外显子序列测定与复杂性状的遗传基础

摘要

外显子组测序的前景

下一代测序^1–5再加上高效的DNA捕获^6–8使外显子组测序成为研究人类表型遗传基础的一种新方法。使用这种方法绘制了许多孟德尔病的基因图谱^6,9–15外显子组测序也已应用于肿瘤^16–20其中，样本纯度、读谱和染色体重排至关重要，并且形成了一系列非常独特的问题。从这个角度来看，我们将注意力局限于复杂的特征。在复杂性状遗传学中，外显子组测序研究揭示了基于微阵列的全基因组关联研究（GWAS）无法检测到的罕见编码变异。复杂性状外显子组测序研究的前景是基于候选基因研究的成功^21–26在种群遗传理论方面有着坚实的根基^27–35.

复杂性状的大规模GWAS一直表明，除了少数例外，常见变异具有适度影响，通常需要成千上万个样本进行检测。外显子组测序通过全面评估所有常见和罕见编码变异的作用提供了一种补充方法。每个蛋白编码基因不断发生突变（比率为～10⁻⁵非同义变异体的每个基因^36–39)健身损失不到1%^29–31,34对于大多数新的非同义突变，几乎每一个基因都有功能重要的变异，可以通过测序进行检测，即使这些变异很罕见。因此，外显子组测序的强烈兴趣源于三个因素：识别复杂性状下许多基因的潜力，编码变异的直接功能注释，以及成本比全基因组测序低得多（约5倍）。

从这个角度来看，我们评估了经验数据中罕见编码变异的程度，讨论了原始序列数据的数据处理和质量控制，回顾了检测基因型-表型关联的分析方法，它们的预期统计能力，以及由于人口分层而导致混淆的可能性。为了说明我们的论点，我们使用了来自国际HIV控制者研究的184名个体的经验全序列数据⁴⁰来自精神分裂症（SCZ）外显子组测序研究的254名对照个体。

经验数据中罕见编码变异的评估

外显子测序数据包含大量罕见的编码变异，表明这种变异的很大一部分是功能性的。不仅有比普通变异体更多的稀有变异体，而且对更多样本进行测序也会继续发现更多的罕见变异体。事实上，随着样本量的增加，观察到的变异数的增长速度远远快于恒定人口规模中性模型的预测^41,42(图1). 这种罕见变异的相对过剩部分归因于最近的人口扩张^43–45，但也可能是由于净化选择。因此，罕见的变异因进化上有害的变异而丰富，因而具有功能性。此外，非同义变体在罕见变体中的比例高于常见变体⁴⁵最后，在罕见的变体中，预测了错义变体⁴⁶破坏性基因比良性基因更普遍(图1). 这些发现与研究一致，研究表明蛋白质编码区的罕见变异正在净化选择中^35,47–51由于对较大样本进行测序会不断发现功能相关的变异，外显子组测序研究能够直接识别因果变异（与GWAS相比，GWAS使用共同标记之间的连接-不平衡模式）。

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图1

发现新的变体，用于增加样本数量。对于每个函数类，将该类的一个样本中变体数量的折叠增量绘制为测序实验中样本数量的函数。例如，300个样本中发现的无意义变体的数量是单个样本中发现平均数量的40倍，而同义变体的数量仅是单个样本的10倍（尽管无意义变体绝对数量在发现的总变体中所占比例相对较小）；这种影响是由于净化选择造成的。在恒定规模的种群中，所有种类的变异都以超过中性进化模型预测的速度被发现，这是种群增长的一种影响。同义变体曲线与理论预测之间的交叉很可能是非洲以外瓶颈的标志。有关其他详细信息，请参见方法。

外显子组测序数据集的变异调用和质量控制过滤

外显子组测序研究从外显子捕获和DNA样本测序开始，然后识别序列变体。外显子组捕获可以在许多平台上实现（例如，Illumina HiSeq、Roche 454、ABI SOLiD），并通过各种探针定义（例如，Agilent SureSelect、Nimblegen SeqCap EZ）。最近的进展使得在测序仪器的单次运行中，可以对整个外显子组甚至几个外显子进行深度覆盖测序。然而，外显子组捕获技术的目标、捕获量以及捕获的一致性各不相同⁸此外，只有80-90%的靶区在10×以上被覆盖，这可能会留下4-8Mb（或1000-2000个基因）的变异检测覆盖不足。

外显子组测序覆盖范围具有巨大的区域差异⁸。一些区域可能被过度覆盖，代表真正的结构变异（例如，参考基因组中只有一个区域拷贝的片段复制），或技术伪影（例如，捕获探针更丰富，或导致“双重捕获”的重叠探针定义）。同样，一些区域可能由于生物原因（例如，参考序列中存在多个拷贝的片段复制，阻止对准器唯一放置读数）或技术原因（例如GC含量高或变异密度高，这会影响探针的杂交）而被覆盖不足。此外，目标边界50 bp内的一些“近目标”区域可以有足够的覆盖范围，以保证包含在变体调用中。关键的是，无论使用哪种捕获技术，都应该使用相同的技术处理所有样本，或者应该解释变异性，例如，通过技术对研究进行分层（参见人口分层部分）。

对于这个透视图，我们使用两阶段方法从438个样本（参见方法部分）中生成了完整的数据（目标为28Mbp）^52,53首先，我们应用了前面描述的数据处理和变量调用协议⁵⁴其次，我们应用了SNP调用后质量控制（QC）过滤器。

为了对产生的SNP进行质量控制，我们使用了群体遗传统计和人类遗传变异的特性。使用这些统计数据有助于识别真正的变体，因为突变过程的特性^37,55不同于测序技术的错误。

我们比较了Complete Genomics Inc.（CGI，见URL）发布的438个样本数据集和37个全基因组数据集中计算的统计数据，只关注与外显子组数据相同的基因组区域。CGI全基因组数据集是一个很好的比较，因为全基因组测序不依赖于外显子捕获技术。我们进一步将这些逐样本统计分为生物学上有趣的类（功能类和CpG状态），但也可能显示出不同的技术伪影率。表1显示了过滤对于实现高质量呼叫至关重要。在过滤之前，指标显示出与预期值的显著偏差，这可能表明假阳性率很高。过滤后，统计数据收敛到CGI数据集中的统计数据。通过与人类黑猩猩的差异性进行比较，也可以看出过滤器的有效性⁵⁵.

新变体站点的数量（此处定义为dbSNP 129中不存在）是SNP调用质量的另一个度量标准(补充表1). 大多数新变体的频率较低，特别是在单光子和双光子中富集。单值和双值对于区分误报尤其重要，因为数据处理中的技术伪影或错误很容易表现为新的变化。

转换/转换比（Ti/Tv）和新变体数量等统计数据可用作数据集质量的总体指导，并可比较来自同一数据集的两组调用。然而，对这些统计数据的准确预期尚不清楚，因为它们取决于许多因素，包括覆盖不均、DNA质量的变异性或其他技术偏差来源，如机器错误。因此，解释这些统计数据中与预期的微小差异是很重要的。基因分型验证提供了一种独立于群体遗传学统计数据的callset质量的额外测量方法。将基因分型数据与测序数据进行比较，可以通过计算非参考敏感性（“NRS”-基因分型中非参考位点在测序数据中恢复的速率）和非参考差异率（“NRD”）直接测量调用集质量-测序和基因分型数据中的基因型差异率）。基因分型分析应包括不同等位基因频率的位点，尤其是低频（～1%）。如果可用，家庭数据，尤其是三人组，也可以用于评估呼叫集质量。

将我们的调用集与重叠站点相同样本中的GWAS数据进行比较，表明对常见变体具有较高的敏感性（98.6%NRS）。为了评估可比较测序数据集中低频变异呼叫的质量，我们将CGI数据与1000基因组项目的Omni芯片进行了比较(补充表2). 这种比较导致新变体的NRS为95.65%，NRD为1.79%，NRD是1.12%。

尽管有严格的质量控制，基因分型和测序错误仍然存在。不幸的是，当基于假定的功能后果对变体进行分层时，注释为最有害的变体类别也会因错误而更加丰富⁵⁶这突出了严格质量控制的重要性。

至关重要的是，要非常小心地防止测序中的技术偏见和混淆，以避免扭曲关联结果。例如，（稀有和珍贵）病例样本与对照样本处理方式的差异可能导致系统性假阳性，并伪装成有趣的关联。同样，只调用病例或只调用对照的同时多样本变异体可能会导致不同批次变异体的差异检测，从而对等位基因频率估计和关联分析的准确性产生负面影响。许多其他技术混淆因素（例如DNA制备、外显子捕获技术、机器类型、读取长度、覆盖深度、SNP调用算法、QC过滤器）可能会影响外显子序列数据的属性，这些技术混淆因素通常是理解不足或隐藏的。因此，尽管使用共享对照（例如，来自1000基因组项目）有助于“过滤”孟德尔疾病的方法^6,9，不太可能适用于复杂疾病的关联分析。

罕见变异分析的统计方法

对罕见变体的分析需要使用与用于测试常见变体的关联统计有根本不同的统计方法。这有两个原因。首先，罕见的变异必须结合在一个基因（或通路）中，才能进行关联测试以达到足够的功效⁵⁷例如，在200例病例和200名对照的样本中，一个频率为1/500的因果SNP和基因型相对风险为10，在GWAS的传统显著性阈值下检测到的功率为0.2%（P<5×10⁻⁸). 其次，功能和群体遗传学信息可以添加到测试方法中，因为外显子组测序全面捕获了可以用这些信息注释的变异。

早期复杂性状的候选基因测序研究基于病例或对照组（或性状分布极端的样本）独有的非同义等位基因数量的比较^21,26这种方法的功效有限，因为它忽略了常见的和低频的多态性，因为大多数这种变异都会出现在病例和对照中。最近，为稀有变量分析设计了一些统计检验。多变量和崩溃（CMC）综合测试⁵⁸联合评估罕见和常见变异的作用。对于常见变量，采用传统的基于回归的关联。对于罕见变异，如果个体在该区域至少拥有一个罕见变异（例如基因），则回归模型中的个体预测值定义为1，否则为0。加权和统计（WSS）检验⁵⁹，为所有个体创建复合基因型得分。该分数是由二项式方差的倒数加权的替代等位基因的总和。然后对表型组之间的基因型得分进行秩和检验。基于内核的自适应集群（KBAC）测试⁶⁰还使用了一个权重方案，该方案反映了各个变量的明显影响大小。将罕见变异组合成单一测试的另一种方法是根据观察数据选择等位基因频率阈值。这种可变阈值（VT）方法⁶¹受群体遗传模拟的激励，表明不存在单一的最优加权方案或等位基因频率阈值。对于复杂性状中的罕见变异，还有许多其他统计测试（参考文献中综述）。^62–65).

在模拟研究中⁶⁴，在许多情况下，大多数测试的行为都类似。然而，结果可能取决于模拟数据中使用的假设。检测关联的相对能力取决于因素，如因果变异的数量和比例、它们的群体频率和影响大小，以及影响的方向性、影响性状的基因数量和外显子中因果遗传变异的比例。统计测试是根据这些因素的不同组合而开发的，因此可能对不同的疾病结构敏感。例如，WSS测试开发中使用的模拟框架假设效果大小与1/x（1−x）（其中x个是因果等位基因的群体频率），而序列核关联测试（SKAT）⁶⁶仿真框架使用的效果大小与−对数（x）VT测试模拟使用一个人口统计历史模型，该模型具有一系列可能的选择强度值，导致效应大小和x个这些模拟旨在证明不同效应大小分布下每种方法的优势：WSS的效应大小与1/x（1−x），SKAT是为与β密度成比例的效果大小而设计的β（x；a）₁，一个₂)对于预先指定的₁和a₂，C-α⁶⁷该测试是针对同一区域内相反方向的效应而设计的，而VT测试对效应大小分布没有任何假设。

当组合罕见的变体时，可以假设所有功能变体都在同一方向上影响性状，或者允许某些功能变体具有相反的作用方向。可以提出一个生物化学论点，即大多数非同义变体是功能丧失亚变体，而功能获得变体很少。然而，一些基因（例如PCSK9⁶⁸)有两种变体。一些测试允许罕见的变异对性状产生相反的影响（例如，加速⁶⁹，C-alpha，基于复制的测试⁷⁰，SKAT）。这些测试要么基于过度分散分析，要么基于显式线性模型，该模型根据数据中观察到的效果方向确定变量对分数的贡献。

候选基因的模拟和测序研究证明，通过功能重要性对罕见等位基因进行分层或加权，Rare-variant测试可以受益^{61,64,71–73.}稀有变量检验的威力受到所分析的所有变量中因果变量的比例的强烈影响，使用功能信息是对可能的因果变量赋予更大权重的有效方法。例如，无意义变体的优先级应高于非错义变体。同样，错义变体的优先级应高于同义变体。通过使用比较序列分析和蛋白质结构分析检查氨基酸变化的影响，可以预测变体的功能后果。许多计算预测和守恒^74,75方法可用（参考文献中进行了综述）。^76–79). 这些方法的准确度约为80%⁸⁰罕见变异体的死亡率可能最高（真正的功能变异体很可能有害，通过净化选择保持在低频率，因此常见变异体最有可能是中性和无功能的）。因此，使用预测方法可以丰富功能变量，从而提高关联测试的能力。然而，由于这种预测并不完美，因此应该通过权衡变量来定量使用它们，而不是通过筛选变量来定性使用它们。许多测试允许将预测分数纳入测试统计，例如VT测试、KBAC、SKAT、罕见变量加权总统计（RWAS）⁷²、似然比测试（LRT）⁷³PLINK/SEQ套件包括预计算的PolyPhen-2⁴⁶人类所有可能的错义变化的预测分数，这使得这些分数很容易适用。

外显子组测序研究的一个重要考虑因素是选择解释多重测试的显著性阈值。一个简单的方法是对20000个独立测试（每个基因一个测试）采用Bonferroni校正，对于实验范围内的显著性0.05，这将得出一个第页-2.5×10的阈值⁻⁶每个基因。然而，这样的阈值可能过于保守，因为它假设每个被测基因都有足够的变异来达到测试统计量的渐近性质。例如，如果在一个给定的基因中只有2个个体携带非同义变异体，那么病例和对照之间的差异永远不会超过2个总观察值，因此最显著的是第页-假设这两个变量是独立的，则可以实现的值约为0.25。因此，除非研究规模较大第页-这些值的显著性通常低于零假设下的预期。图2a在438个外显子上显示了这种效应。PLINK/SEQ套件根据数据计算所谓的i-stat，这是对可实现的最小值的估计第页-基因的值。i-stat可以通过设置阈值（例如，10⁻³)并且，只有根据i-stat高于阈值的基因没有发现关联的能力的想法，修正i-stat低于阈值的基因数量。另一种纠正多重测试的方法是通过表型标签的排列计算实验范围内的显著性阈值，创建最小值的经验分布第页-所有基因在排列中的值，并比较最小值第页-从实际数据到该分布的值(图2b). 这种方法有效地控制了I类误差，并且比Bonferroni校正更不保守。重要的是第页-通过排列计算的阈值取决于研究和统计检验。然而，通过置换进行的实验范围的校正对混淆并不稳健，对于i-stats小于阈值的基因，评估测试统计分布的质量至关重要，以确保对分布进行适当校准。然而，随着样本量的增加，测试的维度也将增加，研究将评估近20000个测试。因此，对于大型研究，我们认为Bonferroni阈值更可取。

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图2

关联分析。(一)关联Q-Q图第页-零假设下的值。(b条)最低分配第页-全xome置换下的值。直方图显示了最低值的分布第页-T5测试的排列值。红色垂直线表示最显著基因的0.05外显显著水平（即，如果其第页-值低于红线指示的级别）。

外显子组测序研究的统计能力

外显子测序研究的威力受到基因变异量的限制。因此，对于具有更多变体的基因，例如较长的基因或突变率较高区域的基因，其功效更高。此外，大多数变异体具有因果关系的基因比那些只有少数变异体的基因更容易识别。在单个候选基因测序研究中，估计这一比例在30%到70%之间^21,22,26.因此，效应大小不仅是单个变量的属性，而且是效应分布的反映，以及如何通过测试解释这些效应。一些统计测试明确说明了在评估关联证据时权力的差异⁸¹.

鉴于样本大小、因果变异的可能影响大小和频率以及基因中因果变异的比例，当前外显子组测序研究是否有足够的能力检测复杂表型下的基因？外显子组测序研究的热情在一定程度上源于成功的候选基因测序研究，因此我们试图测试外显子测序是否有足够的能力检测候选基因方法发现的基因。到目前为止，还没有发表候选基因研究报告第页-在完整外显子组的背景下具有重要意义的值(表2). 这尤其引人注目，因为一些候选基因研究使用的样本量（数千个个体）比正在进行的外显子组测序研究（数百个个体）大得多。这表明，目前的外显子组测序研究在检测等位基因分布和效应大小与已发表的例子相似的基因方面能力不足。事实上，从已发表的研究中推断出的效应大小和频率表明(图3)成千上万的人需要达到可接受的统计能力。这一分析与早先基于群体遗传模拟的研究一致，该研究得出的结论是，要获得令人满意的能量，需要多达10000个处于表型极端的个体³⁰第一个GWAS^82–84他们的能力也极为不足，但成本下降和在荟萃分析中结合研究，使他们能够快速创建强有力的研究和许多发现。同样，随着测序和靶向富集成本的下降⁸⁵外显子组测序很快将为许多研究小组所负担，我们预计将成立联盟，以促进外显子测序数据的汇集，从而实现更有力的研究和新一轮的发现。

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图3

基因负荷结果外推。水平实线红线显示Bonferroni全基因组显著性阈值P=2.5×10⁻⁶。水平虚线表示从全xome置换导出的阈值(图2b). 对于较大的样本量，置换阈值将更接近Bonferroni阈值，随着样本量的增加逐渐接近该阈值。

复制以确认关联

为了发现强有力的关联，外显子组测序研究中的复制将至关重要。由于早期的小型研究将不可避免地缺乏动力，任何基因都不可能达到外显统计意义。在这种情况下，除非对多个测试进行严格修正，否则研究人员应抵制应用一系列统计测试的诱惑，每个测试都有不同的权重方案和变量选择。我们强烈主张，只有复制了关联，才能认为关联是真实的。一个合理的复制策略是根据关联强度选择几个基因（例如10个）⁸⁶从发现阶段和先前的生物合理性来看。然后必须对新样本进行测序和稀有变异关联，使用只适用于（较小的）候选基因集的多重测试校正阈值。

人口分层

人群分层-病例和对照之间的系统祖先差异-是遗传关联研究中一个研究得很好的混淆因素⁸⁷在GWAS中，纠正分层的常用方法包括按人口聚类分层（结构化关联）、主成分分析（PCA）和混合模型^87–90也可以应用基因组控制，但它通常更适用于评估分层，而不是校正分层^87,91.

一个重要的问题是，种群分层是否会混淆外显子组测序研究，如果是，如何在这种情况下纠正分层。尽管过度重复变异测试与单变异测试有着本质上的不同，但分层的可能性仍然存在，因为结构化人口样本中的祖先不同（例如，非洲裔美国人的非洲和欧洲血统，或欧洲裔美国人的北欧和南欧血统）由于不同的人口统计学历史，可能有不同的等位基因频谱。例如，在一项针对非裔美国人的外显子组测序研究中，疾病病例的非洲血统多于对照，人们预计病例中会出现过多的罕见变异，因为非洲染色体携带更多的罕见变异⁹².

我们创建了一个假设的病例对照外显子组测序研究，包括实际测序数据和模拟表型数据，使用438个个体，分为两个群体（见方法）。为了诱导人群分层，我们将病例对照状态随机分配给每个样本，偏向于从一个人群中选取更多病例，从另一个人群选取更多对照。关联测试表明虚假膨胀率具有统计学显著性第页-值。我们通过修改排列方案来解释子种群，从而纠正了种群分层。这种纠正在控制所有关联测试中的I型错误方面是有效的。

我们的模拟表明，外显子序列研究可能会受到人口分层的影响，这可能会产生虚假的关联。我们已经证明，当与全基因组祖先对应的离散簇已知或可以通过对GWAS芯片数据应用标准方法进行推断时，简单的置换方案足以纠正种群分层^88,89,93置换方案很有吸引力，因为它概括了多个罕见变异体测试的大多数负担，然而，在人口结构最好由连续梯度而不是离散簇来描述的情况下，一些测试也可能适合使用PCA协变量⁸⁹.

结论

外显子组测序研究带来了以公正的方式对编码变异进行全面测试的希望。然而，我们预计初步研究将动力不足，并且我们已经强调了一些技术问题，这些问题可能会影响对罕见变体数据的解释和分析，尤其是新变体。我们预计，需要数千个外显子才能获得足够的统计能力，以稳健地检测罕见变异与复杂性状的关联。我们在这个观点中讨论的问题也与未来的全基因组测序研究有关，其中蛋白质编码变异的分析将与外显子的分析保持一致。

仅关注外显子组是复杂性状遗传学中的一个特别严重的限制，在这种情况下，非编码遗传变异被认为比孟德尔遗传学或体细胞癌遗传学发挥更大的作用。然而，有明确的理由从exome开始。首先，将多种罕见变异组合在一起的统计方法在非编码区是有问题的，因为没有一组容易识别的位点携带具有单向表型效应的变异。其次，调控区域中的变体可能具有较小的影响大小。相反，蛋白质编码基因为该位点的突变提供了一个明确且可解释的靶点。这些突变产生的变异，在一项有力的研究中，突显了基因座和性状的关联。因此，尽管聚焦于外显子不太可能解释所有的遗传力，但它有可能突出复杂性状中的基因。

尽管本观点中讨论了一些挑战，但观察到人类群体中存在大量具有重要功能的编码变体，这给我们带来了希望，外显子组测序方法最终将有助于识别许多对复杂性状和疾病重要的基因座。

方法

补充材料

致谢

脚注

工具书类