250 mM氯化钠，10 mM咪唑）中进行裂解。使用蛋清溶菌酶（VWR）溶解细胞，并在乳化液中均质。用25%振幅的超声棒在10秒钟内破坏残余核酸。细胞裂解液以48000 x离心克并根据制造商的方案使用His-Pur-Ni-NTA超低琼脂（Thermo Fisher Scientific）分离His标记的蛋白质。使用添加250 mM咪唑的裂解缓冲液进行洗脱。使用SDS-PAGE和随后的考马斯亮蓝染色分析洗脱级分，并使用阴离子交换色谱法进一步纯化含有增加量的靶蛋白的级分（来源15Q，GE Healthcare；低盐缓冲液：50mM磷酸钠，pH 7.4；高盐缓冲液：50 mM磷酸钠，pH 7.4，1 M氯化钠）。洗脱以5个柱体积以上的梯度进行。使用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色再次分析洗脱组分。相关组分被缓冲液交换到储存缓冲液中（50 mM磷酸钠，pH 7.4，150 mM氯化钠，100μM DTT），在液氮中闪速冷冻并储存在−80°C下。蛋白质在解冻到相关实验缓冲液中后再次进行缓冲液交换。

用胱氨酸/SSC偶联检测Trx1/TRP14和TrxR

在Tecan Infinite M200平板读取器上测量NADPH氧化，记录hTrx和TRP14与胱氨酸和SSC的活性，设置为记录340 nm的吸收。在所有测量中使用了3μM hTrx1或TRP14、来自大鼠肝脏的30 nM TrxR（Sigma-Aldrich）和250μM NADPH。胱氨酸或SSC的浓度设置为1 mM。在340 nm处记录吸收，间隔10秒，持续900秒。A的初始速率340减少量是线性拟合的，NAPDH的消耗量随时间变化是使用NADPH消光系数ε来确定的340共6020 M−1厘米−1.

人Trx与SSC直接反应动力学

使用FP-8200荧光分光光度计（Carry Eclipse，Agilent）监测hTrx与过硫化半胱氨酸反应的动力学，激发波长为280 nm，最大发射波长为345 nm。酶的浓度保持在4μM，而底物浓度在25μM到100μM之间。给定伪一阶条件，观察到的速率常数k个光突发事件通过在Origin®分析软件中使用一阶指数衰减拟合，拟合给定SSC浓度下345 nm处的发射衰减，获得了。

Trx与SSC反应的超高分辨ESI-TOF质谱

将10μM人重组Trx、Trx C35S或Trx C32S与10μM SSC在pH 7.8的20 mM碳酸铵缓冲液中孵育5 min，并记录在能够至少40000 FWHM分辨率的maXis 5G（Bruker Daltonics）ESI-TOF MS上(Wedmann等人，2016).

MEF细胞应力分析

MEF电池（WT和CSE−/−)以5×10的速度镀成96个钢板4细胞/孔。用H处理细胞2O（运行）2,如前所述，24小时后，通过MTT试验评估细胞存活率(刘等，2015).

秀丽线虫应力分析

最初，通过将每种约100只幼成虫采集到NGM平板上，使蠕虫同步，并允许它们在20°C下产卵4小时以上。然后取下年轻成人，用M9缓冲液清洗剩余胚胎并从NGM板上收集，然后离心（850 x克，1分钟），用M9缓冲液冲洗3次。将得到的胚胎颗粒重新悬浮在12 ml M9缓冲液中，并在20°C下搅拌（100 rpm）24小时。收集同步的L1蠕虫，离心（850 x克1分钟），并重新悬浮在S-基底缓冲液中。测定L1蠕虫的数量和同步性，并将蠕虫转移到Erlenmeyer，在S-Basal缓冲液中稀释相应数量的HB101，以进行最终浓缩。60条蠕虫/10 mg HB101/ml S-基础缓冲液。然后在20°C下搅拌（115rpm）培养48小时。然后收集蠕虫，离心（400 rpm，1 min），用M9缓冲液清洗3次，并重新悬浮在M9缓冲中。

对于蠕虫预处理的实验，将同步的年轻成虫（如上所述）转移到含有12 ml M9缓冲液的锥形瓶中，其中加入GYY4137（最终浓度500μM）或AP39（最终浓度100 nM）。然后在20°C下搅拌（115 rpm）将蠕虫培养3小时。将蜗杆离心（400 rpm，1 min），并重新悬浮在M9缓冲液中。为了评估CTH对抗逆性的影响，将水合百草枯（最终浓度60 mM）或亚砷酸钠（最终浓度5 mM）添加到同步化幼成虫悬浮液中，并镀在96孔板上，每个孔约有5-10个虫。通过在5–6小时内计数死蠕虫，同时在20°C下搅拌培养皿（110 rpm），监测存活率。

酵母应激试验和H2S生产

通过检测5μl早期指数期培养物（OD600=0.5）不同菌株酿酒酵母，依次稀释（约3.5×104至3.5个细胞），在含有添加不同浓度H的YPD培养基的平板上2O（运行）2（0、1 mM、2 mM和5 mM）。在30°C下孵育24小时和48小时后记录生长。通过在YPD培养基（固定相细胞）中制备过夜培养物进行存活分析，通过稀释至OD，从中设置实验培养物600=2，最终体积为5 ml，含或不含相应浓度的H2O（运行）2（0、10 mM和20 mM）。随后在30°C下搅拌（180 rpm），在培养管中培养培养物27小时。然后在PBS中清洗酵母细胞一次，并通过离心（5000 x克，3分钟）。然后将细胞重新悬浮在添加2μM碘化丙啶的PBS中，浓度为1×106细胞/ml，并在黑暗中孵育5分钟。在BD Accuri™C6（BD Biosciences）上使用每种条件150000个细胞进行流式细胞术分析，并使用CFlow Plus软件分析结果。用于H的定量2S水平，隔夜培养物用PBS清洗并按规定稀释，以进行存活试验。细胞悬浮液与20μM MeRho-Az传感器在30°C下孵育45分钟，并在BD Accuri™C6（BD Biosciences）上通过流式细胞仪进行分析。

秀丽线虫寿命

在寿命实验中，通过将5-6只幼成虫转移到中板上，并让它们在20°C下产卵3小时以上，获得了同步虫群。在20°C下进行寿命测量，在繁殖期间每天转移蠕虫。用白金丝轻轻戳一下，动物无法移动，导致死亡。对于使用1 mM硫代硫酸钠或5 mM 2-脱氧-D-葡萄糖（DOG）进行寿命分析，每隔一天制备含有NGM琼脂处理的新平板。除非另有说明，否则至少重复两次寿命测量。

雄性大鼠大脑的免疫组织化学

将大脑固定在4%多聚甲醛中24小时，在一系列浓度不断增加的乙醇（30%–100%）中脱水，在二甲苯中启蒙并嵌入Histowax®（Histolab Product AB，瑞典哥德堡）。每个大脑的矢状面在旋转切片机（RM 2125RT Leica Microsystems，Wetzlar，德国）上以5μm的厚度进行切片。切片放在Superfrost Ultra Plus®制造的载玻片上，用于免疫组织化学染色。组织脱蜡后，将脑切片暴露于热诱导抗原回收中，以去除目标抗原。将载玻片置于容器中，用0.01 mol/l柠檬酸钠缓冲液pH 6.0覆盖，然后在微波炉中750 W加热3×7 min。然后，用0.3%H培养切片2O（运行）2在MeOH中放置15分钟以阻断内源性过氧化物酶。载玻片在PBS（pH 7.4）中洗涤，并通过与正常猪（1:10，X0901，Dako）和驴血清（1:10，X0903，Abcam）在RT下孵育45分钟来减少非特异性背景染色。接下来，切片与一级抗体孵育；CBS（1:200，sc-67154，Santa Cruz Biotechnology）、MPST（1:500，HPA001240，Sigma-Aldrich）或带有CTH/CSE抗体（1:200、sc-365382，Santa Cruz Bietechnologies），在4°C下过夜。对于阴性对照，用PBS代替第一抗体。在PBS中洗涤5分钟后，将脑组织切片与猪抗兔（1:100，P0399，Dako）和驴抗小鼠IgG HRP（1:100，ab6820，Abcam）在RT下孵育1小时。在PBS中清洗载玻片，并使用制造商建议浓度的达科液体3,3′-二氨基联苯胺四氯化氢（DAB）底物显色体系（Dako）进行可视化。苏木精用作复染，载玻片安装在DPX培养基（Sigma-Aldrich）中。

量化和统计分析

这些实验至少由两名不同的研究人员进行了三次。关键方法学实验由三个不同实验室的至少三名不同研究人员验证，所有数据均以平均值±SD表示。使用星号（*）或数字符号（#）与未配对t检验比较蛋白质表达水平、过硫化、磺酰化和亚磺酰化度。未排除任何结果/数据点。在整个研究过程中，对于这两个符号，单个符号表示p值<0.05，两个符号表示p数值<0.01。使用PEAKS Studio分析质谱数据。使用Kaplan-Meier生存分析对寿命数据进行分析，以检测统计差异。对于寿命试验，每次试验至少使用100个蠕虫。使用GraphPad Prism 5.0、Origin 8和Microsoft Excel绘制数据。

数据和代码可用性

与EGFR通路激酶过硫化抗体微阵列检测相对应的原始数据代表了dimedone开关方法的全新应用，因此可根据要求从相应作者处获得更多详细信息。蛋白质组数据用于图S2C存储在数据S1,S2系列和用于图S3H,我在里面数据S3,S4系列所有凝胶内过硫化以及Western blot磺基化和磺酰化数据均在主要和支持图中报告。其他原始数据可从DOI:10.17632/pw2wz39tsk.1获取。

​

关键资源表

试剂或资源来源标识符
抗体
抗β-肌动蛋白，小鼠单克隆圣克鲁斯生物技术分类号sc-47778
抗β-微管蛋白，小鼠单克隆抗体西格玛-奥尔德里奇类别号T0198
抗GAPDH，小鼠单克隆西格玛-奥尔德里奇目录号：G8795
抗-HSP70，小鼠单克隆阿布卡姆类别号Ab5439
抗KEAP1 P586，兔多克隆信号传递类别#4678
抗eNOS，兔单克隆信号传递分类号32027
抗停车蛋白，小鼠单克隆圣克鲁斯生物技术分类号sc-136989
抗SOD-2，小鼠单克隆圣克鲁斯生物技术分类号sc-137254
抗-TST，兔多克隆GeneTex公司目录号GTX114858
抗SQRDL，兔多克隆西格玛-奥尔德里奇类别号HPA017079
抗-PTEN，小鼠单克隆圣克鲁斯生物技术分类号sc-7974
抗-PTP1B，小鼠单克隆圣克鲁斯生物技术目录号sc-133259
抗SH-PTP2，小鼠单克隆圣克鲁斯生物技术分类号sc-7384
抗EGFR，兔多克隆圣克鲁斯生物技术目录号sc-03-G
抗-CBS，小鼠单克隆圣克鲁斯生物技术分类号sc-133154
抗CBS，兔多克隆圣克鲁斯生物技术分类号sc-67154
抗MPST，兔多克隆西格玛-奥尔德里奇类别号HPA001240
抗-CTH，兔子来自斯奈德教授的实验室（约翰·霍普金斯大学医学院）(Paul等人，2014)
抗-CTH，小鼠单克隆圣克鲁斯生物技术分类号sc-365382
抗p-ERK，小鼠单克隆圣克鲁斯生物技术目录号sc-7383
抗ERK 1，小鼠单克隆圣克鲁斯生物技术分类号sc-271269
抗-DJ-1，小鼠单克隆圣克鲁斯生物技术分类号sc-55572
抗-DJ-1 AC，小鼠单克隆圣克鲁斯生物技术类别号sc-55572 AC
抗DJ-1（氧化At C106），小鼠单克隆抗体BioRad公司类别号HCA024
抗生物素过氧化物酶，小鼠单克隆西格玛-奥尔德里奇类别号A0185
抗-Dimeone，兔多克隆卡罗尔博士的实验室（斯克里普斯研究所）(Seo和Carroll，2009年)
小鼠IgGκBP-HRP圣克鲁斯生物技术分类号sc-516102
小鼠抗兔IgG-HRP圣克鲁斯生物技术类别号sc-2357
猪抗兔IgG-HRP，多克隆丹麦达科类别号P0399
驴抗鼠IgG-HRP，多克隆英国剑桥Abcam类别号ab6820
链亲和素蛋白，DyLight 488赛默飞世尔科技公司类别号21832
Cy®5-链亲和素西格玛-奥尔德里奇目录号GEPA45001
EGF途径磷酸抗体阵列满月生物系统类别号PEG214
细菌和病毒菌株
OP50-1型隐杆线虫遗传中心不适用
HB101型隐杆线虫遗传中心不适用
大肠杆菌MG1655（pTrc99a）来自西班牙冈萨雷斯-佐恩实验室不适用
大肠杆菌MG1655（pSB74）来自西班牙冈萨雷斯-佐恩实验室不适用
大肠杆菌BL21 DE3罗塞塔诺瓦根分类号70954-3
生物样品
来自C57BL/6 WT和CSE的肾脏−/−老鼠来自Maik Gollasch教授（Charité医学院）(Markó等人，2016年)
D.黑腹果蝇：y1w个1118来自Ody Sibon教授（格罗宁根大学）(Snijder等人，2015年)
D.黑腹果蝇：Eip55E来自Ody Sibon教授（格罗宁根大学）(Snijder等人，2015年)
化学品、肽和重组蛋白质
Chelex-100型西格玛-奥尔德里奇类别号C7901
硫化钠西格玛-奥尔德里奇类别号407410
GYY4137型(Alexander等人，2015年)不适用
第39页(Le Trionnaire等人，2014年)不适用
D-胱氨酸西格玛-奥尔德里奇分类号30095
DL-丙二醇甘氨酸西格玛-奥尔德里奇分类号P7888
O-（羧甲基）羟胺半盐酸盐（AOAA）西格玛-奥尔德里奇类别号C13408
过氧化氢溶液西格玛-奥尔德里奇类别号216763
莫能新钠盐西格玛-奥尔德里奇产品目录号M5273-1G
伊拉斯廷西格玛-奥尔德里奇类别号E7781
S公司-硫半胱氨酸西格玛-奥尔德里奇类别号C2196
胱氨酸西格玛-奥尔德里奇类别号30200
咪唑Carl Roth股份有限公司类别号3899.4
异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷Inalco制药公司货号1758-1400
二硫苏糖醇GE Healthcare公司目录号17-1318-02
4-氯-7-硝基苯并呋喃西格玛-奥尔德里奇分类号163260
Dimedone公司西格玛-奥尔德里奇目录号D153303
DCP-生物1喀拉法斯特类别号EE0028
DAz-2型开曼化学公司产品目录号13382
生物二烷基(Akter等人，2018年)不适用
迪亚尔克(Akter等人，2018年)不适用
氰基5炔烃发光探针产品目录号FP-OO5590
铜（II）-待定发光探针类别号21050
L-抗坏血酸西格玛-奥尔德里奇分类号795437
5-氟-2′-脱氧尿苷西格玛-奥尔德里奇#功能0503
Nmc-青霉素(Artaud和Galardon，2014年)不适用
EGF人重组PromoKine分类号60170
VEGF-165，人，重组PromoCell（促销单元格）类别号C-64422
人胰岛素西格玛-奥尔德里奇分类号：I0908
多聚甲醛西格玛-奥尔德里奇类别号P6148
硫代硫酸钠普罗拉波类别27 910.291
盐酸百草枯水合物西格玛-奥尔德里奇目录号36541
亚砷酸钠西格玛-奥尔德里奇分类号S7400
2-脱氧-D-葡萄糖西格玛-奥尔德里奇目录号D8375
噻唑蓝四唑溴西格玛-奥尔德里奇类别号M5655
蛋白酶抑制剂西格玛-奥尔德里奇类别号P8340
His-Pur Ni-NTA超流琼脂糖赛默飞世尔科技公司类别号25216
链霉亲和素磁珠西格玛-奥尔德里奇分类号11 641 778 001
中性抗生物素琼脂糖树脂赛默飞世尔科技公司目录号29201
高效中性抗生物素琼脂糖树脂赛默飞世尔科技公司类别号29202
猪胰腺胰蛋白酶西格玛-奥尔德里奇类别号T6567
糜蛋白酶测序等级西格玛-奥尔德里奇分类号0000000 11418467001
人血清白蛋白（HSA）西格玛-奥尔德里奇类别号A1887
GAPDH公司西格玛-奥尔德里奇类别号G2267
牛肝中的锰（TST）西格玛-奥尔德里奇类别号R1756
锰超氧化物歧化酶创意生物集市类别号SOD2-1039H
细胞色素c西格玛-奥尔德里奇类别号30398
Xanthine公司西格玛-奥尔德里奇类别号X0626
PTP1B人重组英国剑桥Abcam类别号ab51277
黄嘌呤氧化酶西格玛-奥尔德里奇类别号X1875
大鼠肝脏硫氧还蛋白还原酶（TrxR）西格玛-奥尔德里奇目录号T9698
TRP14（来自人类成纤维细胞cDNA）对于本文不适用
小时色氨酸C32S对于本文不适用
小时色氨酸C35S对于本文不适用
小时Trx1型对于本文不适用
NADPH公司西格玛-奥尔德里奇分类号N5130
DAPI公司Euromedex公司类别号1050-A
MeRho-Az公司来自Michael D.Pluth的实验室（俄勒冈州尤金化学与生物化学系）不适用
碘化丙啶西格玛-奥尔德里奇类别号P4864
Histowax®（历史蜡®）瑞典Historab Product AB货号00405
正常猪血清丹麦达科类别号X0901
正常驴血清英国剑桥Abcam分类号X0903
3,3′-二氨基联苯胺四氯化氢（DAB）Dako North America，Inc.美国加利福尼亚州卡宾里亚分类号K3468
DPX介质西格玛-奥尔德里奇分类号06522
实验模型：细胞系
人类：HeLaECACC公司分类号93021013
人类：HUVECPromoCell（促销单元格）类别号C-12203
人类：SH-SY5YECACC公司分类号94030304
人类：成纤维细胞（男性）科里埃尔研究所AG08790和AG14245
小鼠：MEF WT（WT）（雄性）来自斯奈德教授的实验室（约翰·霍普金斯大学医学院）(Sbodio等人，2016年)
鼠标：MEF CSE−/−（男性）来自斯奈德教授的实验室（约翰·霍普金斯大学医学院）(Sbodio等人，2016年)
小鼠：纹状体祖细胞ST卫生部第7季度/第7季度（男性）M.MacDonald（马萨诸塞州波士顿总医院）不适用
小鼠：纹状体祖细胞ST卫生部Q111/Q111（男性）M.MacDonald（马萨诸塞州波士顿马萨诸塞州总医院）不适用
实验模型：线虫突变体
野生型Bristol N2隐杆线虫遗传中心不适用
cth-1（ok3319）V隐杆线虫遗传中心VC2569型
mpst-3（tm4387）伏日本MEXT国家生物资源项目MITANI实验室FX04387型
吃-2（tm5786）II日本MEXT国家生物资源项目MITANI实验室FX19451型
eat-2（tm5786）II；cth-1（ok3319）V这篇论文不适用
eat-2（tm5786）II；mpst-3（tm4387）伏这篇论文不适用
实验模型：菌株/生物体
酿酒酵母：BY4742（重量）欧洲围巾不适用
酿酒酵母:Δcys4欧洲围巾ACCNO Y16696号
酿酒酵母:Δcys3欧洲围巾ACCNO Y16865号
酿酒酵母:Δtum1欧洲丝巾ACCNO Y12507号
雄性Wistar大鼠塞尔维亚贝尔格莱德“Siniša Stanković”生物研究所不适用
雄性C57BL/6J小鼠查尔斯河实验室（CRL）NIA老龄化群体资源不适用
雄性C57BL/6小鼠约翰霍普金斯大学医学院药理学和分子科学系，马里兰州巴尔的摩不适用
寡核苷酸
5'-GAAGGATATACCATGGTGAAGC-3'（向前）西格玛-奥尔德里奇小时pET28a中的Trx
5'-CGGATCTCAGTGGTGGTG-3'（修订版）西格玛-奥尔德里奇小时pET28a中的Trx
5'-CACGTGGTCTGTGGCCTG-3'（向前）西格玛-奥尔德里奇小时Trx C32S诱变
5'-CAAGGCCCAGACCACGTG-3'（修订版）西格玛-奥尔德里奇小时Trx C32S诱变
5’-GTGTGCCTTCCAAAATGATCAAG-3’（前）西格玛-奥尔德里奇小时Trx C35S突变
5'-CTTGATCATTTTGGAAGGCCCACAC-3'（版次）西格玛-奥尔德里奇小时Trx C35S突变
5'-ACCATCACGGATCCATGGCCCGCTATGGAGG-3'（前）西格玛-奥尔德里奇小时pQE-80L中的TRP14
5'-CCGGGTACGTTAATCTAATCTTCAGAGAACAAACATTCCACAG-3'（修订）西格玛-奥尔德里奇小时pQE-80L中的TRP14
重组DNA
质粒：pET-28a（+）诺瓦根分类号69864-3
质粒：pQE-80L凯杰不适用
软件和算法
图像J国家卫生研究院https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad棱镜5.0GraphPad软件https://www.graphpad.com
PEAKS工作室生物信息解决方案公司。http://www.bioinfor.com（生物信息网）/
原始Pro 8原始实验室https://www.originalab.com网站/
RTCA软件版本2.0ACEA生物科学公司。https://www.aceabio.com/products/rtca-dp/
CFLow Plus版本1.0.202.1BD生物科学http://www.bdbiosciences.com

补充材料

更正的支持数字表

单击此处查看。（13M，pdf）

数据1

数据集S1：用胰蛋白酶消化过硫TST的MS/MS数据。与相关图2.

单击此处查看。（81K，xls）

数据2

数据集S2：用糜蛋白酶消化过硫化TST的MS/MS数据。与相关图2.

单击此处查看。（52K，xls）

数据3

数据集S3：用胰蛋白酶消化过硫MnSOD的MS/MS数据。与相关图3.

单击此处查看。（187K，xls）

数据5

数据集S5：蛋白质过硫化抗体微阵列分析。与相关图5.

单击此处查看。（14K，xlsx）

数据4

数据集S4：用糜蛋白酶消化过硫化MnSOD的MS/MS数据。与相关图3.

单击此处查看。（93K，xls）

致谢

作者要感谢Michel Toledano博士对手稿的仔细阅读和有益的讨论，以及Bertrand Daignan Fornier博士对酵母实验的帮助。

基金：这项工作得到了ATIP-Avenir拨款、法国政府在“未来投资”项目IdEx Bordeaux（ANR-10-IdEx-03-02）框架内以及FRM（DEQ20180339181）的支持。MW感谢英国MRC（MR/M022706/1）、Brian Ridge奖学金（RT）和英国Northcott Devon医学研究基金会的支持。MM和VM得到了塞尔维亚共和国教育、科学和技术发展部的支持（173009）。KSC承认NIH（GM102187）的支持，以及德国DFG（SFB1218 TP B08）的GS和JBK支持。来自AHA/Allen脑健康和认知障碍团队（SHS及其同事）倡议的项目19PABH134580006获得认可。

脚注

利益声明：MW和埃克塞特大学拥有针对线粒体和其他硫化氢传递分子的治疗和农业用途专利。所有其他作者都声明没有相互竞争的利益。

参考文献

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