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《公共科学图书馆·病理学》。2013年5月；9（5）：e1003358。
在线发布2013年5月9日。 数字对象标识：10.1371/日志.ppat.1003358
预防性维修识别码：PMC3649991型
PMID：23671419

单分子敏感性FISH分析显示流感病毒出芽前细胞质中不同RNA片段的克隆化

周一英,1 尼古拉斯·希顿,1 秦山高,1 帕雷斯,1,2 罗伯特·辛格,三,4和蒂莫塞·利奥内特三,4,*
Sean P.J.Whelan，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

甲型流感病毒基因组由八个负义单链RNA片段组成。虽然已经确定大多数病毒颗粒都含有八种病毒RNA中每一种的单一拷贝，但包装选择机制仍不清楚。流感病毒RNA在细胞核内合成，输出到细胞质，然后到达质膜，在那里发生病毒出芽和基因组包装。由于在分析相关vRNP的同时保留其在细胞内位置的信息方面存在困难，目前尚不清楚不同片段的病毒RNA在细胞贩运过程中如何以及在何处相遇。使用多色单分子灵敏度荧光就地杂交（smFISH）方法，我们定量监测了流感病毒RNA对在感染细胞中的共定位。我们发现，感染后，来自传入粒子的病毒RNA一起传播，直到到达细胞核。然后在细胞核的不同位置检测到病毒RNA；然后它们被单独输出，最初在细胞质中保持分离。在以后的时间点，不同的病毒RNA片段以微管独立的方式聚集在细胞质中。当不同身份的病毒RNA与Rab11阳性囊泡相关时，它们以较高的频率共定位，这表明Rab11正细胞器可能促进不同病毒RNA的关联。使用缺乏HA或M2蛋白表达的工程流感病毒，我们发现这些病毒蛋白对细胞质中两种不同病毒RNA的共定位不是必需的。总之，我们的smFISH结果显示，病毒RNA在到达质膜出芽部位之前，在细胞质中一起旅行。基因组包装过程的这一新特征步骤证明了感染周期的精确时空调控。

作者摘要

甲型流感病毒是人类主要呼吸道感染疾病之一。病毒的基因组由八个不同的RNA片段组成，所有八个RNA片段的结合是产生感染性病毒颗粒所必需的。由于用单分子分辨率确定不同vRNA片段在感染细胞中的位置的方法的局限性，这八个病毒RNA片段如何被联合包装成子代病毒颗粒的精确过程尚不明确。在本研究中，我们建立了一个实验系统，以高空间精度检测感染细胞中不同病毒RNA片段的定位。我们发现，属于不同片段的病毒RNA聚集在细胞质中，这是由细胞再循环内体蛋白Rab11促进的。我们的结果支持了这样一种观点，即八种不同的病毒RNA可能在到达病毒结合位点时形成超复合物。这些发现扩展了我们对流感病毒基因组包装过程的认识，并提出了一种调节不同病毒RNA片段基因组组装的机制。

介绍

甲型流感病毒基因组由八个负意义的单链RNA组成。在病毒颗粒或感染细胞中，病毒RNA以病毒核糖核蛋白复合物（vRNP）的形式存在，病毒RNA（vRNA）由核蛋白（NP）包裹并与聚合酶复合物结合[1]由于每个vRNA编码一到两种必需的病毒蛋白，因此生产感染性病毒颗粒需要所有八种vRNA的包装。多项证据表明，流感病毒选择性地将八种不同的vRNP包装成病毒颗粒[2],[3],[4],[5],[6]; 然而，在病毒感染期间何时何地发生选择仍不清楚。由于适用于检测具有单分子敏感性的不同vRNA片段并保留其在感染细胞中的空间分布的方法的局限性，很难确定不同vRNA段的分离和组装。在本报告中，我们建立了单分子灵敏度荧光就地杂交（smFISH）系统检测并定位感染细胞中的流感病毒vRNAs，从而确定不同vRNPs之间的空间关系。因此，可以高分辨率地研究病毒感染期间不同vRNA片段的组装过程。流感病毒是一种具有核复制阶段的罕见RNA病毒[1]vRNP首先必须通过基质蛋白的解离从病毒粒子中释放出来，然后导入细胞核进行病毒mRNA转录和vRNA合成。vRNP的核导入是一个涉及细胞导入机制的主动过程。NP蛋白上的核定位信号被importinα（核外蛋白α）识别，vRNP和importinα一起与importin-β形成三复合物，通过核孔复合物主动转运到细胞核中[7]生化分析表明，复制的vRNP与密集的染色质有关，而新合成的vRNPs则释放到核质中[8]此外，当vRNP的输出受到抑制时，NP蛋白分布在细胞核的顶面[9]这表明vRNP在核内时开始极化运输。新组装的vRNP被导入细胞质，在细胞质中靶向质膜进行包装。vRNP的出口还依赖于细胞出口机制和流感核出口蛋白（NEP）[10],[11]已经证明，钩端霉素B处理有效地消除了vRNP的输出，表明vRNP从细胞核外的运输是Crm1依赖性途径[10],[12]尽管已经阐明了vRNP进出核的机制，但还不清楚传入的vRNP的不同片段是单独进入核还是作为一个包进入核，以及新合成的vRNPs是否在核内聚集成超复合体以供出口。

有人认为，流感病毒vRNA的重配发生在细胞质中，因为当两种不同病毒感染细胞的细胞质融合时，两种病毒株的片段以随机方式并入子代病毒[13]因此，有可能在核出口后选择要包装的vRNP。输出的vRNP向心尖质膜的转运途径已被证明涉及细胞骨架系统[14]和Rab11阳性再循环内体[15],[16],[17]使用vRNP特异性抗体的活细胞成像显示，复合物沿微管快速双向移动。使用诺卡唑对微管进行解聚可以破坏核蛋白的顶端靶向性，这意味着微管网络参与了vRNP的极化运输[16]Rab11是一种小的GTPase调节蛋白，已被证明定位于内吞再循环内体，并在调节再循环到质膜中发挥重要作用[18]一些研究表明，流感病毒vRNP的顶端转运依赖于Rab11和聚合酶蛋白PB2之间的相互作用[17],[19]目前尚不清楚不同的vRNA片段是否与Rab11再循环内体一起进入质膜，或者不同vRNA的共定位和分类是否发生在质膜上。

在本研究中，我们应用了单分子灵敏度荧光就地杂交分析显示流感病毒感染细胞中不同片段的vRNA。通过使用这项技术，可以非常精确地确定两个不同vRNA之间的共定位程度。通过在感染后的不同时间点对病毒感染的细胞进行smFISH和共定位分析，我们发现传入的vRNP在输入细胞核之前一直保持关联。在细胞核的不同位置检测到新合成的vRNP，当vRNP被加载到Rab11阳性囊泡上时，不同身份的新输出vRNP在复制的后期聚集在一起。在此，我们提供了不同身份的子代vRNP在细胞质中一起旅行的证据。这些结果可能表明，不同的vRNP在运输到质膜时被选入一个预先形成的超复合体中，在质膜中发生芽生和基因组包装。

结果

流感病毒RNA在感染细胞中的单分子敏感性FISH和共定位分析

为了更好地了解流感病毒感染细胞中不同身份的vRNA之间的相互作用模式，我们建立了一种单分子敏感性荧光就地流感病毒vRNAs的杂交（smFISH）系统，以确定其在感染细胞中的位置。使用48个单荧光标记的短DNA寡核苷酸靶向同一vRNA的不同区域，获得了单分子灵敏度。靶向vRNA被多个探针同时结合，发出高荧光强度信号，使它们可以区分为衍射线斑点。然后可以使用成像处理程序来确定斑点的数量及其中心在三维空间中的位置。当使用48个针对PB2片段的Cy5标记探针时，在感染后4小时（hpi），在流感A/波多黎各/8/34（PR8）病毒感染细胞中可以观察到荧光斑点，但在模拟感染细胞中未检测到斑点(图S1A). 这表明smFISH系统对vRNAs具有高度特异性。成像分析程序检测到的荧光斑点在尺寸上与衍射斑点相同，荧光颗粒显示出独特、明确的荧光强度峰值，这强烈表明使用该系统检测到了vRNAs的单分子(图S1B). 为了进一步测试探针组对不同种类流感病毒vRNA的特异性，设计并合成了针对编码H1亚型和H9亚型头部区域的HA vRNA的探针组。H1 HA vRNA的探针用Cy3荧光团标记，而H9 HA vRNA探针则用Cy5荧光团标记。将两个不同标记的探针组混合使用，用于就地在感染携带H1-HA片段的野生型PR8病毒或重组PR8 cH9/1病毒的细胞上进行杂交，重组PR8病毒包含编码H9亚型HA头部区域的HA片段和H1-HA茎。在感染PR8病毒的细胞中，只能在Cy3通道中观察到荧光斑点，而在Cy5通道中则无法观察到。这证明了探针与H1 HA vRNAs的特异性结合。另一方面，在感染重组PR8 cH9/1病毒的细胞中，只能在Cy5通道中检测到荧光点，显示探针对H9 HA vRNA的特异性杂交(图S1C). 该实验证明了smFISH系统的高序列特异性，并表明在杂交过程中混合两个针对不同种类vRNAs的探针组可以保持特异性。这允许同时检测同一细胞中不同片段的vRNAs。

为了测量不同身份的vRNA之间的共定位程度，用两组针对两种不同vRNA的探针固定并杂交感染病毒的细胞，一组标记为Cy3，另一组标记有Cy5。然后使用自定义斑点检测算法在三维空间中定位与vRNA分子相对应的每个斑点的中心。不同颜色斑点的绘图显示了斑点之间的距离，然后可以确定两个vRNA片段之间的共定位效率(图1A). 开发了一种定制设计的同位化分析工具，用于测量不同颜色的色斑及其最近邻点之间的距离。这允许量化单个细胞中共定位的斑点数量。为了验证该系统，进行了两个控制实验。阳性对照实验使用两个不同标记的探针集（Cy3和Cy5），靶向相同vRNA的不同区域。图1B显示了由两个不同标记的探针组检测到的NA vRNAs图像。在6 hpi感染PR8病毒的细胞中，Cy3和Cy5点之间的高度共定位证明了我们共定位分析的特异性和敏感性。图像的定量共定位分析显示，80%的Cy3和Cy5斑点位于细胞质中，70%位于细胞核中(图1D). 为了排除检测到的高共定位效率可能是由于vRNA的高密度所致的可能性，我们测试了高表达细胞β-actin mRNA和NA vRNA之间的共定位效率。将感染PR8病毒的MDCK细胞与Cy3标记的β-actin mRNA探针和Cy5标记的NA vRNA探针杂交。在8 hpi时，我们在细胞核和细胞质中观察到NA vRNA，而β-action mRNA主要在细胞质中。细胞质中检测到的β-肌动蛋白mRNA拷贝数为1409±283，与感染后4-8小时检测到的病毒RNA相似(图2D). 当合并两个通道时，观察到两种RNA之间的共定位程度很小(图1C). β-肌动蛋白mRNAs和NA vRNAs之间共定位的量化也显示共定位的百分比很低，大约2.5%在细胞核中，5%在细胞质中(图1E). 这些结果证明了我们定量共定位分析的特异性和敏感性。

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流感病毒RNA的单分子敏感性FISH和共定位分析。

(一)MDCK细胞在MOI=5时感染PR8并固定在2 hpi时的图像（最大强度投影）。使用Cy5标记的探针针对PB2段和Cy3标记的探针对抗NA段，对细胞进行PB2和NA vRNA的检测。上部面板显示在Cy5和Cy3通道中采集的荧光图像堆栈的最大投影。下部面板显示了与上述荧光图像相对应的检测到的斑点的2D表示。每个都表示为一个正方形。方形区域的放大图像显示在每个面板的右侧。检测到的斑点的合并图像显示了Cy5和Cy3斑点之间的空间关系。比例尺=10µm。(B类)MDCK细胞在MOI=5时感染PR8病毒，并固定在6 hpi（最大强度投影）。两个探针组，24个Cy3标记探针和24个Cy5标记探针，靶向NA vRNA的不同区域，用于杂交。左上角：显示DAPI、Cy3和Cy5通道的合并荧光图像（比例尺=10µm）。为了进行比较，显示了每个颜色通道中放大的方框区域和相应的检测点。比例尺=5µm。(C类)流感病毒NA vRNA和细胞β-actin mRNA的克隆化分析。MDCK细胞在MOI=5时感染PR8病毒，并固定在8 hpi（最大强度投影）。将细胞与针对NA vRNAs的Cy5标记探针和针对宿主β-actin mRNA的Cy3标记探针杂交。显示每个颜色通道中放大的方框区域和相应的检测点以进行比较。比例尺=低倍图像中的10µm，放大图像中的5µm。(D类)显示了与NA vRNA相对应的Cy3和Cy5斑点的定殖效率。共定位效率被确定为共定位斑点与NA斑点的比率。(E类)定量流感病毒NA vRNA和β-actin mRNA在8 hpi时的共定位效率。共定位效率是通过将共定位点的数量除以NA vRNA点的数量来计算的。

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感染后不同时间点PR8病毒感染细胞中PB2和NA vRNAs的克隆化。

在MOI＝5时用PR8病毒感染MDCK细胞，并在感染后的不同时间点固定。然后使用Cy5标记的探针对抗PB2 vRNAs和Cy3标记的探针抗NA vRNAs.进行双色FISH。(一)荧光图像表示PB2 vRNA（Cy5）、NA vRNA（Cy3）和细胞核（DAPI）。在2、4、7、10和12 hpi时拍摄的典型图像显示在每条车道上（最大强度投影）。比例尺=10µm。装箱区域的放大视图显示在每个车道的最右侧面板中。比例尺=5µm。调整图像对比度，使细胞质单分子清晰可见。由于vRNA密度高，一些细胞核在这些设置下均匀发光。(B类)和(C类)核内PB2和NA vRNAs共定位效率的量化(B类)和细胞质(C类). 控制共定位效率表示当两个不同标记的探针集都以NA vRNA为靶点时，Cy3和Cy5信号之间检测到的效率(D类)感染后不同时间点感染细胞中PB2和NA vRNAs的平均每细胞拷贝数。每个细胞的平均vRNA拷贝数是通过用图像中检测到的PB2和NA vRNA分子的总和除以细胞核数来计算的。对每个时间点共五张包含80多个细胞的图像进行分析。

感染后4小时PB2和NA病毒RNA在细胞质中共定位

为了研究流感病毒生命周期中不同病毒RNA物种的共定位动力学，我们对两种vRNAs：PB2和NA在感染后不同时间点进行了smFISH和共定位分析。图2A显示了感染后不同时间PB2和NA vRNAs分布的典型图像。在2 hpi时，PB2和NA vRNA分子主要在细胞核内观察到，细胞质中只有少量。此时合成了新的vRNAs；然而，在细胞核的不同位置观察到PB2和NA vRNAs。未观察到PB2和NA vRNAs之间的共定位(图2B). 尽管在细胞质中检测到很少的斑点，但PB2和NA-vRNA在该区室中表现出高的共定位效率。很可能这些共定位点代表尚未进入细胞核的传入病毒颗粒的vRNAs。当vRNAs被复制时，细胞核在4 hpi时充满了新合成的vRNAs。值得注意的是，PB2和NA vRNAs在细胞核中的共定位效率随着时间的推移而增加，尽管与对照组相比达到了显著较低的水平。vRNAs在随后的时间点在细胞核中的极端积累导致荧光点的空间密度非常高。在这种浓度范围内，单个PB2和NA vRNAs之间的实际物理相互作用变得难以与拥挤诱导的随机邻近性区分开来。这种效应可以解释使用我们的分析在稍后的时间点测量到的细胞核中较高的共定位分数(图2B). smFISH系统还可以量化单个细胞中vRNAs的拷贝数。通过对每个细胞的细胞核和细胞质隔室中vRNA的拷贝数进行量化，观察到在2 hpi时可以在细胞核中检测到增加的vRNA，这表明vRNA的复制早在感染后1小时就开始了。新合成的vRNAs的核输出可能发生在2 hpi之后，因为与2 hpi相比，4 hpi的细胞质中可以检测到更多的vRNA拷贝数(图2D). 事实上，新复制的vRNA可以在3 hpi的细胞质中看到(图S3A)这些vRNAs分布在整个细胞质中。当在4 hpi下分析PB2和NA vRNAs之间的共定位时，发现共定位效率较低(图2C). 这表明vRNAs是单独从细胞核中输出的，不同片段的vRNA在输出后的早期并没有一起运动。在后期，细胞质中观察到大量vRNAs。vRNAs在核周区域的积累约为6-7 hpi，这与以前的报道一致[17](图S3B). 此时，60%的NA vRNA与PB2 vRNA共定位(图2C). 共定位斑点不仅在vRNA聚集的核周区域被检测到，而且在细胞质中也被检测到。这些结果表明，PB2和NA vRNAs在6-7 hpi之间开始聚集并一起传播(图2&S3）。随着感染的进展，细胞质中出现了更多的vRNAs，PB2和NA之间的共定位效率更高。在感染后10和12小时，观察到释放的病毒颗粒显著增加(图S4)共定位的vRNAs主要在细胞质和靠近细胞顶端表面的地方检测到，这可能代表vRNA被包裹到正在萌发的病毒中。感染后不同时间细胞核和细胞质中PB2和NA vRNAs共定位的量化如所示图2B和2C为了测试关联时间是PB2和NA vRNAs特有的还是所有病毒片段的共同特征，我们测量了其他五对病毒RNA的共定位。所有配对与PB2和NA vRNAs的动力学相似，表明关联的时间模式是普遍的(图S5).

传入的病毒RNA在核导入前一起传播

流感病毒颗粒通过内吞作用进入细胞。内体的酸化使病毒包膜与内体膜融合；质子流入病毒颗粒释放基质蛋白中的vRNP，将vRNP释放到胞浆中[1]目前尚不清楚释放的病毒RNA是保持在一起还是单独传播到细胞核。为了更详细地了解这个过程，MDCK细胞在MOI=100时感染PR8病毒，并用氯化铵（NH）处理细胞4Cl）、钩端霉素B（LMB）或importazole（IPZ）干扰流感病毒vRNP核转运的不同步骤。然后在感染后20、40和60分钟分析PB2和NA vRNAs的共定位效率。在模拟处理的细胞中，早在感染后20分钟就可以在细胞核中检测到PB2和NA vRNAs(图3A). vRNAs的复制在感染后40分钟左右开始，因为在感染后20分钟和40分钟时，细胞核中检测到的vRNAs的平均拷贝数具有可比性，而在感染后60分钟时检测到显著增加(图3D). 当在感染后的第一个小时内评估PB2和NA vRNA的共定位时，细胞核中vRNPs的共定位随着时间的推移而减少（从大约30%减少到5%），而vRNPs在细胞质中的共定位保持在大约50%(图3B和C). 这表明导入细胞核的vRNP被分离，表明它们在细胞核的不同位置复制。虽然一些PB2和NA vRNAs在感染后的早期时间点没有在细胞质中共定位，但释放的vRNPs可能会相互分离并单独向细胞核移动，或者非共定位的vRNP是在细胞核导入后穿梭回细胞质的分子。首先，为了证明感染后早期在细胞质中检测到的共定位PB2和NA vRNP主要是来自同一病毒粒子的vRNP，我们用20 mM氯化铵处理细胞，保留进入病毒粒子中的vRNPs。氯化铵会增加内胚体隔室的pH值，阻止vRNP从基质蛋白中释放；因此，vRNP被保存在传入的病毒颗粒中。当用20 mM氯化铵处理细胞时，在感染的第一个小时内，大多数PB2和NA vRNAs都位于细胞质中(图3A); 这两种vRNA的共定位效率也显著高于模拟处理细胞(图3C). 这些结果表明，病毒粒子的脱膜和融合发生在不同vRNA片段分离之前，共定位的PB2和NA vRNA是在同一病毒颗粒中共同包装的。与模拟处理的细胞相比，氯化铵处理的细胞中进入细胞核的vRNA分子数量较低，这表明氯化铵处理禁止大多数vRNA的核输入(图3D). 一些vRNAs仍然能够逃脱抑制并进入细胞核。然而，在氯化铵处理的细胞中检测到的核PB2和NA vRNAs随着时间的推移表现出共定位水平的下降，且共定位效率显著低于细胞质vRNA(图3B和C). 这些数据表明，vRNP一旦进入细胞核就会分离，并认为细胞质中检测到的大多数共定位PB2和NA vRNAs来自相同的传入病毒，而不是来自感染同一细胞的不同病毒。

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PB2和NA vRNAs在感染的第一个小时内结直肠化。

MDCK细胞在含有DMSO、20 mM氯化铵（NH）的培养基中培养4在MOI=100的情况下，PR8病毒感染期间，Cl）、100µM importazole（IPZ）或40 ng/ml钩体霉素B（LMB）。在感染后20分钟、40分钟和60分钟，使用靶向PB2 vRNA的Cy5探针和靶向NA vRNAs的Cy3探针进行双色FISH。(一)对于每个实验条件，显示了3D荧光图像的四个最大强度投影。左上角的图像显示了Cy5、Cy3和DAPI通道的合并图像。DAPI染色（蓝色）染色细胞的细胞核。方形区域的放大图像显示在右上角（NA，红色斑点）、左下角（PB2，绿色斑点）和右下角（Cy3和Cy5信号与DAPI的合并图像）。比例尺=5µm。(B类)感染后20分钟、40分钟和60分钟用不同药物处理的PR8病毒感染MDCK细胞的细胞核中PB2和NA的克隆化效率。(C类)PR8病毒感染MDCK细胞后20、40和60分钟用不同药物处理后，其细胞质中PB2和NA的克隆化效率。细胞核中vRNA的平均拷贝数（PB2和NA vRNA的总和）(D类)和细胞质(E类)显示了用不同药物处理的细胞。对于每个实验条件，分析了40多个细胞。在实验组和模拟治疗组之间的每个时间点进行未配对的学生t检验。a： p值<0.05，b:p值<0.01，c:p值<0.001，d:p值<0.001，ns:无显著性。

为了进一步了解病毒释放的vRNP是否在进入胞浆或细胞核时分离，感染细胞用importazole（IPZ）处理以阻断vRNP的核输入。已发现IPZ干扰进口蛋白-β和Ran-GTP之间的相互作用，这是进口货物放行的关键事件。因此，IPZ的处理抑制了依赖进口β的核货物进口，并将进口货物保留在核边缘[20]当用IPZ处理感染PR8病毒的MDCK细胞时，与模拟处理细胞相比，PB2和NA vRNP的拷贝数输入细胞核(图3D). 然而，在感染后20、40和60分钟，在细胞质和细胞核中检测到PB2和NA之间的高共定位效率。这一结果表明，PB2和NA vRNP的拆卸需要核进口，并且是在从核进口机器中释放出来之后进行的(图3A-C). 由于在模拟处理的细胞中观察到的分离的PB2和NA vRNP明显多于vRNP核输入被消除的细胞，我们假设分离的细胞质vRNP是那些在核输入后穿梭回细胞质的vRNP。然后，我们用钩端霉素B（LMB）治疗感染细胞，以阻止流感病毒vRNP的输出，从而验证了这一假设[10]用LMB处理细胞时，导入细胞核的PB2和NA vRNP的拷贝数与模拟感染细胞相似(图3D)在LMB处理和模拟处理细胞的细胞核中，两个vRNP之间的共定位效率也相当(图3B). 这些表明，LMB处理和模拟处理细胞中vRNP的核输入具有相似的动力学。LMB处理MDCK细胞抑制Crm-1依赖性核输出(图S6)与模拟处理细胞相比，细胞质中共定位PB2和NA vRNAs的比例更高(图3A). 定量分析还表明，随着时间的推移，在用LMB处理的细胞中，PB2和NA-vRNA之间的共定位效率保持在70%，这显著高于对照细胞(图3C). 这些结果表明，细胞质中分离的PB2和NA vRNP主要由核导入后重新进入细胞质的vRNP组成。这进一步表明，在病毒感染的早期阶段，vRNP被单独输出到细胞质中。

细胞质中PB2和NA之间的结肠化与微管无关

由于感染后不同时间点PB2和NA vRNP的共定位分析结果表明，不同身份的vRNP在细胞质中共定位，因此进一步研究了可能参与这一过程的细胞因素。据报道，流感病毒vRNA的运输依赖于微管，并且观察到vRNA从细胞核输出后在微管组织中心（MTOC）积累[17]因此，我们首先通过观察vRNAs与微管网络的共定位来分析微管是否参与不同vRNP片段的共定位。为了量化与微管相关的共定位vRNAs的程度，进行了三色共定位分析。首先使用抗微管蛋白抗体对感染细胞进行微管染色，然后使用抗PB2和NA vRNAs的smFISH染色。在图4A，微管以蓝色表示，而两个vRNA以绿色（PB2）和红色（NA）表示。如果共定位vRNAs与微管相关，则应观察到白色信号。在4 hpi时，PB2和NA vRNAs没有共定位，因此可以观察到明显的绿色和红色斑点。值得注意的是，这些vRNAs虽然没有共定位，但在微管附近的位置可以看到，这表明微管可能支持单个vRNAss从细胞核输出后的运输。在6 hpi时，PB2和NA vRNAs开始在细胞质中共存。此时，在核周区域观察到白色信号，表明PB2和NA vRNAs在MTOC处积聚。除了在MTOC区观察到的信号外，细胞质中共定位的PB2和NA vRNAs不位于微管网络上(图4A). 这表明，当PB2和NA vRNAs沿着微管移动时，它们可能不会发生共定位。为了量化vRNAs之间的关联是否受到它们相对于微管的位置的调节，我们自动描绘了微管所在的三维图像堆栈区域(图S7). 位于这些区域轮廓内的共定位vRNA被认为是微管相关的，而其他区域则不是。通过计算轮廓内外共定位点的数量，可以确定与微管相关的共定位vRNA的百分比。该分析表明，尽管PB2和NA vRNAs在6和8 hpi时的共定位效率增加，但发现小比例（4–24.5%）的共定位vRNA与微管相关，这表明微管可能在不同vRNP的共定位中不起主要作用(图4B). 我们使用相同的空间分析来比较与微管相关的PB2和NA vRNA与与微管无关的vRNA的共定位效率。两组间无显著差异(图4C). 这进一步表明，PB2和NA vRNAs的共定位与微管结合无关。

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PB2和NA vRNAs的共定位与微管无关。

(A和B)分别使用Cy5-或Cy3-荧光标记探针对感染MOI=5的PR8病毒的MDCK细胞微管（蓝色）和双色smFISH进行免疫荧光染色，以对抗PB2-vRNAs（绿色）或NA-vRNA（红色）。(一)显示了细胞在4和6hpi时的微管、PB2和NA-vRNA的二维合并图像（每个面板中的左上角图像）。方框区域的放大图像显示在右上角；还显示了在每个通道（底部）拍摄的放大图像，以及PB2和NA vRNA斑点之间的合并图像（中间，右侧）。比例尺=10µm。(B类)显示了PB2和NA vRNAs之间共定位的量化。与微管相关的共定位vRNAs比例以深灰色表示，未与微管共定位的共定位vRNAs以浅灰色表示。与微管相关的共定位vRNAs的百分比在4hpi为24.5%，6hpi为10.3%，8hpi为4.1%。误差线表示标准偏差。(C类)定量与微管相关（深灰色）或与微管无关（浅灰色）的PB2和NA vRNA之间的共定位。误差线表示标准偏差。ns：非配对t检验无显著性。(D&E公司)MDCK细胞在MOI=5时感染PR8病毒，并在1.5 hpi时用诺卡唑（NOC）处理。(D类)将处理后的细胞固定在8 hpi进行smFISH分析。显示了模拟处理或NOC处理细胞的Cy5荧光（PB2-vRNAs）、Cy3荧光（NA-vRNA）、Alexa 488信号（细胞膜）和合并图像（最大强度投影）。Alexa-488结合的小麦胚芽凝集素（WGA）对细胞的质膜和高尔基体进行染色。比例尺=5µm。(E类)显示了模拟处理和NOC处理细胞中PB2和NA vRNAs的克隆化效率。对于每个实验条件，分析了50多个细胞。误差线表示标准偏差。ns：未配对t检验，无显著性。

为了进一步证实完整的微管网络对PB2和NA vRNAs共定位并不重要，我们抑制了微管与诺卡唑在PR8病毒感染细胞中的聚合。感染PR8的MDCK细胞在1.5 hpi时用诺可唑处理，然后在6和8 hpi时固定细胞进行杂交。细胞用Alexa488-结合的小麦胚芽凝集素（WGA）染色，以标记质膜和高尔基体。在6 hpi时，在模拟处理的细胞中观察到大量vRNAs积聚在核旁位置，而在诺克唑处理的细胞内，vRNAs分散在细胞质中并向外侧质膜积聚(图4D). 这一观察结果与之前的报告一致，该报告显示微管参与vRNAs的顶端转运[16]然而，在模拟治疗和诺克唑治疗的细胞中仍然可以观察到PB2和NA vRNAs之间的共定位(图4D). 两种vRNAs间共定位效率的量化也表明，模拟处理的细胞和诺康唑处理的细胞之间没有差异(图4E). 这证实了三色共定位分析的结果，即微管网络参与贩运vRNA的目的地，但不参与vRNA的收集过程。这也意味着vRNAs向MTOC的运动对于PB2和NA vRNA在细胞质中寻找彼此并不重要。

病毒RNA与Rab11阳性细胞器的结合在PB2和NA vRNA的共定位中起部分作用

据报道，流感病毒vRNAs以依赖Rab11的方式进入质膜[15],[16],[17],[19]当vRNPs加载到Rab11阳性囊泡上时，可能会在感染后的晚些时候发生vRNAs在细胞质中的共定位。因此，我们测试了带有Rab11阳性细胞器的vRNAs的转运是否对PB2和NA vRNAs的共定位至关重要。在图5A，将PR8病毒感染的A549细胞与针对PB2和NA vRNA的探针杂交，并对Rab11蛋白进行免疫染色。由于抗Rab11抗体能特异性地检测人类Rab11分子，因此在病毒感染的A549细胞中进行了双色smFISH和抗Rab1免疫染色。与MDCK中检测到的相比，A549细胞中PB2和NA vRNAs的共定位动力学较慢(图S8)因此，在感染后6、8和10小时（而不是感染后4、6和8小时）测定共定位vRNAs和Rab11之间的时空关系。在6 hpi时，PB2和NA vRNAs没有共定位，也没有与Rab11粒子在空间上一致。然而，在8和10 hpi时，PB2和NA vRNAs显示出较高的共定位效率（在两种颜色的FISH图像中出现黄色斑点），并且这些共定位vRNA被发现与Rab11颗粒相关，当FISH和免疫染色图像合并在一起时，会产生明显的白色斑点。这表明当两个vRNAs被加载到同一Rab11-阳性囊泡上时，PB2和NA vRNA可能发生共定位。为了进一步量化与Rab11相关的共定位vRNA的比例，进行了类似于微管的三色共定位分析。结果表明，Rab11相关vRNPs共定位的比例从6 hpi的13.2%增加到8 hpi的44.9%，对应于PB2和NA vRNAs的共定位效率从6 hpi的31%提高到8 hpi的58%(图5B). 此外，我们发现Rab11相关的PB2和NA vRNA的共定位效率显著高于非Rab11关联的vRNA(图5C). 这些结果表明，Rab11对vRNAs的定位增强了PB2和NA vRNAss之间的共定位程度。

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Rab11参与PB2和NA vRNAs的共定位。

(A–C)A549细胞在MOI＝5时感染PR8病毒，并在6、8和10hpi时固定。使用抗Rab11抗体进行免疫荧光染色，然后使用Cy5标记的PB2探针和Cy3标记的NA探针进行双色smFISH。(一)6、8和10 hpi时细胞的合并荧光图像显示在左上角（最大强度投影）。对于每个面板，方框区域将被放大并显示在右上角。PB2 vRNA（绿色）、NA vRNA（红色）和Rab11（蓝色）的放大图像显示在底部，PB2和NA vRNA信号的合并图像显示在右中部。比例尺=5µm。(B类)6、8和10 hpi时细胞质中PB2和NA vRNA的定殖效率。与Rab11共定位的共定位vRNAs以深灰色表示，而与Rab1无关的共定位vRNAs则以浅灰色表示。与Rab11相关的共定位vRNAs的百分比在6hpi为31.3%，在8hpi为44.9%，在10hpi为38.8%，随机对照为24%。误差线表示标准偏差。(C类)在6、8和10 hpi时，与Rab11相关和不相关的PB2和NA vRNAs在细胞中的克隆化效率。随机对照表示当vRNA被随机分为Rab11相关组和Rab11非相关组时，PB2和NA vRNA的共定位效率。误差条表示标准偏差。***：t检验p值<0.001，**：t检验p值<0.01，*：t检验p值<0.05。(D&E公司)用1µg GFP-rab11-WT或GFP-rab21-DN转染A549细胞，并在转染后24小时以MOI=5感染PR8病毒。使用针对PB2 vRNAs的Cy5探针和针对NA vRNA的Cy3探针在8 hpi下进行双色smFISH。(D类)显示了转染WT-Rab11或DN-Rab11（最大强度投影）的细胞的图像。方框区域的放大图像如下所示：底部分别显示PB2 vRNAs（绿色）、NA vRNA（红色）和GFP标记的rab11蛋白（蓝色）；PB2和NA vRNAs的合并图像显示在右中角，而三个通道的合并图像位于面板的右上角。比例尺=5µm。(E类)PB2和NA vRNAs在WT-Rab11或DN-Rab11表达细胞中的克隆化。对GFP信号（表达GFP标记的rab11蛋白）检测到的单个细胞，分析PB2和NA vRNAs的共定位效率。黑点表示WT-Rab11转染细胞中vRNAs的共定位效率，而红色方块表示DN-Rab11转基因细胞中的共定位率。误差条代表标准偏差。***：t检验p值<0.001。

为了进一步证明Rab11参与PB2和NA vRNAs的共定位，将GFP标记的Rab11以野生型或显性阴性形式转染A549细胞，然后感染PR8病毒。在表达野生型Rab11（WT-Rab11）的细胞和表达显性阴性Rab11的细胞中，比较PB2和NA vRNAs的共定位程度。图5D结果表明，在WT-Rab11转染的细胞中，PB2 vRNA与NA vRNA共定位，共定位的vRNA也定位于Rab11。另一方面，转染DN-Rab11的细胞在细胞质中表现出PB2和NA vRNAs的分散分布；vRNAs之间未发现共定位。DN-Rab11蛋白也在细胞质中扩散，与之前报道的类似[15]在DN-Rab11蛋白表达细胞中，我们观察到vRNAs在细胞核内和周围大量积累；我们调整了显示图像的对比度，以正确表示细胞质中的vRNA颗粒。当进行定量分析时，WT-Rab11转染细胞中PB2和NA vRNAs在细胞质中的共定位效率显著高于表达DN-Rab11的细胞(图5E). 这些结果进一步证明了Rab11在流感病毒感染期间促进不同vRNAs共定位的重要性。数据表明，不同片段的vRNAs在到达质膜之前就已经共定位，而Rab11阳性细胞器可能是不同vRNA在到达组装位置时聚集的平台。

细胞质中PB2和NA vRNAs之间的克隆化与HA和M2无关

据报道，病毒蛋白血凝素和M2，特别是M2的细胞质尾部，参与了出芽病毒的组装[21],[22]因此，我们测试了HA和M2在vRNAs到达质膜的过程中是否参与了vRNAs的共定位。在组成性表达HA蛋白（MDCK-HA）的MDCK细胞中产生了一种缺乏HA ORF的重组PR8病毒，即PR8-HA-GFP-HA病毒。该病毒的HA ORF被GFP基因的ORF取代。为了测试HA蛋白在vRNAs共定位中的作用，MDCK细胞被野生型PR8（WT-PR8）或PR8-HA-GFP-HA病毒感染，然后进行smFISH和4、6和8 hpi下PB2和NA vRNAs的共定位分析。由于PR8-HA-GFP-HA病毒缺乏HA ORF，因此无法编码HA蛋白，因此可以评估HA蛋白在这一过程中的参与程度。与MDCK细胞中的野生型PR8病毒相比，PR8-HA-GFP-HA病毒在vRNA复制和vRNA输出方面表现出类似的动力学（数据未显示）。对于WT-PR8和PR8-HA-GFP-HA病毒，还观察到PB2和NA vRNAs共定位的类似动力学(图6A和B). 这些结果表明，HA蛋白的表达对感染细胞中不同vRNAs的共定位并不重要。

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PB2和NA vRNAs的共定位与病毒蛋白HA和M2的表达无关。

(A和B)MDCK细胞被野生型PR8（WT-PR8）或PR8-HA-GFP-HA病毒感染，并在4、6和8 hpi下固定进行针对PB2和NA vRNAs的双色smFISH分析。(一)感染WT-PR8和PR8-HA-GPF-HA病毒的细胞在8 hpi（最大强度投影）时的DAPI信号（蓝色）、PB2-vRNAs的Cy5荧光（绿色）和NA vRNA的Cy3荧光（红色）。比例尺=10µm。(B类)显示了感染WT-RP8或PR8-HA-GFP-HA病毒的细胞细胞质中PB2和NA vRNAs的克隆化效率。误差线表示标准偏差。ns:t检验p值＞0.05；没有意义。(C&D公司)MDCK细胞在MOI=5时感染PR8-WSN-M或PR8-WSN-ΔM2，并在6和8 hpi时进行针对PB2（Cy5标记）和NA（Cy3标记）的双色FISH vRNAs。(C类)感染细胞在8 hpi（最大强度投影）下与Cy5 PB2探针（绿色）和Cy3 NA探针（红色）杂交的荧光图像。DAPI染色（蓝色）染色细胞的细胞核。比例尺=10µm。(D类)感染PR8-WSN-M或PR8-WSN-ΔM2的细胞细胞质中PB2和NA vRNAs的克隆化效率。误差线表示标准偏差。ns：未配对t检验，无显著性。

用类似的策略评估M2蛋白的作用。在PR8病毒背景中产生了两种重组病毒[23]PR8-WSN-M包含来自WSN病毒的全长M片段，因此M1和M2都可以在感染期间产生。PR8-WSN-ΔM2病毒缺乏M2 ORF，因此它生长在表达M2蛋白的MDCK细胞中。比较感染PR8-WSN-M和PR8-WSN-ΔM2病毒的MDCK细胞中PB2和NA vRNAs的共定位效率。PR8-WSN-M和PR8-WSN-ΔM2病毒感染细胞之间无显著差异。这些结果表明，M2蛋白的表达在PB2和NA vRNAs的共定位中没有发挥重要作用(图6C&D).

讨论

在本研究中，我们使用smFISH分析了流感病毒感染细胞中vRNP片段的分解和随后的组装。我们表明，不同片段的vRNP在从传入病毒释放后仍保持关联，并作为一个包裹物传递到核膜。新合成的不同节段的vRNP在细胞核中不占据相同的空间，它们可能单独输出到细胞质中，因为在感染的早期阶段没有观察到不同节段输出的vRNP的共定位。在感染的后期（MDCK细胞中6-8 hpi），不同的病毒RNP共同定位在细胞质中，通常发现它们与Rab11-再循环内体有关。这些结果提供了证据，证明属于不同片段的vRNP遵循相同的贩运路线，并且在vRNP到达细胞表面之前可能会选择正确的八个vRNA片段组合(图7).

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提出了感染细胞中不同vRNA片段的拆卸和共定位模型。

(1)流感病毒颗粒通过内吞途径进入细胞。(2)内切体酸化可使病毒包膜与内切体膜融合，并将vRNP释放到胞浆中。包装在病毒颗粒中的vRNP在向核传递过程中保持紧密联系。(三)核导入后，不同节段的相关vRNP在核内分解(结果在里面图3)和(4)不同的vRNA在细胞核的不同区域复制，没有观察到vRNA的片段特异性积累(结果在里面图2&三). (5)新合成的vRNP分别输出到细胞质中，不同的片段在核输出后不久就不相互关联(结果在里面图2&三). (6)在vRNP运输到质膜的过程中，vRNP通过与Rab11的结合被装载到再循环的内体上[15],[16],[17]不同节段的vRNP开始相互共定位，并作为八个不同vRNP的预形成复合物一起向心尖质膜移动。(7)当复合物到达质膜时，八种不同的vRNP被作为一个整体包装到出芽的病毒粒子中。

早在感染后20分钟就检测到vRNP，这表明smFISH方法具有很高的敏感性，可以分析病毒进入过程中vRNP的空间关系。当通过增加内体区室中的pH来阻断进入的病毒颗粒的解开时，发现PB2和NA-vRNA以非常高的效率共定位。这些结果表明，共定位的vRNP来源于相同的病毒粒子，根据之前的报告，流感病毒粒子高效地包装了八种不同的vRNA[4]早先有人提出，不同片段的vRNP在核导入前是一个包裹物，因为当多核骨骼肌纤维在低MOI感染流感病毒时，观察到不同片段的病毒RNA进入同一个细胞核[24]通过smFISH分析，可以量化不同vRNP的共定位水平。当感染细胞用importazole治疗时，一种最近发现的干扰importin-β和Ran-GTP相互作用的化合物[20]不同片段的vRNP保持共定位。这意味着在vRNP从病毒粒子中释放出来后，它们在到达细胞核的过程中保持关联。此外，观察到不同片段的输入vRNP在IPZ处理后保持共定位。由于IPZ禁止从细胞核进口机器中释放进口货物，因此可能需要从进口机器释放vRNP复合物，以分离不同片段或启动vRNA复制。萌芽病毒内病毒RNP的三维重建显示，在vRNP的前端有一个电子密集平台，表明该区域的vRNP之间存在相互作用[3],[5].使用RNA迁移率变化分析的最新研究体外转录的vRNA表明vRNA之间存在特定的RNA/RNA相互作用，它们可能参与基因组选择过程[5],[25]然而，需要进行进一步的调查，以了解八个vRNP在单元内移动期间保持在一起的详细机制。

已发现细胞质负义RNA病毒的vRNAs复制发生在病毒诱导的隔室中，例如狂犬病病毒的Negri小体[26]或囊泡性躯体炎病毒包涵体[27]和埃博拉病毒[28]然而，尚未观察到在细胞核中合成流感RNA的特殊隔间。事实上，我们观察到新合成的vRNAs分布在除核仁外的整个核质中，类似于核蛋白在细胞核中的分布[9]对不同片段的分离vRNAs的观察可能表明，vRNPs的核导入驱动了vRNP复合体的分解，并且每个片段被分配到不同的位置进行转录和复制。新合成的vRNA也有可能从不同vRNA片段非常接近的复制位点快速扩散。聚合酶突变病毒将有助于进一步阐明细胞核中vRNAs的行为。此外，当观察到vRNP积累时，在细胞质中检测到分离的新合成的vRNP，并且核中两个不同vRNP之间的共定位效率增加。这可能表明子代vRNP是从细胞核单独输出的，共定位片段的RNP复合体只在细胞质中形成。

Rab11再循环内体系统已被证明参与了vRNP从核周区域向顶端质膜的转运[15],[16],[17]也有研究表明vRNP在微管上被主动转运[14]并且需要一个完整的微管网络将Rab11再循环内体靶向顶端表面[16],[17]在我们的研究中，我们表明微管对于不同vRNP的共定位是必不可少的，而对于vRNP正确的膜靶向则是必要的。三色smFISH分析表明，vRNPs与Rab11的相互作用增加了不同vRNA片段的共定位效率，表明Rab11在促进不同vRNA片段之间的共定位方面发挥作用。因此，我们认为vRNP与Rab11的相互作用将不同片段的vRNP集中在囊泡膜上，并增加了不同vRNP聚集在一起的可能性。事实上，PB2和NA vRNA之间的高度共定位通常在细胞中检测到，在这些细胞中可以观察到vRNP在核周区域的聚集，这是vRNP被加载到Rab11阳性囊泡上的一个建议位置[16],[17]因此，我们建议将Rab11再循环内体作为膜平台，帮助不同片段的vRNP找到其伴侣。然而，应该注意的是，可以观察到与Rab11无关的共定位vRNP(图6B). 这表明可能还有其他因素，例如vRNAs的包装信号，决定了不同vRNP之间的共定位（独立于Rab11相互作用）。这些共定位的vRNP也可能与Rab11分离，因为它们已准备好包装到病毒颗粒中。综上所述，很可能是在vRNP运输到质膜的过程中，选择不同的vRNA片段共同包装成病毒。

流感病毒基因组在病毒中的有效结合与病毒跨膜蛋白HA、NA和M2的细胞质尾部有关[21],[29],[30]缺乏HA和NA细胞质尾部的突变流感A病毒显示病毒RNA与病毒蛋白的含量降低；也有人认为，这种变异病毒比野生型病毒含有更多的非传染性病毒颗粒（没有完整的互补基因组）[29]此外，已经证明M2蛋白细胞质尾部的截短或突变降低了病毒相关NP蛋白和vRNAs的水平[21],[30],[31],[32]这种效应与M1蛋白和M2细胞质尾部之间的相互作用有关，表明M2负责向病毒粒子出芽位点募集M1-vRNP复合物[31],[33]有了这些证据，我们可以假设vRNP的组装发生在质膜上。然而，我们使用缺乏完整HA或M2蛋白的重组病毒进行的研究表明，不同vRNP片段之间的共定位与HA和M2识别无关(图6)，进一步证实了本研究中的其他数据，这些数据表明，不同的vRNP片段在并入出芽病毒之前已经组装。因为有证据表明，大多数流感病毒包装了8个完整的vRNA片段[4]在处于萌芽状态的病毒中观察到8个物理上相关且有序的vRNP[3],[5],[25]，建议在封装前形成八个vRNP的互连复合体[3],[34]尽管目前的smFISH实验无法检测到超复合物的形成，但细胞质中检测到的不同vRNA片段之间的共定位表明，复合物的生成过程可能发生在vRNA运输过程中，为当前的假设提供了一个额外的提示，即所选的八个vRNP可能被包装成一个复合体，形成正在萌芽的病毒粒子。

总之，我们通过smFISH和共定位分析表明，流感病毒感染细胞中的不同vRNA片段在到达质膜之前在细胞质中共定位。这些发现为流感vRNP包装的选择过程提供了线索[3],[34]然而，需要进行进一步的调查，以充分确定控制不同vRNP之间关联的生物学原理。

材料和方法

细胞、病毒、质粒和抗体

Madin-Darby犬肾（MDCK）上皮细胞保存在补充有10%胎牛血清（FBS）的改良鹰氏培养基（MEM）（Gibco，Invitrogen）中。腺癌人肺泡基底上皮细胞（A549）在添加10%FBS的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）（Gibco，Invitrogen）中生长。两种细胞系均在37°C和5%CO下培养2流感A/波多黎各/8/34（PR8）和PR8 cH9/1病毒株在10天大的鸡胚中生长，如前所述[35]重组PR8-HA-GFP-HA病毒在HA-MDCK细胞中生长[36]; PR8-WSN-M和PR8-WSN-ΔM2病毒在M2-补体MDCK细胞系中生长[23]（Randy Albrecht博士提供）。质粒GFP-rab11 WT和GFP-rab21 DN购自Addgene（Addgene质粒12674和12678）[37]使用以下抗体：大鼠单克隆抗α-微管蛋白抗体（Abcam）、兔抗Rab11多克隆抗体（Invitrogen）、Alexa Fluor 488-结合驴抗兔IgG（H+L）抗体和Alexa Fuor 488结合山羊抗鼠IgG。

PR8-HA-GFP-HA病毒的产生

产生重组PR8-HA-GFP-HA病毒的反向遗传学方法如前所述[36]如前所述，构建了表达GFP ORF的pDZ质粒，其两侧为HA包装信号[38].

病毒感染

如前所述，用流感病毒感染MDCK细胞或A549细胞[39]为了同步病毒进入，首先将细胞在冰上孵育5分钟，然后与在感染培养基（补充有1%牛白蛋白（BSA）和1%青霉素-链霉素的磷酸盐缓冲盐水（PBS））中稀释的病毒在冰上孵育60分钟。在病毒吸附后，清洗细胞，并立即向细胞中添加感染后培养基（补充有0.3%BSA、1%青霉素-链霉素和1µg/ml TPCK（L-1-对甲苯酰亚胺-2-苯乙基氯甲基酮）-胰蛋白酶），将其预热至37°C。然后将细胞转移到37°C以允许病毒进入。对于感染期间使用药物处理的细胞，这些化合物在感染介质和感染后介质中的浓度如下：20 mM的氯化铵；钩端霉素B（Sigma）为40 ng/ml；importazole（Sigma）为31.8µg/ml，nocodazole为20µg/ml。

转染

5×104根据生产方案（Invitrogen），使用脂质体2000试剂用1µg GFP-rab11-WT或GFP-rab21-DN质粒转染A549细胞。通过将盖玻片在50µg/ml的纤维连接蛋白（fibronectin）中于PBS中室温培养45分钟，并用PBS冲洗一次，盖玻片涂上纤维连接到蛋白（Sigma）。在病毒感染前，将转染细胞涂布在涂有纤维连连接蛋白的盖玻片上，并在37°C下培养24小时。

单分子敏感性RNA荧光就地杂交

RNA荧光就地杂交（FISH）是根据已公布的方案进行的，并进行了一些修改[40],[41],[42]使用的探针是单链DNA寡核苷酸（20个核苷酸），每个寡核苷酸标记有一个荧光团（Cy3或Cy5）（BioSearch，文本S1). 细胞以5×10的密度被镀在聚赖氨酸涂层盖玻片（BD Biosciences）上4细胞/孔，并在37°C下过夜生长。在感染后的特定时间点，用冰镇PBSM（1×PBS，5 mM MgCl）清洗细胞一次2)然后在室温下用4%多聚甲醛在PBSM中固定10分钟（RT）。用冰镇PBSM短暂清洗后，用0.5%Triton X-100在PBSM中在RT下渗透1分钟。然后用PBSM清洗细胞，并在2XSSC（300 mM氯化钠，30 mM柠檬酸钠）和10%甲酰胺中培养5分钟，然后进行杂交。为了检测病毒RNA，每个样品使用40µl杂交缓冲液中的4µM标记探针（10%硫酸右旋糖酐、2 mM钒基核苷复合物（VRC，新英格兰生物实验室）、0.02%无RNA的BSA、50µg大肠杆菌tRNA、2XSSC、10%甲酰胺）。杂交在37°C下保持16小时的加湿室中进行。然后在37°C下，用添加有2 mM VRC的10%甲酰胺2×SSC对样品进行两次洗涤30 min。随后使用0.5µg/ml DAPI进行核染色，并将盖玻片安装在ProLong Gold防褪色安装介质（Invitrogen）中。固化样品接受显微镜检查或储存在−20°C下。对于用于免疫荧光和FISH分析的样品，在固定和渗透后，首先用1%BSA在PBSM中在RT下封闭细胞1小时。然后将盖玻片在PBS中的1%BSA中进行一次和二次抗体染色，然后用4%多聚甲醛进行另一个固定步骤10分钟。然后用PBSM清洗细胞一次，并用10%甲酰胺2XSSC平衡10分钟，然后在就地杂交程序。

图像采集

细胞放置在配备100×1.4数值孔径（NA）油浸物镜（Zeiss）和蔡司AxioCam MRm相机的蔡司阿xioplan2IE显微镜上。在约4µm的范围内，使用200 nm z维轴步长对细胞成像。

图像分析

我们使用前面描述的定制MatLab（Mathworks）程序对斑点进行亚像素定位和强度量化[43]。我们使用了一个自定义编写的Matlab程序来进行共定位量化。使用斑点检测程序在三维空间中确定每个通道中荧光斑点的中心位置后，计算一种颜色的斑点与其最近的另一种颜色相邻斑点之间的距离。当不同颜色的最近点之间的距离在2.5像素（255 nm）以内时，分配彩色事件。该距离阈值的值是通过比较检测相同vRNA分子的不同颜色的最近点与检测不同位RNA分子的最近点之间的距离来确定的。2.5像素（255 nm）范围用于最大限度地检测共定位事件，同时最小化假阳性（参见图S2进一步解释）。在每个图像中，使用2D和3D掩模图像分别量化不同感兴趣区域（如细胞核和细胞质）中斑点之间的共定位。掩模图像以各种方式生成。使用为图像J程序（NIH）编写的插件手动描绘单个细胞。使用DAPI图像堆栈最大强度投影的自动强度阈值分割细胞核。微管和Rab11免疫荧光图像堆栈经过定制的自动分割工具生成3D掩模图像堆栈以进行共定位分析。简单地说，3D堆栈首先使用带通滤波器进行平滑处理，然后使用Otsu方法应用自动阈值。结果是一个二进制3D图像堆栈，其中白色体素对应于微管（分别是Rab11粒子），而其余的3D空间则保持为黑色。在使用AutoQuant X2 AutoDeblur软件（媒体控制论）应用分割算法之前，对微管图像堆栈进行解卷。可根据要求提供定制的软件。

支持信息

图S1

流感病毒RNA的单分子敏感性FISH分析的特异性。(一)MDCK细胞在MOI=5时感染PR8病毒。模拟感染和PR8病毒感染细胞在4 hpi时靶向PB2 vRNAs的sm-FISH探针的DAPI信号和Cy5荧光显示在使用最大强度投影构建的2D图像中。比例尺=10µm。(B类)MDCK细胞在MOI=5时感染PR8病毒，并与48个靶向PB2 vRNAs的Cy5标记探针杂交。显示了感染后1小时的荧光斑点强度的直方图。光斑强度分布显示了单个分子的明确的单峰特征。黑圈：数据；红线：数据的高斯分布拟合。(C类)MDCK细胞感染PR8或PR8 cH9/1病毒（含有表达H9亚型头部区域的HA ORF）6小时，然后使用针对HA1 vRNA的Cy3标记探针和针对HA9 vRNAs的Cy5标记探针进行smFISH。显示了在Cy3通道（左，红色）和Cy5通道（右，绿色）中拍摄的一对z堆栈图像的最大强度合并。DAPI染色（蓝色）将细胞核染色。比例尺=25µm。

（畅通节能法）

图S2

经验性地确定斑点中心之间的最大距离阈值，这定义了共定位。(一)通过使用两个针对同一病毒RNA不同区域的探针集，实验测定了共定位点中心之间的距离。NA-vRNA的两个不同区域由两个探针集结合，一个标记Cy3荧光团，另一个标记为Cy5荧光团。在两个荧光通道中拍摄Z叠加图像，并使用斑点检测程序在3D空间中定位Cy3斑点和Cy5斑点的中心。测量Cy3点与其最近邻的Cy5点之间的距离。这里显示了不同颜色的相邻点之间的距离分布。Cy3和Cy5斑点中心之间的距离主要在1像素（102 nm）内，并扩展到约2.5像素（255 nm）。由于电子显微镜分析表明封装的vRNP范围为80 nm至100 nm（Cy3和Cy5点之间的距离理论上在1个像素内），因此此处测量的最近邻距离可能代表了Cy3与Cy5通道中相同衍射线物体的测量精度。因此，如果斑点的中心在2.5像素以内，我们将其定义为同位化。(B类)与共定位斑点相比，感染细胞中NA vRNAs（Cy5斑点）和β-actin mRNA（Cy3斑点）之间的最近邻距离分布表明，最近邻距离范围为1至10像素（1020 nm），大多数斑点聚集在3.5至6像素的范围内。红色虚线表示2.5像素的距离阈值，用于定义定量共定位分析中斑点的共定位。

（畅通节能法）

图S3

vRNPs在细胞质中的分布。感染PR8病毒的MDCK细胞在2、3时的最大强度合并图像(一)和6(B类)马力。用PB2 vRNA（绿色）、NA vRNA（红色）检测细胞，并用DAPI（蓝色）染色以确定核区域。白色箭头显示细胞质中检测到的输出vRNAs。红色箭头表示vRNAs的核周积累。比例尺=10µm。

（畅通节能法）

图S4

PR8病毒在MDCK细胞中的生长动力学。MDCK细胞在MOI=5时感染PR8病毒。在感染后0、1、2、4、7、10和12小时收集感染MDCK的细胞上清液。使用标准菌斑试验对释放到上清液中的病毒颗粒进行滴定。显示了每个时间点释放的病毒颗粒的滴度。

（畅通节能法）

图S5

在6 hpi下可以观察到不同身份的vRNP的共定位。MDCK细胞在MOI=5和sm-FISH感染PR8病毒，并对不同的vRNP对进行共定位分析。显示了所示vRNA对之间共定位效率的量化。所有测试的vRNA对在4 hpi时定位效率较低，而在6 hpi时检测到这些vRNA对的共定位效率较高，表现出类似的动力学。

（畅通节能法）

图S6

LMB处理MDCK细胞的阳性对照。作为LMB作用的阳性对照，我们检测了核-细胞质穿梭蛋白MAP激酶（MEK）[44]在MDCK细胞中。首先将细胞的血清饥饿16小时，然后在感染介质中用40 ng/ml的LMB培养1小时（与病毒感染浓度相同）。然后用4%甲醛固定细胞10分钟，并用抗MEK抗体（1∶100，Abcam）对MEK蛋白进行免疫荧光。显示了MEK蛋白、细胞核和融合蛋白的荧光图像。LMB处理的细胞中MEK的核积累反映了MEK的输出受损，而未处理的细胞显示出明显的细胞质定位模式。比例尺=25µm。

（畅通节能法）

图S7

微管和Rab11颗粒的自动分割。 顶部：微管分割示例。左，微管图像叠加的代表平面，微管标记有抗微管蛋白抗体。中间的掩模图像显示了左侧平面的自动分割算法的输出。右侧，数据叠加（绿色）和分段结果（红色）。底部：Rab11颗粒分割示例。左，标记有抗Rab11抗体的Rab11粒子图像堆栈的最大强度投影。中心，最大强度投影的自动分割算法的输出图像堆栈表示在左侧。右侧，数据叠加（绿色）和分段结果（红色）。比例尺：10µm。

（畅通节能法）

图S8

PB2和NA vRNAs在A549细胞中的共定位。A549细胞在MOI=5和sm-FISH感染PR8病毒，并对PB2和NA vRNAs（Cy5标记的PB2和Cy3标记的NA vRNA）进行共定位分析。显示了两个vRNAs之间共定位效率的量化。4 hpi和6 hpi的定位效率较低，而8 hpi和10 hpi的共定位效率较高，与MDCK细胞相比，显示出延迟的动力学(图2C和图4B).

（畅通节能法）

文本S1

用于靶向流感病毒感染细胞中vRNA或细胞mRNA的探针序列。这里列出了用于靶向流感病毒vRNA或细胞mRNA的每个探针的序列。

（DOCX）

致谢

我们感谢Philip J.Santangelo博士对进行初步实验的支持。荧光显微镜在MSSM显微镜共享资源设施进行。

资金筹措表

这项工作得到了流感发病机制研究中心（CRIP）拨款（HHSN266200700010C至PP）和NIH拨款（GM86217和GM84364至RS和TL）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

工具书类

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文章来自多囊卵巢综合征病原体由以下人员提供多环芳烃