孕激素缺乏通过补体激活促进小胶质细胞的回路特异性突触修剪

小胶质细胞内溶酶体途径中PGRN的特征

研究小胶质细胞如何促进溶酶体和先天免疫反应基因的上调Grn公司^−/−大脑，我们分析了4个月和18个月大的小胶质细胞的溶酶体形态Grn公司^+/+和Grn公司^−/−大脑。使用CD68作为溶酶体标记物，使用Iba-1作为小胶质细胞标记物，我们发现Grn公司^−/−小胶质细胞在18个月大时溶酶体大小显著增加(图2A-E). 虽然小胶质细胞在4个月大Grn公司^+/+和Grn公司^−/−大脑的溶酶体大小没有差异，用神经毒素MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）处理后，CD68+溶酶体的大小显著增加Grn公司^−/−小胶质细胞(图2E). MPTP诱导的小胶质细胞溶酶体大小也有类似的增加Cd11b-核心；Grn公司^上下突变体，表明溶酶体缺陷Grn公司^−/−小胶质细胞可能与其激活状态紧密耦合。

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图2

溶酶体缺陷和补体生成增加Grn公司^−/−小胶质细胞

（A）–D） 4月龄和18月龄儿童丘脑腹侧Iba-1+小胶质细胞的共焦图像Grn公司^+/+和Grn公司^−/−大脑显示细胞质中有CD68+溶酶体。图像是从捕获的Grn公司^+/+和Grn公司^−/−大脑（每个年龄3个），并使用Imaris软件进行溶酶体三维重建。（E） 4月龄和18月龄丘脑腹侧CD68+溶酶体体积的定量Grn公司^+/+和Grn公司^−/−4个月大的小鼠大脑（左侧面板）Grn公司^+/+和Grn公司^−/−MPTP治疗后的小鼠大脑（右侧面板）。体积表示为μm^三每个小胶质细胞。学生的t吨测试，每组3个。*表示第页< 0.05, **第页<0.01，以及****第页< 0.001. （F）–一） 新生儿原发性小胶质细胞培养的共焦图像Grn公司^+/+和Grn公司^−/−老鼠的大脑。小胶质细胞标记有Lamp1/PGRN/Rab7或Lamp1/PGRN/Sortilin抗体。箭头表示每个小胶质细胞中的区域，其中荧光信号强度图是使用尼康NIS-Elements获得的。Lamp1+（绿色）、PGRN+（红色）、Rab7+（蓝色）和Sortilin+（蓝色Grn公司^+/+和Grn公司^−/−小胶质细胞。F′和H′中的箭头表示Lamp1+的部分重叠；PGRN+或PGRN+；分别发出分拣+信号。（J）–K） Lamp1+、Sortilin+和Rab7+囊泡大小的量化Grn公司^+/+和Grn公司^−/−小胶质细胞。学生的t吨测试，****表示第页< 0.001. （五十） 图中显示了培养小胶质细胞中的DQ-BSA分析。开放的圆圈是猝灭的DQ-BSA，绿色的圆圈是去猝灭的DQ-BSA，红色的圆圈是与568nm荧光团缀合的BSA。（百万）–P） 的代表性图像Grn公司^+/+和Grn公司^−/−小胶质细胞用DQ-BSA孵育30′后（0小时）或洗涤4小时后（4小时）。P中的比例尺为10μm。每个面板右侧的插图表示M-P中方框区域的放大图像。P中的箭头表示Lamp1+溶酶体中的去猝灭DQ-BSA信号。（Q） 去猝灭DQ-BSA最大荧光强度（M.F.I.）的量化Grn公司^+/+（n=5）和Grn公司^−/−小胶质细胞（n=7）。巴非霉素抑制溶酶体酸化和蛋白质降解Grn公司^+/+和Grn公司^−/−小胶质细胞。双向方差分析，*表示第页< 0.05. 另请参见图S2.

为了进一步表征Grn公司^−/−我们检测了PGRN的亚细胞定位以及PGRN缺失对溶酶体形态的影响。利用共聚焦显微镜和PGRN的荧光信号强度图以及早期内体（Rab5）、晚期内体（Rab7）、转高尔基网络（Sortilin）和早期溶酶体（Lamp1）的标记，我们发现PGRN与Rab5+囊泡在细胞内没有共定位Grn公司^+/+小胶质细胞（数据未显示），但在高尔基体和与Rab7+、Sortilin+和Lamp1+囊泡直接相邻并部分重叠的囊泡中检测到(图2F，F′，H，H′，箭头和图S2). 相反，Grn公司^−/−小胶质细胞显示许多Lamp1+小泡增大，共同表达Rab7或Sortilin(图2G，G′，I，I′、箭头和图S2).

NIH ImageJ定量分析进一步显示，Rab7+囊泡在Grn公司^−/−小胶质细胞，而Lamp1+或Sortilin+囊泡的大小显著增加(图2J–K和图S2). 鉴于小胶质细胞的吞噬活性，我们询问PGRN的丢失是否会改变溶酶体的功能。为此，我们孵化Grn公司^+/+和Grn公司^−/−带有BSA的小胶质细胞与荧光团结合，在594nm处发出30′的信号，在Grn公司^+/+和Grn公司^−/−小胶质细胞内吞BSA（数据未显示）。然后我们孵化Grn公司^+/+和Grn公司^−/−带有绿色BODIPY染料的小胶质细胞与BSA（DQ-BSA）结合（10μg/ml），在酸性溶酶体小室中进行蛋白水解后，小胶质细胞会去猝灭并释放明亮的荧光信号(图2L)(巴斯克斯和科伦坡，2009年). 与DQ-BSA孵育30′后，在0、1、2、3和4小时用共焦显微镜和流式细胞术监测小胶质细胞中去猝灭的DQ-BSA信号的细胞内转运。30′孵育结束时，Grn公司^−/−小胶质细胞的去淬DQ-BSA含量比Grn公司^+/+小胶质细胞，大多数位于Lamp1+和Rab7+囊泡(图2M、O、Q). 有趣的是，洗后4小时，Grn公司^+/+小胶质细胞在Lamp1+囊泡内仍保留了超过75%的去猝灭DQ-BSA信号(图2N，Q). 相反，只有49.3%的去猝灭DQ-BSA信号保留在Lamp1+囊泡中Grn公司^−/−小胶质细胞(图2P，Q). 这些结果表明Grn公司^−/−小胶质细胞通过内溶酶体途径更有效地处理材料。为了进一步证明溶酶体在Grn公司^−/−小胶质细胞确实完好无损，我们使用了巴非霉素A1（5nM），一种H型液泡⁺-ATP酶抑制剂，阻止溶酶体酸化和蛋白质降解(吉森等人，1991年). 这种治疗完全阻断了DQ-BSA信号Grn公司^+/+和Grn公司^−/−小胶质细胞，无明显差异(图2Q).

补体蛋白C1qa通过以下途径促进突触修剪Grn公司^−/−小胶质细胞

研究溶酶体缺陷的功能后果Grn公司^−/−小胶质细胞，我们询问这种表型是否促进先天免疫激活，从而促进神经退行性变。在先天免疫应答基因中Grn公司^−/−大脑，我们关注补体系统，因为补体介导的突触剪除是调节神经回路功能的关键机制(Schafer等人，2012年;Stephan等人，2013年;Stevens等人，2007年). 此外，异常溶酶体介导的补体蛋白C3裂解诱导T淋巴细胞产生促炎细胞因子，并参与自身免疫性疾病的发病机制(Liszewski等人，2013年). 为了确定补体在PGRN缺乏症中的作用，我们使用来自Grn公司^+/+和Grn公司^−/−初级皮质神经元和新生小胶质细胞，并显示C1qa公司和C3类mRNA水平在Grn公司^−/−小胶质细胞和脂多糖（LPS）治疗后进一步上调(图S3A–B). 使用C1qa、C3和C3b特异性抗体进行的FACS分析证实，新生儿原发性小胶质细胞中有更丰富的补体Grn公司^−/−正常培养条件下和LPS处理后的小鼠大脑(图S3C–D). 最后，共焦显微镜显示Grn公司^−/−新生儿急性分离的小胶质细胞Grn公司^−/−小鼠大脑表达丰富的C3蛋白，与溶酶体标记Lamp1和分泌标记Grasp55共定位(图S3E-H)支持C3蛋白在溶酶体中加工并通过分泌途径释放。此外，12个月大的小胶质细胞Grn公司^−/−大脑细胞质中含有丰富的C1qa，而小胶质细胞Grn公司^+/+大脑中C1qa表达很低(图S3I–N).

鉴于C1qa和C3在Grn公司^−/−小胶质细胞，我们推断补体生成增加和溶酶体基因上调可能允许Grn公司^−/−小胶质细胞可以更有效地修剪突触。为了测试这一点，我们设计了一个共培养系统，其中野生型皮质神经元以低密度镀膜，使突触在14天内均匀发育在体外（第14部分）(图3A). 同时，小胶质细胞培养自Grn公司^+/+和Grn公司^−/−新生脑，并在DIV14以1:3的比例加入皮层神经元。在收集进行免疫染色和分析之前，共培养持续了3天以上(图3B–C). 为了显示小胶质细胞在突触修剪中的作用，我们使用改良的Sholl分析来量化小胶质细胞胞体周围突触素+突触的数量(图3C). 我们还使用Imaris软件对共焦图像进行三维重建，以量化C1qa标记的突触数量和小胶质细胞溶酶体内的突触数。

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图3

增加的突触修剪活动Grn公司^−/−小胶质细胞需要C1qa

（AC）显示小胶质细胞-神经元共同培养的图表和Sholl分析，以量化小胶质细胞周围的突触。（D）–S） 共焦图像显示周围存在突触（SPH+）Grn公司^+/+,Grn公司^−/−,C1qa公司^−/−和Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−小胶质细胞（Iba1+）（D，H，L，P）。低倍镜下小胶质细胞-神经元共培养的Imaris 3D图像重建（E，I，M，Q）。高倍镜显示小胶质细胞（G，K，O，S）CD68+溶酶体内存在C1qa紧邻突触（F，J，N，R）和C1qa标记突触。D中标尺20μm，E中标尺5μm，F和G中标尺1μm。（T）周围突触密度Grn公司^+/+,Grn公司^−/−,C1qa公司^−/−和Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−小胶质细胞***第页< 0.005, ****第页<0.001，双向方差分析，所有基因型的n=4。（U–五） 量化小胶质细胞外C1qa标记突触的百分比（U）和小胶质细胞内SPH+突触的数量（V）*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.005，学生的t吨检验，每个基因型n=4。另请参见图S3.

在Grn公司^+/+小胶质细胞与神经元共培养时，小胶质细胞胞体附近的突触密度较低，远离小胶质细胞的区域突触密度逐渐增加(图3D，T[黑线]）。大约3%的突触Grn公司^+/+小胶质细胞-神经元联合培养与C1qa阳性信号相邻(图3E-F)这表明这些突触被C1qa“标记”以便移除。事实上，在CD68+溶酶体的细胞质中发现了几个突触Grn公司^+/+小胶质细胞(图3G). 相反，周围的突触密度Grn公司^−/−小胶质细胞明显低于周围Grn公司^+/+小胶质细胞(图3H、T[红线]）。此外，外面有更多的C1qa阳性突触Grn公司^−/−小胶质细胞和CD68+溶酶体内部Grn公司^−/−小胶质细胞(图3I–K、T–V).

在C1qa公司^−/−小胶质细胞与神经元共培养时，小胶质细胞周围的突触密度要高得多，尤其是在半径30μm范围内(图3L–M，T[蓝线]）。在突触附近或突触内未检测到C1qa，这再次支持了C1qa是由小胶质细胞而非神经元产生的观点(图3N、U). CD68+溶酶体内突触的数量C1qa公司^−/−小胶质细胞也显著低于Grn公司^−/−小胶质细胞(图3O、V)这表明C1qa的缺失降低了小胶质细胞的突触修剪活性。为了确定C1qa的丢失是否可以通过以下方式减轻突触修剪Grn公司^−/−小胶质细胞，我们使用来自Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−新生小鼠的突触密度Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−小胶质细胞确实比Grn公司^−/−和Grn公司^+/+小胶质细胞-神经元共培养(图3P，T[绿线]）。与C1qa公司^−/−小胶质细胞，在突触附近或处未检测到C1qaGrn公司^−/−;C1qa公司^−/−小胶质细胞与神经元的共培养，以及溶酶体内突触的数量Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−小胶质细胞也减少了(图3R–V). 总之，这些结果支持C1qa在Grn公司^−/−小胶质细胞促进，而C1qa的丢失Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−小胶质细胞减少突触修剪活动。

年龄相关补体激活Grn公司^−/−丘脑突触

观察到突触修剪活动增加Grn公司^−/−小胶质细胞，我们问是否在Grn公司^−/−补体和小胶质细胞的增加对小鼠大脑的影响更为严重，以及这可能如何导致神经退化。为了验证这一点，我们使用来自12个月大的大脑皮层、海马、尾状核/壳核、小脑和丘脑的mRNA进行了QRT-PCRGrn公司^+/+和Grn公司^−/−大脑，并表明C1qa公司和C3类mRNA在丘脑中最为丰富Grn公司^−/−大脑，随年龄增长(图4A–D). 此外，western blot显示C1qa和C3裂解产物iC3b在小鼠丘脑中均呈年龄依赖性上调Grn公司^−/−老鼠(图4E-F).

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图4

老年人丘脑腹侧突触C1qa的年龄依赖性积累Grn公司^−/−老鼠

（A）–B） QRT-PCR检测C1qa公司和C3类12个月大婴儿大脑皮层（CTX）、海马（HIP）、尾壳核（CP）、小脑（CRB）和丘脑（THAL）中的mRNAGrn公司^+/+和Grn公司^−/−老鼠。（C）–D） QRT-PCR显示C1qa公司和C3类4月龄、9月龄、12月龄和18月龄丘脑mRNA的表达Grn公司^−/−老鼠。（E）–F） 蛋白质印迹显示4、9和18个月大的丘脑中C1qa和C3蛋白的相对丰度Grn公司^+/+和Grn公司^−/−老鼠*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.005，学生t吨测试。误差条表示s.e.m.n=每年龄3Grn公司^+/+和Grn公司^−/−老鼠。（G–J） 4个月龄和18个月龄儿童的免疫染色Grn公司^+/+和Grn公司^−/−小鼠大脑检测VPM和VPL丘脑核团（虚线区域）中的C1qa信号。G中的比例尺为500μm。（K）–P） 使用神经标记物TuJ1和C1qa抗体对12个月大的腹侧丘脑进行共聚焦成像Grn公司^+/+和Grn公司^−/−老鼠。P中的比例尺为10μm。（问）–V） 12个月大鼠腹侧丘脑突触素和C1qa的共定位Grn公司^+/+和Grn公司^−/−老鼠。V中的比例尺为10μm。（W–十） 免疫金EM检测12个月大婴儿腹侧丘脑突触中的C1qa沉积Grn公司^+/+和Grn公司^−/−老鼠。比例尺为0.5μm。（Y） 使用4个月龄、9个月龄和16个月龄突触体的蛋白质印迹Grn公司^+/+和Grn公司^−/−大脑检测C1qa和裂解C3蛋白。

鉴于补体在突触修剪中的作用，我们询问C1qa和C3是沉积在突触附近还是在突触处体内为了解决这一问题，我们进行了免疫染色，并在丘脑腹侧显示出非常低的C1qa信号Grn公司^+/+4月龄和18月龄小鼠(图4G–H). 相反，C1qa染色强度在丘脑腹侧核周围显示适度增加Grn公司^−/−4个月大的小鼠，18个月大时增加更显著(图4I–J). 然而，在Grn公司^+/+或Grn公司^−/−丘脑神经元，在细胞体和突起周围的神经膜中发现丰富的C1qaGrn公司^−/−神经元(图4K–P).

为了测试C1qa是否沉积在Grn公司^−/−大脑，我们使用C1qa抗体和突触前标记物突触素（SPH）进行双重标记。与我们的预测一致，大多数C1qa信号都与丘脑的SPH+点状突起非常接近Grn公司^−/−老鼠。在神经突触附近没有检测到C1qa信号Grn公司^+/+大脑(图4Q-V). 此外，免疫金电子显微镜（IEM）显示，C1qa紧邻神经突触Grn公司^−/−丘脑，但不在Grn公司^+/+丘脑(图4W–X). 最后，为补体在突触的沉积提供生化证据Grn公司^−/−我们用不连续蔗糖梯度法分离4个月龄、9个月龄和16个月龄小鼠的突触体Grn公司^+/+和Grn公司^−/−小鼠大脑(Carlin等人，1980年)，并且在来自Grn公司^−/−大脑(图4Y).

在中卸下C1qaGrn公司^−/−;C1qa公司^−/−小鼠保护突触丧失，恢复丘脑微电路功能，减轻OCD样行为，提高生存率

为了确定突触丢失是否是Grn公司^−/−小鼠大脑以及C1qa的去除是否可以保护突触丢失，我们建立了一个老化队列Grn公司^+/+,Grn公司^−/−,C1qa公司^−/−和Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−并检测了2至19个月龄小鼠腹侧丘脑的微胶质增生和突触密度。在衰老过程中，大脑腹侧丘脑小胶质细胞的数量Grn公司^+/+和C1qa公司^−/−小鼠只表现出非常轻微的增加，细胞质不明显，突起薄而精细，与静止的小胶质细胞形态一致(图5A-B、E-F、I). 相反，Grn公司^−/−小鼠腹侧丘脑中的小胶质细胞随年龄增长而增加，大多数Grn公司^−/−小胶质细胞胞质丰富，突起短而突出，与反应性小胶质细胞一致(图5C-D、5I). 有趣的是，与Grn公司^−/−老鼠，Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−小鼠在8、12和19个月龄时，腹侧丘脑中的小胶质细胞数量持续显著减少(第页=0.0006，双向方差分析）(图5G–I). 此外，Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−小胶质细胞表现出类似于Grn公司^+/+或Grn公司^−/−小胶质细胞(图5H). 使用SPH作为突触密度的标记物，我们发现在丘脑腹侧没有发现突触丢失Grn公司^+/+和C1qa公司^−/−衰老过程中的小鼠(图5J、L、N). 相反，Grn公司^−/−小鼠在4、7、12和19个月龄时，腹侧丘脑的SPH密度显著降低，而Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−小鼠几乎完全保存下来(图5K，M–N). 这些结果与小胶质细胞-神经元共培养的数据一致，并支持C1qa在调节突触剪除中的重要作用Grn公司^−/−小胶质细胞体内.

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图5

丘脑腹侧小胶质细胞数量减少和突触密度保持Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−突变小鼠

12个月大婴儿冠状切片中Iba-1的（A-H）免疫染色Grn公司^+/+,Grn公司^−/−,C1qa公司^−/−和Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−小鼠大脑位于海马前部水平。面板A、C、E和G中的方形虚线框突出显示了腹侧丘脑，在这里可以获得更高的放大率图像。A区标尺500μm，B区标尺50μm（I）Iba-1+丘脑腹侧小胶质细胞密度Grn公司^+/+,Grn公司^−/−,C1qa公司^−/−和Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−2、4、7、12和19个月龄的小鼠大脑***第页< 0.005, ****第页<0.001，双向方差分析，n=4每基因型/年龄。（J）–M） 12个月大婴儿突触素的共焦图像Grn公司^+/+,Grn公司^−/−,C1qa公司^−/−和Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−大脑。J（N）突触体素密度为10μm的比例尺Grn公司^+/+,Grn公司^−/−,C1qa公司^−/−和Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−2个月、4个月、7个月、12个月和19个月大时的大脑*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.005，ns，不显著。学生的t吨经检验，n=4每基因型每年龄。

鉴于丘脑腹侧SPH的逐渐丢失Grn公司^−/−在小鼠中，我们询问突触修剪是优先影响兴奋性突触还是抑制性突触。在腹侧丘脑内，腹侧后外侧核（VPL）和腹侧后内侧核（VPM）中的神经元投射到体感皮层的第四层，并接收来自第六层神经元的兴奋性输入(图S4A–B). 丘脑网状核（TRN）中的小泡蛋白阳性（Parv+）抑制神经元是抑制这种交互兴奋回路的唯一来源，它们共同表达囊泡GABA转运体VGAT(图6A–A′,图S4C–J). 研究C1qa蛋白是否沉积在大鼠丘脑腹侧Grn公司^−/−小鼠可以扰乱兴奋性和抑制性突触输入的平衡，我们使用共焦图像显示，C1qa蛋白广泛包围了大脑腹侧丘脑中的VGLUT2+兴奋性突触和VGAT+抑制性突触体Grn公司^−/−老鼠(图S5A-D). 虽然C1qa沉积物显示出对兴奋性或抑制性突触没有偏好，但12个月大的VPM和VPL中Parv+突触的数量Grn公司^−/−小鼠数量显著减少(图6B–B′). 许多Parv+突触靠近Iba1+小胶质细胞突起，这表明Grn公司^−/−小胶质细胞积极修剪这些突触。与这些数据类似，VGAT+突触的数量也显示出Grn公司^−/−8-19月龄小鼠(图6E-F、I). 相反，VGAT+突触的数量Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−小鼠表现出完全保存(图6G–I). 值得注意的是，与VGAT+突触表型不同，VGLUT2+兴奋性突触的数量在Grn公司^−/−,C1qa公司^−/−或Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−老鼠(图S5E-I).

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图6

在中卸下C1qaGrn公司^−/−;C1qa公司^−/−小鼠保护突触修剪，恢复丘脑微电路功能，减轻OCD样行为，提高生存率

（A–D）小白蛋白（Parv）的共焦图像显示，12个月大的婴儿的网状核（TRN）中的Parv+神经元向腹后内侧核（VPM）和腹后外侧核（VPL）的投射Grn公司^+/+,Grn公司^−/−,C1qa公司^−/−和Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−老鼠。虚线突出显示VPM和VPL核，并在A′-D′中放大倍数较高的正方形区域。D中的比例尺为500μm，D′中为20μm。（E）–H） 19个月大婴儿丘脑腹侧VGAT+突触的共焦图像Grn公司^+/+,Grn公司^−/−,C1qa公司^−/−和Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−老鼠。H中的比例尺为25μm。（I）8、12和19个月大的腹侧丘脑中VGAT+突触密度的定量Grn公司^+/+,Grn公司^−/−,C1qa公司^−/−和Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−老鼠。学生的t吨测试，*表示第页< 0.05, **第页<0.01和ns，不显著。（J） 丘脑切片图像显示内囊中的刺激电极和记录VPM和VPL中多单位放电的16通道线性阵列硅探针。（K） 典型的丘脑腹侧多单位记录（J中的橙色方框）Grn公司^+/+,Grn公司^−/−和Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−老鼠。黑色圆圈表示刺激伪影。底部的速率计显示相对于时间（Y轴）的刺激扫描（X轴）的一致诱发峰值速率。（五十） 人口数据的准刺激时间直方图Grn公司^+/+, 7Grn公司^−/−和4Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−老鼠。插图底部：（L）中黑色虚线框的放大显示反应斜率在基因型之间存在显著差异（***，第页<0.0001，F=10.5554）。插图顶部：在Grn公司^+/+,Grn公司^−/−、和Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−Kolmogorav-Smirnov试验分析的小鼠(Grn公司^+/+与。Grn公司^−/−, ***第页<0.0001，D=0.5783；Grn公司^+/+与。Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−, ***第页<0.0001，D=0.4980；Grn公司^−/−与。Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−,***第页<0.0001，D=0.7751）。错误栏、s.e.m.、（m）中的整理活动Grn公司^+/+,Grn公司^−/−,C1qa公司^−/−和Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−小鼠表示为总时间的百分比*第页< 0.05, **第页<0.01，ns，不显著，学生t吨测试。（N–O）Kaplan-Meier曲线用于皮肤损伤发病和存活Grn公司^+/+,Grn公司^−/−,C1qa公司^−/−和Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−老鼠*第页< 0.05, ****第页<0.001，ns，不显著，Long-rank（Mantel-Cox）测试。另请参见图S4,第5章和S6系列、和补充电影S1.

描述大脑腹侧丘脑抑制性突触的丢失Grn公司^−/−小鼠可能会改变电路功能，我们在12个月大的新鲜脑切片中对VPM和VPL进行了多单位阵列细胞外记录Grn公司^+/+和Grn公司^−/−老鼠(图6J). 这种方法保留了完整的丘脑内回路，并有助于确定啮齿动物的丘脑功能(Paz等人，2011年;Paz等人，2013年). 在丘脑腹侧Grn公司^+/+对小鼠内囊的电刺激偶尔会产生动作电位爆发（AP）(图6K). 相反，在丘脑腹侧同样的刺激Grn公司^−/−脑片诱发了持续的长时紧张放电，AP放电频率和诱发AP的相对概率显著增加(第页< 0.0001)(图6L). 值得注意的是，C1qa的损失Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−小鼠完全逆转了在Grn公司^−/−并将丘脑中的诱发放电模式恢复为类似于Grn公司^+/+老鼠(图6K–L).

丘脑和纹状体的功能障碍与强迫症有关，强迫症是FTD的一个重要临床特征(Fitzgerald等人，2011年;Rascovsky等人，2011年). 与腹侧丘脑的超兴奋性相一致，Grn公司^−/−小鼠表现出更强的梳理活动，包括一阵阵覆盖鼻子、脸、耳朵和背部的高频重复运动(补充视频1). 这些过度修饰行为从8个月大时开始，一直持续到12个月大(图6M和图S6A). 由于过度修饰，>60%Grn公司^−/−小鼠出现严重的皮肤溃疡。此外，约10%Grn公司^−/−小鼠还出现运动功能障碍，包括步态不稳和不平衡(补充视频1). 这两种表型导致了Grn公司^−/−小鼠（平均存活率Grn公司^−/−小鼠为529天，而Grn公司^+/+老鼠，第页<0.0001，对数秩[Mantel-Cox]检验）(图6N–O). 相反，Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−小鼠的梳毛活动明显减少，皮肤损伤较轻，生存率提高(图6M–O和图S6B–D). 这些结果支持通过C1qa公司基因缺失可以减轻神经退行性表型Grn公司^−/−老鼠。

电路特异性突触修剪Grn公司^−/−小胶质细胞

一个令人惊讶的神经退化特征Grn公司^−/−大脑是丘脑腹侧抑制性突触的选择性丢失，尽管在兴奋性突触和抑制性突触中都可以检测到C1qa的积累(图6和图S5). 通过以下方式优先消除抑制性突触Grn公司^−/−小胶质细胞在其他神经退行性疾病模型中是前所未有的。补体受体或其他识别分子在不同突触亚型中的差异表达可能有助于这种选择性表型。或者，兴奋性突触和抑制性突触的固有特性可能决定剪枝的效果Grn公司^−/−小胶质细胞。无论机制如何，抑制性突触的选择性丢失Grn公司^−/−大脑导致丘脑皮层回路的兴奋性增加。

另一个值得注意的发现Grn公司^−/−与其他脑区相比，小鼠腹侧丘脑小胶质细胞密度的增加更为强劲(Yin等人，2010年). 这一发现为观察到的过度梳洗和OCD样行为提供了神经解剖学基础，腹侧丘脑在整合感觉输入、额纹状体回路和运动学习方面的公认作用进一步支持了这一发现(Burguiere等人，2015年). 虽然原因尚不清楚Grn公司^−/−鉴于丘脑皮层回路在哺乳动物感觉运动整合中的高度进化保守功能，小胶质细胞对丘脑皮层环路具有优先作用(彼得森，2007年)FTLD患者的临床表现可能与类似的病理学有关。与这个观点一致，坚持和强迫行为是FTLD最重要的诊断标准之一(Rascovsky等人，2011年). 总之，这些结果揭示了先前未被认识的PGRN在小胶质细胞功能中的机制，以及PGRN的丢失如何以特定的电路方式影响行为。

尽管删除C1qa在缓解衰老过程中几个关键神经退行性表型方面具有强大的作用Grn公司^−/−小鼠，重要的是要注意C1qa的丢失并不能完全拯救所有的Grn公司^−/−表型。虽然小脑胶质细胞在丘脑腹侧的浸润明显减少Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−小鼠的小胶质细胞密度仍显著高于年龄匹配的小鼠Grn公司^+/+老鼠(图5). 许多小胶质细胞Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−小鼠继续表现出与Grn公司^−/−老鼠。此外，尽管生存率显著提高，Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−与对照组相比，小鼠的死亡率仍略有增加Grn公司^+/+同窝的人。这些结果表明，其他致病因素，如促炎细胞因子的过度产生、其他内在小胶质细胞和/或神经元缺陷，或复杂的小胶质细胞与神经元的相互作用，可能会导致疾病进展Grn公司^−/−;C1qa公司^−/−小鼠在缺乏补体激活的情况下。例如，上调基因的相互作用网络Grn公司^−/−大脑也能识别震颤2作为连接溶酶体和先天免疫途径中许多其他基因的节点(图1). 最近的研究表明，TREM2功能丧失和TREM2-R47H变异体减弱了小胶质细胞的脂质感应能力，从而在小鼠AD模型中对神经元损伤产生持续反应(Wang等人，2015)这些结果增加了TREM2水平升高的可能性Grn公司^−/−小胶质细胞可能促进其突触修剪活动。

我们感谢Ivy Hsieh提供的免疫金EM和Jennifer Cotter博士对原稿的批判性评论。这项工作得到了NIH AG013854（E.H.B.）、P50 AG023501和P01 AG019724（B.L.M.）、意大利希拉斯省（Ricerca Corrente，R.G.）、JPB基金会（B.A.B.）、额颞叶痴呆研究联盟（CFR）和蓝田项目（E.J.H.）的支持。特别感谢劳拉·米蒂奇博士和罗德尼·皮尔曼博士坚定不移的支持。