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肝病学。作者手稿；PMC 2015年7月1日发布。
以最终编辑形式发布为：
肝病学。2014年7月；60(1): 278–289.
2014年5月28日在线发布。 数字对象标识：10.1002/庚27084
预防性维修识别码：项目经理4077948
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院572834
PMID：24700457

卵圆细胞损伤中Sox9+肝祖细胞的克隆追踪

布兰登·D·塔罗,1 米尔顿·J·费内戈尔德,三和马库斯·格朗普2
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补充资料

摘要

长期以来，被称为“卵圆细胞”的增殖导管被认为是双能的，即在慢性肝损伤期间产生胆管和肝细胞。卵圆细胞的前体被认为是兼性肝干细胞（LSC）。最近的血统追踪实验表明，LSC是Sox9+，在几种情况下可以替代大部分肝细胞。然而，Sox9+细胞与两种上皮性肝谱系之间没有建立克隆关系。我们用彩色荧光纸屑报告器标记低密度的Sox9+小鼠肝细胞。类器官的形成验证了标记群体的祖细胞活性。使用组织学和FACS追踪多卵圆细胞损伤模型中的Sox9+细胞。令人惊讶的是，在任何实验中都只发现了含有肝细胞和卵圆细胞的罕见克隆。定量分析表明，即使在经典的卵圆细胞损伤模型中，Sox9+细胞对肝细胞池的贡献也很小（<1%）。相反，克隆标记的成熟肝细胞在所有经典的小鼠卵圆细胞激活损伤中都显示出自我更新的能力。追踪肝细胞和非实质细胞的肝细胞嵌合体模型也证明了小鼠卵圆细胞损伤模型中肝细胞驱动再生的普遍性。

结论

Sox9+导管祖细胞可引起克隆性卵圆细胞增殖和双潜能类器官，但在体内很少产生肝细胞。在卵圆细胞激活的原型小鼠模型中，肝细胞本身是新实质细胞的主要来源。

关键词：肝再生、慢性肝损伤、谱系追踪、肝细胞、导管增殖

导管肝祖细胞或“卵圆细胞”的增殖是慢性人类和实验性肝损伤的标志(1,2). 在人类中，椭圆形细胞在导致肝硬化的常见慢性肝病中被显著观察到(三). 当肝细胞复制受阻时，它们被认为为实质再生提供了另一条途径(4). 卵圆形细胞被认为起源于一种静止的兼性干细胞，在解剖学上位于“Hering运河”中胆管和肝细胞之间的界面。然而，关于它们确切起源的争论可以追溯到50多年前(5-7). 在啮齿动物慢性肝损伤模型中，卵圆细胞在恢复后可以分化为肝细胞(8)，移植(7,9)和在体外微分(10,11). 有趣的是，从正常肝脏分离的表型定义的导管样细胞在肝细胞分化方面没有表现出相同的效率，特别是在移植试验中(12,13). 确定负责肝实质再生的来源细胞是制定药物策略以调节慢性肝病中的卵圆细胞反应和推进基于细胞的肝脏治疗的关键。

最近的血统追踪实验在经过充分研究的小鼠卵圆细胞激活模型中产生了不同的结果(13-16). Furuyama等人使用Sox9-IRES-CreERT2血统追踪方法，发现即使在正常肝内环境稳定期间，Sox9+胆道室也贡献了大部分新肝细胞(14). 受伤进一步加速了这一进程。Malato等人的后续工作用腺相关病毒递送的Cre重组酶标记所有肝细胞(15). 与Furuyama相反，他们发现只有一小部分肝细胞来源于非实质性（NPC）前体，并且仅在特定损伤后才产生。这些和其他先前研究的局限性(13,16,17)即胆道或非实质性隔室被大量追踪，这就排除了肝细胞和导管祖细胞之间克隆关系的鉴定。三苯氧胺可诱导肝细胞导管标记物“异位”表达的证据(18)胆汁转录因子在正常肝细胞中表达(19)提示需要一种克隆标记策略来直接鉴定肝修复中肝细胞前体细胞的来源。

我们研究的目的是利用体内克隆分析直接鉴定双潜能成人肝干细胞，并了解其在损伤中的功能。我们在卵圆细胞激活的经典模型中使用低密度克隆标记来分别追踪成年胆道细胞和肝细胞的后代。作为第二种方法，我们使用移植产生的肝细胞-细胞来确定NPC在卵圆细胞激活模型中的作用。我们的结果表明，即使在传统的小鼠卵圆细胞损伤模型中，Sox9+导管起源的双能肝祖细胞对肝细胞替代也没有显著作用。相反，肝细胞本身是新的实质细胞的主要来源。

结果

导管祖细胞的克隆标记

我们假设，对Sox9+细胞进行克隆标记，然后对其进行卵圆细胞损伤，可以发现包含导管（自我更新）和肝细胞（干细胞分化）的双能克隆。为此，产生了Sox9-CreERT2 R26R-五彩纸屑多色随机报告小鼠，并用于确定适合克隆标记的三苯氧胺剂量。纸屑等位基因的重组不可逆地开启了三种互斥荧光蛋白中的一种。考虑到高剂量他莫昔芬诱导肝细胞中Sox9的表达(18)，我们首先试图确定避免显著肝细胞标记的数量(S图。1).

通过免疫荧光和基于FACS的表型定义的MIC1-C3+导管祖细胞分析评估，在限制三苯氧胺剂量的情况下，Sox9-CreERT2重组率大致是三苯氧芬剂量的线性函数(图1a)(12). 在接受250mg/kg三苯氧胺治疗的未受伤动物中，很容易观察到带有糖果标记的门脉周围肝细胞，而在接受125mg/kg三氯氧胺治疗后，很少观察到这种肝细胞。相反，在接受≤62mg/kg三苯氧胺治疗的动物中，未检测到肝细胞标记。

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Sox9克隆血统追踪可识别导管祖细胞，但不能识别稳态中的肝细胞

（a） Sox9-CreERT2 R26R-五彩纸屑+/-以限制稀释度给药三苯氧胺的小鼠在导管祖细胞中产生重组（CD45-CD31-MIC1-1C3+）（b）FACS分选的MIC1-1C3+、Sox9-CreERT2 Confetti+标记的单细胞在培养10天后启动自我更新的类器官（YFP分选）或（c）14天（YFP+、mCerulean+或RFP+分选机）（d）克隆标记的类有机物在传代后自我更新。（e） Sox9-CreERT2克隆标记细胞在体内稳定3个月后继续表达导管标记Opn（比例尺=50μm）。

为了验证低剂量三苯氧胺确实标记了导管祖细胞，我们应用了类器官形成分析(13). 该祖细胞分析确定具有广泛自我更新能力的克隆形成细胞，在体外具有双潜能，并在移植后产生肝细胞。将单个FACS分离的Sox9-CreERT2标记细胞接种到类器官培养物中。10天后，在所有三苯氧胺剂量下观察到有机物的起始(图1b)或14天(图1c)，证明了功能同质群体的随机标记。有机物具有单一颜色，证实它们是由单个细胞克隆启动的(图1c). Sox9-CreERT2标记的类有机物的自我更新潜力通过连续传代显示(图1d). 这一结果表明，低剂量三苯氧胺标记了体内的Sox9+克隆形成祖细胞。

Sox9+追踪无损伤

为了确定Sox9+细胞是否是体内稳定状态下新肝细胞的持续来源，在没有肝损伤的成年小鼠中进行标记。成年Sox9-CreERT2 R26R-五彩纸屑小鼠注射32或125 mg/kg三苯氧胺（n=2）。在正常饮食中，克隆标记（32mg/kg）的Sox9+标记细胞在3个月后继续仅表达胆管标记物Sox9、A6和骨桥蛋白，但从未表达肝细胞标记物Hnf4a（n=500个克隆，图1e)和6个月(S图。2). 当门脉周围肝细胞被标记为高水平的三苯氧胺（>125mg/kg）时，它们仍处于门脉周围位置，在3或6个月后没有流动或替换肝实质(S图。2).

Sox9+示踪在CDE诱导的卵圆细胞损伤中的作用

CDE饮食诱导的脂肪性损伤是最典型、应用最广泛的卵圆细胞诱导方案之一(13,14,16,17,20). 为了追踪CDE损伤后Sox9+细胞的命运，首先用重组标记细胞，然后用两周的休息时间让三苯氧胺消散(图2a). 然后根据之前描述的与Sox9+/Opn+祖细胞-肝细胞分化相关的损伤方案对小鼠进行治疗(16). 经过3周的CDE饮食和2周的恢复期后，对切片进行检查，以确定导管-肝细胞分化的证据(16). 当2.5-4%的Sox9+导管分别标记为三种颜色之一（mCerulean、YFP或RFP；MIC1-C3+细胞总数为8-11%，图2b). 出乎意料的是，没有发现同时含有卵圆细胞和肝细胞的克隆。事实上，肝细胞标记非常罕见。与Hnf4a、A6、骨桥蛋白和Sox9的共免疫化学证实Sox9-Cre标记细胞的后代仅为胆道细胞。在CDE治疗的多个切片中对500个纸屑+Opn+或A6+克隆体进行评分(图2c，n=4只小鼠）。仅在门静脉附近发现一个YFP+肝细胞克隆(图2d)但相邻的导管细胞为mCerulean+或RFP+，表明标记的肝细胞与标记的导管细胞无克隆相关。

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在CDE损伤中，Sox9+导管很少引起肝细胞

（a） 实验方案：4-6周龄Sox9 CreERT2R26R-纸屑+/-给小鼠单剂量三苯氧胺，两周后卵圆细胞损伤（b）低密度Sox9标记后CDE饮食产生导管增殖。共聚焦分析产生的Z投影μm厚肝切片（32mg/kg三苯氧胺）。导管增殖与肝细胞分化无关（c）导管标记物A6免疫染色（顶部），Hnf4a（底部）证实Sox9-CreERT2标记细胞在CDE损伤恢复后未分化为肝细胞。（d） 具有明显肝细胞形态（箭头）的2个YFP+细胞与克隆无关的mCerulean+和RFP+胆管细胞相邻（箭头）。比例尺=50μm。

使用单细胞解离的肝脏的FACS分析作为第二种方法来量化和表型Sox9标记的细胞。MIC-1C3是胆管细胞（包括祖细胞）的可靠表面标记物(12). 相反，2F8是肝细胞特异性表面标志物(13). 荧光标记细胞大多为MIC-1C3阳性，表明存在导管表型。与组织学结果一致，标记的2F8+肝细胞很少见，占总细胞数的0.1%以下(S图。三). 重要的是，FACS分选的CDE损伤动物的Sox9-CreER-Confetti+细胞保留了其形成类有机物的能力在体外在所有标记密度下(S图。4).

CCl中的Sox9+跟踪4损伤

接下来我们评估了慢性和急性CCL中克隆标记的Sox9+细胞的命运4受伤。慢性CCL五周后4损伤和一周的恢复期后，检查肝脏是否存在肝细胞分化的证据。在克隆追踪实验中，我们发现糖果标记细胞继续与Opn+/Sox9+导管结构共存，但从未与Hnf4a+肝细胞共存（n=500个克隆，n=3只动物；图3a). 基于FACS的肝细胞定量证实了组织学发现，Sox9-CreERT2标记的肝细胞在损伤后极为罕见(S图。三). 急性CCl4伤害追踪也产生了类似的结果(S图。5). 最后，来自CCl的Sox9-CreERT2-Confetti+细胞4受伤的动物形成了类器官在体外在所有标记密度下(S图。4).

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Sox9+导管在DDC或CCl中不能分化为肝细胞4损伤

（a） 导管标记物Opn（顶部）和肝细胞标记物Hnf4a（底部）的免疫荧光显示，Sox9-CreERT2标记的细胞在5周CCl再生后保留了导管命运4受伤（箭头表示一个独特的克隆）。（b） DDC损伤4周后，导管标记物A6（顶部）和Opn（底部）的免疫荧光继续与Sox9-CreERT2标记克隆共存。比例尺=50μm。

Sox9+示踪在DDC诱导卵圆细胞增殖中的作用

在Sox9-CreERT2克隆标记和2周洗脱期后，给小鼠服用DDC（3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢可立定）4周(10,12). 与CDE和CCl4损伤方案类似，我们发现Confetti标记细胞仅局限于A6或Opn+导管细胞（500个克隆，n=3只小鼠，图3b). 这表明在该模型中，增殖导管未分化为肝细胞。

产生嵌合肝脏小鼠

接下来，我们希望通过第二种独立于Cre-remission的方法来验证我们的意外发现。移植产生的嵌合体以前曾被用于追踪成体细胞类型在器官再生中的各自贡献(21). 我们的整体方法与Malato等人使用的方法类似，即通过产生具有遗传标记肝细胞的动物，然后再产生卵圆细胞损伤(15). 在他们的研究中，目的是确定非实质性前体细胞（不仅是导管细胞）是否会对损伤后的肝细胞再生有显著贡献。

为了获得成熟肝细胞的高标记效率，我们使用法赫-突变小鼠模型，可通过治疗性肝移植，用供体标记的肝细胞特异性和可重复性替换>95%的肝细胞(22).法赫-突变肝细胞积聚有毒代谢物，无法增殖(23). 重要的是法赫-用小分子尼替西酮（NTBC）治疗可完全逆转肝细胞缺乏和肝细胞复制停滞(S图10)(22).

我们通过将来自ROSA-lacZ或ROSA-mTomato标记菌株的同基因肝细胞移植到受体中来生成嵌合体小鼠法赫-突变小鼠(图4a). 移植后10周评估肝脏再生。根据Fah-免疫抑制或FACS测定，95-99.4%的肝细胞是供体肝细胞(图5b、c). 对于组织学分析，我们关注的是囊外组织，其中供肝细胞在损伤前的含量始终大于99%（n=6）。

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Fah-chimeric小鼠中成人肝细胞而非其他细胞的强健和特异性替换

（a） 实验方案：重力富集野生型或mTomatoFah+/+将肝细胞移植到Fah的脾脏中-/-小鼠并允许重新繁殖（95-99%）。

（b） Fah-免疫抑制（棕色）显示，>99%的肝细胞是供体在10周后重新填充（bar=1mm）（c）完全中央静脉（CV）到门静脉（PV）与供体Fah+肝细胞重新填充（棕色）。（d） 供体细胞标记物（番茄红）未与骨桥蛋白+（绿色）宿主导管细胞共定位。（e） 游离嵌合肝形成的有机物（箭头）为宿主来源（番茄阴性）。培养12天后，番茄+肝细胞未形成类有机物球。

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嵌合体小鼠卵圆细胞损伤的适应不需要祖细胞衍生的肝细胞

（a） 示意图：肝细胞移植入法赫-/-小鼠产生嵌合小鼠，宿主非实质细胞法赫-并且没有标记。供体肝细胞呈Fah+和mTomato标记。如果卵圆细胞损伤后非实质细胞产生肝细胞，我们假设祖细胞衍生的Fah-肝细胞会取代标记的Fah+肝细胞。（b） Fah-阴性肝细胞的图像定量显示，损伤后约有1%的肝细胞仍为宿主来源。（c） CDE损伤3周加NTBC抢救或CCl 10周后，在大多数门静脉区域（箭头=导管增殖）未观察到Fah-阴性祖细胞衍生肝细胞4损伤加NTBC（箭头=门脉炎症，导管增生，但无Fah-肝细胞）。（d） 4周DDC损伤加NTBC治疗后，CK19+（绿色）导管增生靠近供体mTomato（红色）肝细胞（箭头）和炎性非亲缘细胞（箭头，mTomato-negative）（bar=50μm）。（e） CDE损伤高峰时，在增殖的导管和非实质细胞（箭头所示）中观察到BrdU摄取（2小时脉冲），但在肝细胞中未观察到。肝细胞显示微囊状脂肪变性。（f） 在CDE损伤恢复期间，观察到肝细胞（箭头）、炎性细胞和胆管细胞中的BrdU摄取（2周BrdU水）。连续切片显示再生肝细胞是谱系标记的成熟肝细胞（Fah+），而不是来源于非实质性祖细胞（Fah-）。

未发现移植供体细胞表达胆道祖细胞标记物（CK19/Osteopontin/MIC1-1C3）（>4500条接受调查的导管，n=3只小鼠，图4)或其他非实质性细胞标记物(S图。6)免疫组化或FACS。体外类器官形成表明所有祖细胞都是宿主衍生的（198/198，n=2只动物）(图4e). 由于肝细胞而非非非实质性细胞被标记的移植细胞特异性替换，我们继续使用嵌合体小鼠来研究卵圆细胞损伤中的非实质细胞室。

肝细胞嵌合体的谱系追踪

目前关于卵圆细胞反应的模型认为，假定的LSC被激活是因为肝细胞本身不能再生(4). 该模型预测，在卵圆细胞损伤期间，来自非肝细胞前体的肝细胞百分比将显著增加，而受损的供体肝细胞将受到损害。在肝细胞嵌合动物中，这些细胞很容易被识别，因为它们是宿主来源的，因此标记物（lacZ或mTomato）为阴性。新生祖细胞衍生的肝细胞将受到保护，免受传真-如果使用NTBC治疗，则会出现缺陷(S图。第7页). 相反，新法赫-/-如果动物脱离NTBC，肝细胞将受到功能损害(S图。9). 因此，我们假设只有经NTBC处理的嵌合体才能在卵圆细胞损伤后存活，前提是生存需要祖细胞衍生的新肝细胞。

在完全重新繁殖后，嵌合体小鼠被给予CDE饮食3周，包括或不包括NTBC。对照组仅接受NTBC治疗。损伤后，小鼠恢复两周以允许祖细胞分化(16). 与单纯损伤（0.67%±0.25%，p=0.8）或单纯NTBC（0.49%±0.11%，p=0.4）（每组3个，图5b、c). 各组之间的动物存活率、体重或肝脏重量也相似，表明各组之间的微小差异在功能上并不显著(S图。6). CDE损伤高峰期给予2小时的BrdU脉冲显示门脉NPC增殖和肝细胞微球状脂肪变性(图5f). 恢复后，我们通过连续2周的BrdU治疗检测到肝细胞的强劲再生和增殖(图5g). 连续切片分析表明BrdU+肝细胞来源于谱系标记的成熟肝细胞(图5h).

接下来，每周两次CCL的重复毒性损伤4给药10周（0.5ul/kg），含或不含NTBC。总的来说，在损伤后的动物中，只有0.24-0.92%的肝细胞来源于宿主（每组3个，图5b). 与单独损伤相比，NTBC在损伤期间的保护作用并未显著增加宿主源性肝细胞（p=0.18）或动物健康的整体指标。在损伤72小时后的非实质细胞和慢性损伤恢复后的供体标记肝细胞中观察到BrdU摄取(S图。7).

最后，我们测试了嵌合Fah-/-小鼠需要NTBC适应5周的DDC损伤。与CCL中相同4CDE损伤，推测的祖细胞源性mTomato阴性肝细胞仅在增殖导管旁很少发现(图5e). DDC-plus-NTBC组的番茄阴性肝细胞呈上升趋势（1.03%对0.62%，p=0.4，图5i)，但这些差异并不影响生存率或肝功能的整体测量(S图。7). 基于FACS的量化证实，与单纯损伤相比，NTBC没有增加祖细胞源性肝细胞（p=0.88，n=3，S图。7).

卵圆细胞损伤中成熟肝细胞的自我更新

为了进一步测试肝细胞的这种自我更新潜能，我们检测了卵圆细胞损伤中成熟肝细胞的克隆动力学。R26R-纸屑+/-给小鼠注射AAV8-Ttr-Cre以建立稀疏、特异的肝细胞标记(S图。8). R26R-纸屑中的每个等位基因+/-小鼠随机重组，以一种相互排斥的荧光颜色标记细胞。由于成人肝细胞有时具有多倍体性质，因此产生了6种可观察到的颜色图案。在基线检查时，95%以上的标记细胞可被识别为单个细胞(图6b). 两周后，进行部分肝切除，通过细胞复制消除残留rAAV。在部分肝切除术再生后，我们观察到单个标记细胞或克隆相关的两个细胞簇，与其他细胞一致(24). 肝细胞集落在长达6个月的时间内保持稳定，主要是一个和两个细胞克隆(图6c).

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卵圆细胞损伤中成熟肝细胞的自我更新

（a） 实验方案：在杂合R26R-五彩纸屑中以低密度标记肝细胞+/-使用低剂量rAAV8-Ttr-Cre的小鼠。进行部分肝切除术，完全再生后开始损伤。（b） 肝切除术前标记单个肝细胞。（c） 部分肝切除诱导肝细胞复制，产生1个克隆（单箭头）或两个标记相同的细胞（双箭头）。（d） CDE饮食、DDC饮食或慢性四氯化碳引起的卵圆细胞损伤可诱导成熟肝细胞复制和自我更新或克隆性扩张。（e） 基线时、部分肝切除术后2周至6个月稳态和卵圆细胞损伤后成熟肝细胞集落大小的点图直方图（线=平均值±标准差）。比例尺=100μm。

接下来，我们在肝切除术恢复两周后诱导了与卵圆细胞激活相关的典型慢性肝损伤。损伤后平均肝细胞克隆大小显著增加（1.5-4.5倍，图6g)表明损伤前标记的成熟肝细胞是新肝细胞的重要来源。在CDE和DDC损伤中，20%存活的肝细胞是5个或更多细胞簇的一部分(S图。8). 慢性CCl后4损伤后，大多数明显存活的肝细胞是10个或更多细胞克隆的一部分。

讨论

首先，我们的结果表明，Sox9+前体在正常生理条件下不会持续生成新的肝细胞，这与其他多个报告一致(15,16,18,25). 即使用Sox9-CreERT2（高三苯氧胺）标记门脉周围肝细胞，标记的肝细胞也不能持续替换实质(14,17)(S图。2). rAAV克隆追踪(图6)同样强调了肝细胞在正常内稳态和沿门-中心轴位置稳定性中的低周转率(S图8f).

其次，我们的数据显示，Sox9+导管增殖对不同肝脏损伤的实质再生仅起到微小作用。卵圆形细胞激活损伤的低密度克隆谱系追踪显示，Sox9+细胞产生高度增殖的卵圆形细胞(18)但我们发现很少有证据表明卵圆细胞激活与有效的肝细胞分化相关。我们对DDC引起的损伤的研究结果与之前的几项研究相似(14-16,20)但与其他报告相比(12,13,26). 我们在CCl4介导的再生中的发现与以前的研究更为一致，这些研究表明CCl4中介导的再生主要由肝细胞自我更新驱动(4)与基于干细胞的机制不太一致(13-15). 与最近使用Opn谱系追踪的研究相比，我们也发现CDE卵圆细胞激活方案中的祖细胞肝细胞分化证据很少(16).

鉴于小鼠体内活性三苯氧胺代谢物的半衰期较长（t1/2=5-7天）(27)低浓度三苯氧胺对CreERT2的敏感性(图1a)，服用三苯氧胺后，cre再组合可能会持续数个半衰期。事实上，我们已经直接证明三苯氧胺在注射一周后仍存在于肝脏中(S图11)，在Opn谱系追踪研究中CDE损伤开始的时间(16). 与我们的结果一致，其他人发现他莫昔芬在注射后可以持续4周(28). 因此，Español-Suñer等人观察到的低肝细胞标记频率可能是CDE诱导的肝细胞Opn表达的结果(29).

从形式上讲，结果增加了我们的低三苯氧胺给药策略未能标记出假设的双表型Sox9的可能性低的Krt19低的常驻干细胞。有两个实验反对这一观点。首先，Sox9-CreERT2标记细胞在在体外无论三苯氧胺剂量如何，对祖细胞活性的功能性检测表明，高剂量和低剂量三苯氧酚标记的是相同的细胞群。其次，在我们的嵌合体谱系追踪实验中，移植只取代了成熟的肝细胞。因此，该模型系统通常测试是否有任何NPC，例如Sox9低的胆道细胞甚至Sox9阴性星状细胞(30)具有向肝细胞分化的能力。因此，我们的策略不太可能系统地忽略胆汁细胞的一个子集。Sox9和其他胆汁细胞基因在成熟肝细胞中表达的证据(18,19)提出了假设的Sox9低的Krt19低的操作低的祖细胞是单纯损伤的门脉周围肝细胞。

我们的嵌合体实验进一步证实了在卵圆细胞激活后，NPC前体细胞对肝细胞池的罕见贡献。NTBC治疗对动物存活率或对任何卵圆形细胞损伤方案的肝功能整体测量均无影响(S图。7)，提供了功能性证据，证明不需要拯救祖细胞群体来适应这些损伤模型。这一结果强烈表明法赫+/+供体肝细胞对肝功能有显著贡献，而新生祖细胞对卵圆细胞损伤的贡献很小。

我们的研究通过存活率、肝脏大小和动物体重来评估肝功能(图5,S图。7)如前所述(26,31)但我们本可以忽略通过更敏感的合成肝功能测试检测到的其他差异(31). 我们的结果无法确定罕见标记肝细胞是否是干细胞分化、胆道祖细胞转分化或肝细胞自身直接Sox9-CreERT2标记的结果。我们的实验很容易检测到5%或更多的肝细胞贡献，这一水平我们认为在短期内会对功能产生影响。然而，值得注意的是，在长期慢性损伤中，祖细胞以恒定的低速率向肝细胞分化的累积效应可能会随着时间的推移达到功能显著的水平。因此，我们的实验不排除祖细胞在长期肝损伤（如人类慢性肝炎）中的重要作用。

在Sox9-CreERT2克隆追踪实验中，使用相同的R26R-Confetti报告人，检测所有损伤中自我更新肝细胞的容易程度与潜在祖细胞衍生肝细胞的缺乏形成了鲜明对比。AAV8-Ttr-Cre标记的肝细胞克隆大小分布表明，一部分肝细胞多次分裂，而其他肝细胞在DDC和CDE损伤中没有扩张。

持续的肝细胞复制增加了现有小鼠损伤方案不足以激活真正的祖细胞的可能性(4). 由于缺乏其他生物体的谱系追踪工具，目前尚不清楚我们的结果是否适用于人类肝损伤或大鼠，即卵圆形细胞祖细胞首次被描述的生物体(1,三).

虽然我们的研究发现，具有缺乏肝细胞潜能的导管的嵌合体动物的存活率没有差异，但胆管细胞和卵圆细胞的增殖对整体再生仍然很重要。最近的两项研究表明，在DDC损伤中阻断导管增殖会降低生存率(26,31). 因此，虽然导管增殖并不能提供新肝细胞的重要来源，但导管室的扩张可以作为门脉周围肝细胞再生的支架，或通过旁分泌信号改变肝细胞基因表达。

最近的报告显示，成熟肝细胞保留了向导管样细胞转化的潜能，增加了肝细胞在损伤后成为Sox9+的可能性，并且在形态和基因表达上与胆管细胞相似(32-34). 我们的数据为慢性损伤模型中的肝细胞再生完全是肝细胞自我更新和肝细胞来源的卵圆细胞分化的结果，而不是常驻兼性干细胞的激活的假设提供了一个开端。未来的工作将需要描述肝细胞亚群在再生中的功能，并开发更好的肝细胞衰老模型来研究假定的祖细胞。

材料和方法

小鼠饲养和Cre重组

Sox9-CreERT2小鼠(35)与C57bl/6小鼠回交3代，然后与R26R-五彩纸屑小鼠杂交(36). 将他莫昔芬（Sigma）溶于芝麻油（20 mg/ml）中，并对4-6周龄小鼠进行腹腔注射。剂量范围为8-250mg/kg。作为重组的阴性对照，给小鼠服用芝麻油。在开始受伤之前，给他莫西芬两周的洗脱期，使其水平消散。对于AAV8 Ttr Cre谱系追踪，给予杂合R26R Confetti小鼠2×1010逆转录注射病毒基因组。两周后，进行了50-66%的部分肝切除术。受伤开始前，允许两周的恢复/再生。俄勒冈州健康与科学大学IACUC批准了所有描述的动物实验。

肝细胞移植与嵌合Fah-/-老鼠

57桶/6法赫-/-小鼠在移植前1天一直饮用8mg/L NTBC（2-（2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基）-1,3-环己二酮）（Yecuris公司）饮用水。原代肝细胞通过胶原酶两步灌注新鲜分离法赫-携带ROSA26-lacZ或ROSA26-mTomato/mGFP基因的野生型小鼠。通过一系列低速（1'×50g）离心步骤富集肝细胞(22). 然后将50万活肝细胞在150uL的DMEM/10%FBS/0.5%绿色食用色素中再次悬浮，经皮注射到小鼠脾脏法赫-/-3-6周龄的小鼠。法赫-/-在4周内体重稳定的小鼠被允许在受伤前再繁殖6周。

饮食和受伤治疗

小鼠维持Purina 5015饮食，添加或不添加0.1%wt/wt DDC（3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢可立定）(12)（哈兰实验室）。为了诱发脂肪变性，小鼠被喂食缺乏胆碱的食物（MP生物医学）(13,16)补充0.1%（wt/vol）乙硫腈水（Sigma）3周，收获前在Purina 5015上恢复2周。CCL公司4通过腹腔注射1uL/kg CCL诱导损伤4（急性损伤；Sigma）或0.5uL/kg体重，每周2次，持续5-10周（慢性），并在最后一次注射CCL后1周进行检查4(13,15). 给对照小鼠等量的玉米油载体。在处死前2小时注射BrdU（150mg/kg）或在饮用水（0.5mg/mL）中连续注射，补充1%葡萄糖（如有指示）。

免疫组织化学和成像

用冷的4%多聚甲醛/PBS灌注肝脏并固定2-6小时。然后，组织在振动切片机上切割50-100μm切片，或在25%蔗糖/PBS中冷冻保存，用于8-10μm切片的冷冻切片。在固定/冷冻冷冻切片上进行免疫组织化学，所有步骤在4°C下进行。mCerulean、eYFP、tdimer（RFP）和mTomato是在蔡司LSM780上直接检测到的，其激光和滤光片设置与前面描述的类似(36). 高水平的Cre表达是产生nGFP重组所必需的，使用三苯氧胺的剂量没有观察到。初级抗体(补充表1)用AF647结合二级抗体（Jackson ImmunoResearch）检测，用Hoechst 33258复染，用Prolong Gold（Invitrogen）贴装。

细胞培养

通过胶原酶灌注分离胆管(12). 如前所述，分离的导管要么是FACS分选成单细胞悬浮液，要么直接与基质凝胶混合(13). 10-14天后分析或传代有机物培养物。

补充材料

补充材料

支持信息图1:Sox9-CreERT2标记高剂量他莫昔芬的肝细胞

用250mg/kg三苯氧胺在Sox9-CreERT2 R26R-lacZ小鼠中诱导重组。小鼠在（a）正常进食24小时后或（b）典型脂肪变性损伤后进行检查，包括1周的休息期、3周的胆碱缺乏、补充乙硫氨酸的饮食和2周的恢复期。（c） 正常饮食或CDE损伤后，通过上皮细胞类型对Sox9-CreERT2标记细胞进行量化，重现了文献中先前报道的损伤后标记肝细胞的增加。（d） 250mg/kg三苯氧胺在肝细胞和导管中诱导重组Sox9-CreERT2 R26R-纸屑重组。在三种五彩纸屑颜色（mCerulean、RFP和YFP）中的每一种颜色中都鉴定出肝细胞和肝管。（e） 在受到CDE损伤的Sox9-CreERT2 R26R-Confetti小鼠中进行高剂量三苯氧胺追踪3周，恢复1周后，肝细胞（箭头）和Opn+导管细胞（箭头所示）显著。（f） 重复CCl4给药损伤小鼠的Sox9-CreERT2 R26R-五彩纸屑中的高剂量他莫昔芬示踪导致标记的HNF4a+肝细胞（箭头）和导管细胞（箭头所示）。

支持信息图2:Sox9-CreERT2标记的导管和门脉周围肝细胞在体内稳态中不持续“流动”

Sox9-CreERT2 R26R-lacZ小鼠接受（a）32mg/kg他莫昔芬或（b）125mg/kg他莫昔芬治疗，并在正常饮食中维持6个月。标记的导管（箭头）或门脉周围肝细胞（箭头）没有逐渐取代大部分肝细胞团（bar=200μm，inset bar=50μm）。（c） 用125mg/kg三苯氧胺处理的Sox9-CreERT2 R26R-Confetti小鼠的重组显示，重组主要发生在体内稳定3个月后未产生肝细胞的Sox9+细胞中。（d） 罕见的末梢周围肝细胞（箭头）保持着门脉周围的位置，在3个月内稳态后没有增殖或取代大部分肝细胞。

支持信息图3:基于FACS的Cre-marked五彩纸屑细胞分析

（a） 肝非实质细胞的单细胞悬浮液经FACS分类，采用以下门控策略来识别胆道祖细胞。闸门为FSC/SSC、低触发脉冲宽度（未显示）、碘化丙烷阴性（活细胞，未显示），其次为MIC1-C3+Cd31-Cd45-Cd11b-。（b） 然后根据eYFP、mCerulean和tdimer RFP状态对CDE和125mg/kg他莫昔芬（c）或CDE和16mg/kg他莫昔芬治疗的小鼠的MIC1-C3细胞进行评分。（d） AAV-Ttr-Cre处理的五彩纸屑小鼠（和芝麻油处理的Sox9-CreERT2 R26R-五彩纸巾小鼠）中未标记MIC1-C3导管细胞。（e） 根据FSC/SSC鉴定重力富集肝细胞，为PI-、OC2-2F8+、Cd31-、Cd45-。（f） 在受伤的Sox9-CreERT2 R26R-五彩纸屑动物和（g）病毒标记的AAV8-Ttr-Cre标记的肝细胞（1-3%标记）中检测肝细胞eYFP和tdimer RFP。（h） 基于FACS的Sox9-CreERT2 R26R Confetti标记的肝细胞的定量证实了它们是罕见的。（i） 基于FACS的分析用于确认基于图像的嵌合体评分法赫-/-小鼠番茄-肝细胞嵌合体。绘制三组中每一组的宿主mT阴性肝细胞百分比（平均值±SEM，每组3个）。

支持信息图4:Sox9-CreERT2标记形成肝类器官的表型定义的MIC1-C3+细胞

将来自Sox9-CreERT2 R26R-纸屑FACS的非表皮肝细胞进行FACS分类（YFP+MIC1-C3+CD31-CD45-CD11b-）并接种到类器官培养条件下。培养12天后，（a）32mg/kg或（b）250mg/kg三苯氧胺处理的小鼠以同等速率从YFP+细胞中形成的有机物。（c） 五彩纸屑+MIC1-C3+CD31-CD45-CD11b中的白蛋白mRNA表达-标记为高（250mg/kg）或低三苯氧胺（32mg/kg），并分化为肝脏命运。（d） 在CDE饮食或（e）慢性CCl损伤后，克隆标记的导管形成的类有机物保留了体外形成类有机物的能力4受伤。

支持信息5：急性CCl4损伤中，Sox9+导管很少产生肝细胞

（a） 急性CCl的实验方案4追踪：Sox9-CreERT2 R26R-五彩纸屑+/-给小鼠一次急性毒性损伤（1ul/kg CCl4)（b）损伤后21天恢复，大多数Sox9-CreERT2标记细胞与导管标记物Opn共定位（箭头=唯一克隆）。（c） 与导管Hnf4a-导管细胞相邻的单个RFP+Hnf4a+Sox9-CreERT2标记肝细胞簇（箭头）表明存在克隆关系。（d） 急性CCl后Sox9-CreERT2标记细胞的FACS定量4在表型明确的胆道细胞（MIC1-C3+）中再生，其中约4%的导管用32mg/kg三苯氧胺标记为RFP或YFP+。（e） OC2-2F8+肝细胞级分在CCl后显示再生4与仅玉米油中的肝细胞相比，损伤与肝细胞显著增加2.5倍有关。只有不到0.01%的肝细胞有五彩纸屑标记。

支持信息图6：肝细胞移植到法赫-/-小鼠专门替换肝细胞，但不替换其他类型的细胞。

（a） 用标记为mTomato（红色）的成熟供体肝细胞移植6周后，供体细胞表达肝细胞标记物Fah（绿色），但不表达导管标记物A6（白色），表明在包膜（箭头）附近检测到Fah-阴性mTomato-阴性宿主肝细胞（bar=50μm）。（b） mTomato供体标记物（蓝色）围绕Hnf4a+肝细胞（绿色）而非非实质性细胞核（Hoescht only=红色）c）CD31+内皮大血管和窦状体（d）CD11b+单核细胞，和（e）GFAP+星状细胞，且不与mTomato+定位，表明这些非实质性细胞是宿主来源。（f） Fah免疫染色（绿色）显示供体肝细胞的重新填充接近完成，但有些法赫-/-肝细胞（箭头所示）保留在Opn+细胞附近的门脉周围区域（g）基于FACS的分析mTomato重新填充嵌合动物表明，没有供体来源的导管细胞（0/4308 MIC1-C3+）。

支持信息图7：用DDC和CDE治疗的嵌合Fah小鼠不需要NTBC

（a） 嵌合小鼠中新祖细胞衍生肝细胞功能测试示意图。胆汁和非实质细胞是Fah-缺乏的。Fah-mutant肝细胞需要用复合NTBC治疗才能正常存活。肝干细胞模型预测，当卵圆细胞/慢性损伤导致肝细胞复制障碍时，NTBC对祖细胞源性肝细胞的挽救对于再生是必要的。（b） 在接受10周CCl治疗的嵌合体动物中测量肝脏重量占体重的百分比4伤后1周恢复或3周CDE。嵌合动物存活或维持整体肝功能测量值（如体重）不需要NTBC拯救假定的祖细胞源性肝细胞。（c） CDE损伤（±NTBC）或仅NTBC治疗的嵌合体体重变化（d）慢性CCl4损伤和（e）DDC损伤。（f） 卵圆形细胞损伤高峰时嵌合体动物队列体重变化的量化。（g） DDC损伤后嵌合体中基于FACS的mTomato阴性肝细胞定量（每组3个）。（h） 慢性CCl的嵌合小鼠恢复4损伤（2小时BrdU脉冲）显示BrdU在宿主门脉非实质细胞（箭头所示）和肝细胞（箭头）中掺入。（i） 连续切片的Fah-免疫组化显示，复制的肝细胞（箭头）是供体来源的成熟肝细胞。（j） CCl 10周后恢复期给予BrdU 1周后BrdU+肝细胞标记4（k）未受损嵌合体中的肝细胞BrdU掺入（2小时脉冲）在25个高功率场的~1处观察到。

支持信息图8:AAV8-Ttr-Cre特异性和肝细胞克隆动力学

R26R-五彩纸屑中AAV8-Ttr-Cre诱导的重组+/-小鼠特异性地存在于（a）Hnf4a+肝细胞中，但不存在于（b）骨桥蛋白+导管中。（c） 急性CCl后的五彩纸屑标记克隆4（1ul/kg）介导的中心周围肝细胞损伤和21天再生（d）损伤后，作为大簇一部分的克隆标记肝细胞的累积百分比增加，表明成熟肝细胞是新肝细胞的共同来源。（e） 再生后肝细胞集落大小的直方图表示。（f） 在基线检查时（n=4）和动态平衡3个月或更长时间后（n=2），测量每个五彩纸屑标记克隆到最近门静脉的距离。

补充信息图9:NTBC救援法赫-/-肝部分切除再生过程中的肝细胞复制

（a） 2/3肝部分切除术前10天法赫-/-动物被指定继续接受NTBC（8mg/L水）或停用药物。部分重新填充法赫-/-此时将肝细胞嵌合小鼠放回NTBC。2/3部分肝切除后，在饮用水中持续给予BrdU。在肝部分切除术后4天评估复制情况。（b） NTBC上的Fah-/-动物在部分肝切除术后再生后，在实质细胞和非实质细胞中显示出强大的BrdU掺入。（c） Fah-/off NTBC显示，由于肝细胞复制受阻，部分肝切除后，BrdU主要在非壁细胞中掺入。（d） 嵌合体法赫-/-放回NTBC的动物显示BrdU在（e）均为法赫-/-和法赫+/+基于Fah-immunostaining在一个连续部分。

支持信息图10：在Sox9-衍生的卵圆细胞中，延长恢复时间不会诱导肝分化

（a） 如前所述，至少在卵圆细胞激活损伤开始前两周，向Sox9CreERT2 R26R-Confetti小鼠腹腔注射32mg/kg他莫昔芬(图2). CDE损伤3周，慢性CCl4和DDC损伤5周。如图所示，为了恢复，动物们被给予了4-15周的正常饮食（5LOD饮食）。（b） CDE损伤和4周恢复后，A6+导管增生持续存在。纸屑+细胞继续与A6+细胞共定位（200/200个克隆，n=1只动物）。（c） CCl4损伤和4周恢复后，观察到导管增殖受限。纸屑+细胞继续与A6+细胞共定位（75/75克隆，n=1只动物）。（d） 在DDC损伤和4或15周恢复后，导管轻度增生仍然存在。纸屑+细胞以明显的导管形态排列（200/200个克隆，n=1只动物）。

支持信息图11:CreERT2重组在三苯氧胺给药一周后继续

（a） ROSA公司CreERT2公司与ROSA交锋mT/mG小鼠产生一种在他莫昔芬介导的重组后从红色荧光不可逆转地转换为绿色荧光的小鼠系。（b）体外给ROSA注射三苯氧胺克里特2/mTmG原代肝细胞将细胞从红色荧光转换为绿色荧光（bar=20um）。在三苯氧胺治疗后2天和6天监测荧光。（c） 移植实验示意图：传真-/-在用ROSA进行脾内移植前1或7天，给小鼠腹腔注射100mg/kg他莫昔芬（或赋形剂）克里特2/mTmG肝细胞。移植前1天取出NTBC水，7天用于移植物选择和荧光蛋白转换。（d） 供体ROSA的重组率克里特2/mTmG通过免疫荧光法评估移植小鼠肝脏中的肝细胞，并（e）量化为mGFP+供体细胞的百分比。

支持材料和方法

补充材料中提供了其他方法，包括：

支持信息表1：免疫组织化学和FACS抗体。

支持信息表2：转基因小鼠的学名

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致谢

我们感谢莱斯利·韦克菲尔德（Leslie Wakefield）、费利奥·加利沃（Feorillo Galivo）、安妮莉丝·哈夫特（Annelise Haft）、安吉拉·梅杰（Angela Major）、斯蒂芬妮·凯奇·佩特里（Stefanie Kaech Petrie）和曼迪·博伊德（Mandy。加州大学圣地亚哥分校的梅克·桑德博士亲切地提供了Sox9-CreERT2小鼠。加州大学旧金山分校的Holger Willenbring博士提供了AAV-Ttr-Cre结构。我们感谢俄勒冈州健康与科学大学使用先进的光学显微镜核心、流式细胞仪核心和分子病毒学支持核心以及德克萨斯医学中心消化疾病中心分子形态学核心DK 56338提供的服务。

财务支持

本研究得到NIH/NIDDK（F30-DK095514至BT，R01 DK051592至MG，P30 DK56338至MF）和奈特癌症研究所的支持。

缩写词表

LSC公司肝干细胞
溴化铀溴脱氧尿苷
CDE公司补充胆碱缺乏的乙硫氨酸
CCl4号机组四氯化碳
DDC公司3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢吡啶
NTBC公司2-（2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基）-1,3-环己二酮
HNF4α肝细胞核因子4α
OPN公司骨桥蛋白
SOX9标准SRY相关HMG盒转录因子9
YFP公司黄色荧光蛋白
招标书红色荧光蛋白
光伏门静脉
个人简历中央静脉
全国人大非实质细胞
FACS公司荧光激活细胞分选
美国公共广播电视公司磷酸盐缓冲盐水
静脉注射。腹腔内的
iauc公司美国的动物管理与使用委员会

脚注

补充在线信息中提供了其他方法。

工具书类

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