实验医学。2013年9月；6(3): 847–851.
牙周炎患者牙龈组织中IL-6、IL-8和TNF-α水平的评估
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通信地址：韩国首尔130-701，Kyungheedaero 26，Dongdaemun-gu，Kyonghee University，牙科学院，正畸学系，Young Guk Park博士，电子邮箱：rk.ca.uhk@krapgy 这是一篇根据Creative Commons Attribution-NonCommercial 3.0 Unported License授权的开放存取文章。文章可以重新分发、复制和用于非商业目的，前提是正确引用了原始来源。
摘要
在牙周病中，炎症介质，包括白细胞介素（IL）-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），可能会促进炎症牙周组织的退化。在之前的研究中，这三种细胞因子的水平在炎症牙龈组织和龈沟液中被证明升高。本研究的目的是量化牙周炎患者牙龈组织中IL-6、IL-8和TNF-α的水平，并评估这三种细胞因子之间的相关性。在本研究中，收集了19名牙周炎患者（男性，n=14；女性，n=5）的人类牙龈组织。将组织匀浆、离心，并对上清液中的蛋白质进行定量。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IL-6、IL-8和TNF-α水平，平均水平分别为8.41±0.25、34.01±1.09和20.70±0.31 pg/ml。IL-8的平均水平高于其他两种细胞因子。在每个样本中，TNF-α的表达水平一直很高，结果之间几乎没有差异，这与IL-6和IL-8水平的波动形成对比。两种ILs（IL-6和IL-8）的表达呈正相关（r=0.932，P=0.01），而TNF-α水平与IL-6或IL-8水平无关。这些结果表明，IL-6、IL-8和TNF-α可能与牙周炎的病理生理有关，这些细胞因子的测定可能有助于牙周炎患者的鉴别。
关键词：白介素-6、白介素-8、肿瘤坏死因子-α与牙周炎
介绍
人类牙周病主要由革兰氏阴性菌感染引起，例如牙龈卟啉单胞菌和连翘拟杆菌(1). 这些细菌与宿主免疫系统之间的复杂相互作用可能导致炎症，导致支撑牙齿的胶原结构丢失(2,三). 牙周病涉及多种炎症介质，如白介素-1、白介素-6、白介素-8、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、前列腺素和基质金属蛋白酶（MMPs）(4,5). 这些介质可能影响白细胞、成骨细胞和破骨细胞的活性，并促进系统和局部的组织重塑过程(6–8). 胶原酶，包括基质金属蛋白酶，由多种炎症细胞因子介导，如IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α(9,10).
IL-6是一种多功能细胞因子，具有多种生物学活性，包括B淋巴细胞分化、T淋巴细胞增殖和B淋巴细胞刺激免疫球蛋白（Ig）分泌(11). 特别是，IL-6自身以及与其他骨吸收剂联合诱导骨吸收(12). IL-8，以前称为中性粒细胞激活肽-1（NAP-1），通过其吸引和激活中性粒细胞的能力，在炎症过程的启动和发展中起重要作用(13). IL-8介导的对炎症牙龈中性粒细胞的趋化和激活作用可能有助于牙周组织的破坏(14). TNF-α主要由单核细胞和巨噬细胞分泌，是一种强效的炎症细胞因子，可上调胶原酶、前列腺素（PG）E2、趋化因子和细胞因子、细胞粘附分子和骨吸收相关因子的产生(10,14).
已观察到慢性炎症牙龈组织以及牙周炎患者龈沟液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平升高(8,10,14–18). 有研究表明，IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白表达水平可能是牙龈和牙周炎症的临床参数。本研究的目的是量化IL-6、IL-8和TNF-α水平，并评估牙周炎患者人类牙龈组织中这些炎症标记物的相关性。
主题和方法
研究对象和机构审查委员会（IRB）
本研究是根据赫尔辛基宣言的指导方针进行的，并由韩国首尔庆熙大学牙科医院IRB批准（注册号：2009-1）。参与者自愿提供书面知情同意书。19名年龄在25-70岁之间的牙周炎患者（49.2±12.7岁，平均年龄±标准差）被纳入本研究，使用19名患者的牙龈组织进行研究。在患者进行牙周手术时采集样本。牙周炎病变组织由京熙大学牙科医院牙周病学系的牙周病专家收集。
牙周炎患者组织中总蛋白的提取
每个样品在500 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS；137 mM NaCl，10 mM Na）中均质2高性能操作4和2.7 mM KCl；pH值7.3）和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（韩国首尔罗氏公司）。样品在16000×g的温度下在4°C下离心15分钟，上清液在−70°C下冷冻，直到测试。使用Bio-Rad蛋白质分析（美国加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad-Life Science Group）量化蛋白质浓度。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
根据制造商的说明，使用人类IL-6、IL-8和TNF-αELISA Max™Set Deluxe（BioLegend，Inc.，San Diego，CA，USA），通过ELISA对组织中IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α水平进行评估。简言之，在进行检测的前一天，96个平板涂上捕获抗体。在4°C下孵育18小时后，用含有0.05%吐温-20的PBS（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）洗涤平板，然后在室温下用稀释缓冲液孵育1小时以阻断非特异性结合。清洗后，向每个孔中添加100 ml样品（100 mg），然后在室温下培养2 h。清洗平板后，向每个孔中添加100 ml生物素化检测抗体。在进一步清洗之前，将平板培养1小时。在此之后，向每个孔中添加100 ml亲和辣根过氧化物酶（HRP），然后在室温下培养30分钟。在进一步洗涤后，添加3,3′，5,5′-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液，并在黑暗中孵育15 min。通过添加100 ml 2 N硫酸停止反应，并测量450 nm和570 nm处的吸光度。
统计分析
使用SPSS 20.0统计软件（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）对相关线进行统计分析。计算三种细胞因子表达的每个组合的数据集的皮尔逊相关系数（r）和相关概率（P）。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异(19).
结果
该研究使用了19名牙周炎患者（男性14名，女性5名）的人类牙龈组织样本。ELISA法检测IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白表达水平。如所示在所有牙龈组织样本中检测到三种靶细胞因子的蛋白表达，与其他两种细胞因子相比，IL-8的水平特别高。
表一
| 不。 | 性别 | 年龄（岁） | IL-6（微微克/毫升） | IL-8（微微克/毫升） | 肿瘤坏死因子-α（pg/ml） |
|---|
| 1 | M（M） | 49 | 3.53±0.42 | 20.49±2.24 | 21.42±1.74 |
| 2 | M（M） | 54 | 10.21±0.07 | 44.06±1.17 | 20.87±0.32 |
| 三 | M（M） | 56 | 53.08±0.45 | 97.04±0.01 | 20.28±0.01 |
| 4 | M（M） | 70 | 3.47±0.02 | 19.98±0.33 | 20.51±0.23 |
| 5 | M（M） | 31 | 7.80±0.03 | 23.54±0.37 | 20.32±0.17 |
| 6 | M（M） | 64 | 3.56±0.03 | 22.85±0.67 | 20.87±0.35 |
| 7 | M（M） | 54 | 12.34±0.15 | 49.50±1.64 | 20.50±0.13 |
| 8 | M（M） | 42 | 7.02±0.24 | 30.40±2.70 | 20.96±0.18 |
| 9 | M（M） | 47 | 4.72±0.04 | 38.13±1.06 | 21.24±0.86 |
| 10 | M（M） | 47 | 3.84±0.01 | 26.88±0.29 | 21.09±0.39 |
| 11 | M（M） | 63 | 10.86±0.75 | 42.94±0.01 | 20.05±0.01 |
| 12 | M（M） | 53 | 3.60±0.01 | 26.71±0.58 | 20.78±0.09 |
| 13 | M（M） | 39 | 3.31±0.01 | 19.53±0.63 | 20.98±2.86 |
| 14 | M（M） | 63 | 8.35±0.23 | 41.06±5.41 | 21.07±2.08 |
| 15 | F类 | 42 | 3.41±0.15 | 21.40±0.01 | 20.09±0.01 |
| 16 | F类 | 65 | 7.12±0.01 | 28.99±2.51 | 21.52±0.77 |
| 17 | F类 | 25 | 3.40±0.04 | 24.23±0.01 | 20.06±0.01 |
| 18 | F类 | 32 | 5.89±0.03 | 42.53±0.20 | 20.02±0.09 |
| 19 | F类 | 40 | 4.20±0.25 | 26.00±0.92 | 20.66±0.06 |
在和本文报告了19例牙周炎患者牙龈组织中IL-6、IL-8和TNF-α的浓度。观察到大多数患者的IL-6水平在3至13 pg/ml之间，只有一名患者例外（3号，53.08±0.45 pg/ml；). 同样，检测到IL-8水平在19至50 pg/ml之间，只有一名患者例外（3号，97.04±0.01 pg/ml；). 然而，所有样本中的TNF-α水平均在20至22 pg/ml之间(). 19名患者的IL-6和IL-8水平存在个体间波动，而TNF-α水平差异不大(). 如所示IL-6、IL-8和TNF-α的平均水平分别为8.41±0.25、34.01±1.09和20.70±0.31 pg/ml。在三种受试细胞因子的比较中，IL-8高表达，而IL-6低表达，TNF-α中度表达。14名男性患者中IL-6、IL-8和TNF-α的平均水平分别为9.69、35.93和20.78 pg/ml，5名女性患者中分别为4.80、28.63和20.47 pg/ml（数据未显示）。尽管女性样本数量较少，但五名女性患者的IL-6和IL-8平均水平似乎低于19名患者的整体水平，而五名女性病人的TNF-α平均水平与19名患者一致。5名女性患者的IL-6平均水平（4.80 pg/ml）约为14名男性患者的49.5%（9.69 pg/ml。
牙周炎患者的蛋白质水平：（A）白细胞介素（IL）-6，（B）IL-8和（C）肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。（D） 19例患者牙龈组织中IL-6、IL-8和TNF-α的平均水平。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）评估蛋白质水平，并独立进行三次三重试验。数据表示为平均值±标准偏差。
如所示，评估三种细胞因子水平的Pearson相关系数（r）和相关概率（P）。IL-6和IL-8水平呈正相关（r=0.932，P=0.01）；然而，TNF-α水平与IL-6或IL-8水平无关（数据未显示）。
通过皮尔逊相关系数（r）和相关概率（p）评估白细胞介素（IL）-6和IL-8水平之间的相关性。
讨论
牙周疾病可能导致慢性炎症和牙列支撑结构的破坏。牙周病是由革兰氏阴性细菌感染引起的，这种细菌会产生脂多糖（LPS）(1). 细菌感染和栖息是牙周炎的病因，因为宿主对这种感染性生物的反应和免疫反应介导了牙周炎，而不是感染本身(1). 先前的研究揭示了TNF-α的作用(5)，IL-1β(14)IL-6和IL-8(20)作为促炎细胞因子。与其他炎症性疾病一样，包括IL-6、IL-8和TNF-α在内的促炎细胞因子似乎是牙周炎的主要介质(14). 因此，本研究调查了牙周炎患者牙龈组织中IL-6、IL-8和TNF-α的表达水平。
IL-6由许多不同类型的细胞产生，例如单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、T细胞和B细胞以及角质形成细胞。IL-6也在多种涉及宿主免疫反应和炎症反应的情况下表达(10). 关于牙周疾病，一项免疫组织化学研究发现，炎症牙龈组织中IL-6的表达水平高于健康对照组织(21). 此外，先前使用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和ELISA获得的数据表明，牙周病患者IL-6的mRNA表达和蛋白表达增加(22,23). 本研究的数据显示，IL-6在19名牙周炎患者的牙龈组织中均有表达。本研究使用ELISA获得的IL-6水平结果与之前的研究结果一致。
IL-8是一种既定的趋化蛋白，在炎症的人类牙龈组织中释放(10,24). 与基线表达相比，感染性有机体影响的牙龈成纤维细胞表达较高水平的IL-8 mRNA(23). 我们的数据表明，IL-8在所有牙周炎患者的牙龈组织中都有高表达。目前的结果与以前的研究结果一致。然而，IL-8的平均水平高于IL-6或TNF-α。此外，如所示IL-8水平与IL-6水平呈正相关。结果表明，IL-8可能在牙周炎患者的鉴别中起重要作用。
TNF-α被认为是参与牙周病发病机制的主要细胞因子，影响牙周炎组织破坏和侵蚀反应的后果(25). TNF-α由单核细胞和巨噬细胞产生，以响应口腔细菌成分，如LPS。TNF-α水平升高可能促进人牙龈成纤维细胞胶原酶的释放(10)导致软骨胶原破坏和骨吸收(25). 已经证明，TNF-α水平与慢性退行性改变的表现（如牙龈指数、菌斑指数或探测深度）之间没有相关性(26). 因此，有人认为TNF-α可能是炎症活动的标志物。在目前的结果中，与IL-6或IL-8水平的波动相比，19名患者的TNF-α浓度几乎没有差异。此外，TNF-α的表达与IL-6或IL-8水平无关。结果表明，在牙周炎的病理生理学中，ILs和TNF-α可能通过不同的途径表达。
总之，用ELISA法检测了19例牙周炎患者牙龈组织中三种细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-8）的水平。TNF-α、IL-6和IL-8的平均水平分别为8.41±0.25、34.01±1.09和20.70±0.31 pg/ml。两种ILs（IL-6和IL-8）的表达呈正相关（r=0.932，P=0.01）。提示牙周炎中这些炎性细胞因子水平的升高可能对疾病的监测和治疗决策具有诊断和预后潜力。
致谢
本研究得到了韩国教育、科学和技术部国家研究基金会生物研发项目（批准号：2009-0092562）的支持。
工具书类
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