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摩尔大脑。2012; 5: 17.
2012年5月21日在线发布。 数字对象标识：10.1186/1756-6606-5-17
预防性维修识别码：项目经理3506453
PMID：22613578

患者诱导多能干细胞产生的星形胶质细胞再现了亨廷顿病患者细胞的特征

塔里娅·朱佩里,1,2 Woon Ryoung Kim先生,1,2 程文江,1,三 余惠美（Huimei Yu）,1,2 罗素·L·马戈利斯,2,4 克里斯托弗·罗斯,2,4 郭利明,通讯作者1,2,三和宋红军通讯作者1,2,三
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补充资料

摘要

背景

亨廷顿病（HD）是一种严重的神经退行性疾病，临床表现为运动功能障碍、认知功能障碍和精神症状。目前还没有治愈这种进行性和致命性疾病的方法。这种遗传性疾病的诱因突变是亨廷顿基因中的三核苷酸重复扩增（CAG），导致聚谷氨酰胺束扩张。已经提出了多种机制来解释HD发生的优先纹状体和皮层退化，包括星形胶质细胞的非细胞自主作用。尽管存在大量的细胞培养和动物模型，但仍非常需要能够更准确地复制人类疾病的实验系统。人类诱导多能干细胞（iPSCs）是研究神经系统疾病的一个引人注目的新工具，因为这种细胞类型可以从患者身上获得，作为难以获得的无限细胞（如神经元和星形胶质细胞）的可再生、遗传可控制来源。基于iPSC技术的实验系统的开发可以帮助识别分子损伤和治疗。

结果

我们从一名患有成人HD和50个CAG重复序列（F-HD-iPSC）的父亲和患有青少年HD和109个CAG重排（D-HD-iPSS）的女儿身上获得iPSC。通过标准测定对这些疾病特异性iPSC系进行表征，以评估iPSC系的质量并证明其多能性。HD-iPSCs能够产生表型正常的功能神经元在体外能够存活并在成年小鼠大脑中分化为神经元体内移植后。令人惊讶的是，当HD-iPSCs定向分化为星形细胞谱系时，我们观察到来自F-HD-iPSC和D-HD-iPSC4的星形细胞中存在细胞质、电子透明的空泡，这在D-HD-星形细胞中更为明显。值得注意的是，在无额外应激源的基础培养条件下观察到患病星形胶质细胞的空泡化，并随着时间的推移而增加。重要的是，HD患者外周血淋巴细胞中也观察到类似的空泡化表型。总之，这些数据表明空泡化可能是与HD相关的表型。

结论

我们创造了一个独特的在体外使用患者特异性iPSCs研究HD发病机制的系统。来自患者特异性iPSC的星形胶质细胞表现出空泡化表型，这是先前在HD患者的原代淋巴细胞中记录的现象。我们的研究为未来使用人类iPSC模拟HD和高通量治疗屏幕的机制研究铺平了道路。

关键词：亨廷顿病，诱导多能干细胞，神经分化，星形胶质细胞，疾病建模

背景

亨廷顿氏病（HD）是一种致命的、进行性的神经退行性疾病，大约每10000人中就有1人受到影响[1]. 该病临床表现为运动功能障碍，主要表现为非自愿运动、认知异常和精神障碍[2]. 这种常染色体显性遗传病的遗传缺陷是亨廷素(HTT公司)导致HTT蛋白N端的聚谷氨酰胺束扩张[三]. 异常HTT蛋白的蛋白水解裂解导致不溶性聚集体在受影响细胞的细胞核和细胞质内形成特征性内含物[4,5]. 尽管野生型HTT蛋白普遍表达[6]突变体HTT蛋白在包括纹状体中棘神经元在内的神经元中优先积累[7]. 在其他神经细胞类型中也检测到突变HTT聚集体，如HD患者大脑中的星形胶质细胞[8,9]. 以纹状体变性和皮质丢失为特征的区域性神经变性是HD病理学的特征[10,11]. 大脑的其他区域，如海马体，也受到影响[12].

HD既表现为儿童期发病的青少年形式，也表现为中年发病的更常见形式。未受影响的个体在HTT公司基因和HD与36个或更多重复序列相关[13]. CAG重复序列长度和疾病发病率呈负相关，较长重复序列（>55 CAG）与青少年发病率更为常见[14]. 父系继承HTT公司突变可能导致CAG重复序列长度不稳定和CAG重复长度增加[15,16]. 尽管HD是一种定义明确的遗传病，其诱因突变早在20年前就已确定[三]，突变体的确切机制HTT公司神经退行性变的结果尚未确定，并且缺乏主要的治疗进展。各种在体外细胞培养系统[17,18]和动物模型[19,20]已发展用于研究HD发病机制，并提供了许多理论，如线粒体生物能量学异常、氧化损伤、转录失调和囊泡运输异常[2,5,21]. 胶质细胞（如星形胶质细胞）在HD发病机制中的潜在作用也正在研究中[9,22-24]. 例如，在HD小鼠模型中，星形胶质细胞中HTT与扩展的聚谷氨酰胺的表达已被证明影响谷氨酸转运并加剧神经表型[22,23]. 在多种HD啮齿动物模型的星形胶质细胞中也观察到胆固醇缺陷[25]. 星形胶质细胞在患者疾病过程中的直接致病作用尚不清楚。

一种可以将体细胞重新编程为具有多能性的细胞的转录因子组合的发现为研究人员提供了一种研究人类生物学和疾病的革命性工具[26,27]. 诱导的多能干细胞（iPSCs）可以从多种体细胞类型中获得，包括易于接近的皮肤成纤维细胞和外周血淋巴细胞[28,29]. 与人类胚胎干细胞（hESCs）类似，多能干细胞可以自我更新并在培养中无限扩张[27,30]. 更重要的是，它们具有在体内生成任何类型细胞的能力，这一特性对神经疾病的研究特别有用[31-35]. iPSCs的多能性使健康个体和疾病患者能够产生神经元和胶质细胞。iPSC的这一显著特征有助于研究难以从活体个体中获得的脑细胞类型。在这里，我们报告了一名成年型HD男性患者（F-HD-iPSCs）和其幼年型HD女儿（D-HD-iPSC）iPSCs的生成。与之前的报告一致，功能神经元可以从两个表型正常的HD-iPSC中衍生出来。然而，当星形胶质细胞从这些iPSC分化时，我们发现了一种细胞空泡化表型，这种表型在神经细胞中尚未报道，但在HD患者淋巴细胞中观察到。HD-iPCS复制原发性患者组织中发现的疾病相关表型的能力支持使用患者特异性iPSC进行疾病建模，并为未来的高通量筛查打开了大门。

结果

HD-iPSC线的推导和表征

为了推导iPSC系，我们逆转录引入了四个重编程因子（Oct3/4、Sox2、c-MYC和Klf4）[26,27]将一名成年HD男性患者（50个CAG重复）的皮肤成纤维细胞，其女儿与青少年HD（109个CAG反复）和非相关新生儿包皮成纤维细胞（28个CAG重新）作为对照。所有三种成纤维细胞系产生的集落显示出典型的iPSC形态（图​（图1A），1A） 与传统的人胚胎干细胞系相似，在持续扩增后保持正常核型（图​（图1B）。1B） ●●●●。所有细胞系均高表达碱性磷酸酶（图​（图1C）1C） 和hESC制造商Nanog、OCT3/4、SSEA4和TRA 1-60（附加文件1：图S1A）。体外利用类胚体试验对多能性进行评估，其中iPSCs在有利于自发分化的条件下悬浮培养。所检测的细胞系能够分化为中胚层、内胚层和外胚层来源的细胞（附加文件1：图S1B），确认在体外多能性。为了进一步评估iPSC系的多能性，我们使用了体内畸胎瘤形成试验。所有iPSC株在免疫低下小鼠中均表现出形成肿瘤的能力，这与畸胎瘤一致。在每个肿瘤中检测到代表三个主要胚层的组织（图​（图1D）。1D） ●●●●。此外，我们还通过Western blot分析证实了野生型和突变型HTT蛋白在HD细胞成纤维细胞和衍生iPSCs中的表达（附加文件1：图S1C）。

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诱导多能干细胞系（iPSCs）的特性。A、 B类：通过相差显微镜观察，成纤维细胞生成的iPSC细胞表现出典型的ESC形态(一)保持了正常的核型(B类).C类：iPSCs强烈表达多能性标记碱性磷酸酶，而周围MEF为阴性。D类：来自iPSC系的畸胎瘤的苏木精和伊红染色通过存在代表三个主要胚层（外胚层、内胚层和中胚层）的组织证实了多能性。比例尺：100μm。

HD iPSC衍生神经祖细胞形成功能神经元在体外

为了评估HD-iPSC细胞系的神经发育潜力，我们采用了两种方法将iPSC分化为神经元：一种使用iPSC聚集中间体形成神经祖细胞的无馈方法[36]以及使用小鼠基质细胞系诱导神经分化的共同培养方案[37]. 对于无饲料方法，iPSC菌落在神经诱导介质中悬浮生长，以生成可维持和进一步传代的神经球（图​（图2A）。2A） ●●●●。当被镀在聚-l-鸟氨酸-层粘连蛋白（PLO）涂层板上时，神经球附着并形成表达神经前体标记巢蛋白的神经花环（图​（图2B）。2B） ●●●●。神经玫瑰花结产生表达神经元标记物βIII微管蛋白的神经元（TUJ1；图2B） ●●●●。为了进行终末分化，将神经前体细胞分离成单细胞悬浮液，并在神经分化培养基存在的情况下，将其涂布在PLO涂层板或盖玻片上。分化细胞表现出典型的神经元形态（图​（图2C）2C） 并表达神经元标记物微管相关蛋白2ab（MAP2ab）和/或双皮质激素（DCX；图2D） ●●●●。与来源于对照C1 iPSC的神经元相比，在培养条件下，从F-HD-iPSC或D-HD-iPSC产生的神经元没有观察到显著的形态学差异。

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D-HD-iPSCs分化为神经前体、未成熟和成熟功能神经元。一：使用无馈微分协议从D-HD-iPSC线生成的神经球样本图像。B类：巢蛋白阳性神经祖细胞显示玫瑰花结形成和不成熟（TUJ1+)神经元。C类：来自D-HD-iPSCs的神经元相位对比图。D类：成熟（MAP2ab+)和双皮质素（DCX+)表达神经元。E类：使用PA6细胞系从D-HD-iPSC衍生的神经祖细胞。背景中观察到基质细胞单层。F类：TUJ1的大型网络+使用PA6基质细胞系进行诱导的神经祖细胞产生的神经元。比例尺：100μm。G公司：通过Western blot分析，D-HD-iPSC衍生神经元同时表达突变型和野生型HTT蛋白。H（H）：记录自D-HD-iPSC和C1-iPSC神经元的动作电位。我：从iPSC-衍生神经元记录的微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）。

对于神经分化的共培养方法，iPSCs被机械分离成小菌落并接种到小鼠基质细胞系PA6上，这表明可以诱导hESCs的神经分化[37,38]. 在PA6培养的一周内，iPSCs分化为具有特征性神经祖细胞形态的集落（图​（图2E）。2E） ●●●●。共培养三周后，许多细胞表现出神经元形态，并表达TUJ1（图​（图2F）。2F） ●●●●。HD-和C1-iPSCs都能够通过与PA6基质细胞系共同培养而分化为神经元。此外，通过Western blot分析（附加文件1：图S1C和图2G） ●●●●。

为了评估HD-iPSC衍生神经元的生理特性，我们进行了电生理分析。将来自每个细胞系的神经前体细胞分离成单细胞悬浮液，并将其镀在大鼠海马星形胶质细胞单层上三周[39]. 全细胞膜片钳记录显示，HD iPSC的神经元表现出诱发动作电位；与C1-iPSCs衍生神经元诱发的类似（图​（图2H）。2H） 。HD-iPSC衍生神经元也检测到了微小的兴奋性突触后电流，为功能性突触传递提供了证据（图​（图2I）。2一） ●●●●。在相同的实验条件下，我们没有从HD-iPSC中检测到明显的神经元功能缺陷或改变。

HD-iPSC衍生神经祖细胞移植、存活和生成神经元体内

接下来我们调查了短期体内通过将HD-iPSC衍生的神经前体细胞移植到成年小鼠脑中的移植潜力。为了鉴定移植细胞，我们在F-HD-iPSCs中表达绿色荧光蛋白（GFP），并通过无饲养方法将其分化为神经祖细胞（图​（图3A）。三A） ●●●●。将神经前体细胞立体定向注射到成年免疫功能低下小鼠侧脑室室下区（SVZ）的背外侧区（图​（图3B）。三B） ●●●●。成年SVZ提供了一个神经源性微环境，SVZ内源性神经祖细胞新产生的神经元沿着一条称为嘴侧迁移流（RMS）的路线向嗅球迁移[40]. 移植后6至8周，GFP+在RMS中发现细胞（图​（图3C）三C） 和嗅球（图​（图3D）三D） 人核抗体（HNA）阳性，证实GFP+细胞来源于移植的人类神经祖细胞。此外，一些GFP+嗅球中的细胞对神经元特异性核标记NeuN呈阳性反应，表现出成熟颗粒细胞的典型形态（图​（图3E）。三E） ●●●●。因此，来源于HD-iPSCs的神经前体细胞能够存活并分化为成年小鼠大脑中的神经元体内.

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将来自F-HD-iPSCs的神经前体细胞移植到成年小鼠脑中。一：移植前表达GFP的F-HD-iPSCs衍生的神经球（相位对比和荧光显示GFP表达）。B类：神经祖细胞移植示意图。将GFP标记的神经前体细胞注入脑室下区（SVZ），并沿吻侧迁移流（RMS）迁移至嗅球（OB）。在RMS中检测到GFP和人核抗体（HNA）阳性神经元(C类)六周后，在产科(D类)移植后8周。E类：NeuN+移植后8周，在OB中检测到表现出颗粒细胞形态的GFP表达细胞。除非另有说明，否则比例尺：100μm。

HD-iPSCs衍生的星形胶质细胞胞浆空泡化增加

研究表明，星形胶质细胞在表达带有聚谷氨酰胺扩增的HTT蛋白时，对神经元表现出非细胞自主效应[22,23]. 为了检测突变HTT对星形胶质细胞的直接影响，我们通过在星形胶质细胞培养基中培养将神经前体细胞分化为星形胶质细胞（图​（图4A）。4A） ●●●●。细胞持续传代并保持在星形胶质细胞培养基中，直到它们表现出典型的星形胶质细胞形态。所有三个iPSC系都能以类似的效率分化为表达星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S100β的细胞（图​（图44B） ●●●●。

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从多能干细胞生成星形胶质细胞。一：采用多步骤方案生成星形胶质细胞。iPSCs最初通过无饲养方式分化为神经球，随后分化为星形胶质细胞。B类HD-iPSCs产生的星形胶质细胞表现出典型的星形细胞形态，并表达星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S100β。比例尺：100μm（A）或20μm（B）。

与缺乏明显的细胞表型的神经元相比HTT公司突变后，我们检测到来自D-HD-iPSCs的星形胶质细胞细胞质内快速积聚数量和大小不一的离散透明液泡（图​（图5A）。5A） ●●●●。在源自F-HD-iPSC的星形胶质细胞中观察到数量较少的类似液泡。然而，在C1-iPSC衍生的星形胶质细胞中很少观察到空泡（图​（图5A）。5A） ●●●●。接下来，我们量化了含有细胞质空泡的星形胶质细胞的百分比。电镀后一天，来自D-HD-iPSCs的24%的星形胶质细胞已经含有细胞质空泡，相比之下，来自F-HD-iPSC的2.7%的星形细胞和1.1%的对照星形胶质细胞（每行600个细胞；4个不同的实验）。7天后，具有细胞质空泡的D-HD星形胶质细胞的数量增加到34%，相比之下，HD父亲星形胶质细胞和来自对照iPSCs的星形胶质细胞分别为2.7%和1.1%（图​（图5B；5B类；每行600个电池；4个不同的实验）。

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D-HD-iPSCs产生的星形胶质细胞胞浆空泡化增加。一：相位对比显微镜下在星形胶质细胞的细胞质中检测到液泡（箭头）。空泡的数量因产生星形胶质细胞的iPSC系而异。B类：细胞质空泡化的量化。值代表平均值+ SEM（n=4；*：P（P） < 0.0001; 方差分析）。C类：细胞质空泡呈空，GFAP染色阴性。D类自噬体标记物LC3在正常培养条件下生长的星形胶质细胞中检测到较弱，很少与细胞质空泡共存。真空通常是空的（箭头）。比例尺：50μm。

细胞质空泡对中间丝蛋白GFAP呈阴性，并且呈现空的（图​（图5C）。5C） ●●●●。为了确定细胞质空泡是否为自噬体，我们对与自噬细胞膜结合的标记物轻链3（LC3）进行了免疫细胞化学[41]. 在基础培养条件下，LC3染色在星形胶质细胞的细胞质内弱阳性，但很少与细胞质空泡共存（图​（图5D）。5D） ●●●●。为了加强对自噬体的检测，我们用氯喹整夜治疗星形胶质细胞，氯喹是一种药物，可积聚在溶酶体中，通过改变溶酶体pH值来防止溶酶体与自噬体内的融合。氯喹治疗显著增加了所有三种细胞系的细胞质空泡数量，D-HD星形胶质细胞表现出最大的空泡化（图​（图6A）。6A） ●●●●。氯喹诱导的空泡主要是LC3阳性的自噬体。然而，LC3并没有与所有观察到的细胞质空泡共定位（图​（图6B），6B） ，表明存在一种不同类型的液泡，可能与HTT公司星形胶质细胞突变。

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氯喹治疗后星形胶质细胞中的空泡形成增强。一：用自噬抑制剂氯喹隔夜处理星形胶质细胞，导致所有被检测细胞系的细胞质空泡化增加，其中D-HD星形胶质细胞的空泡数量最多。B类用氯喹治疗后，S100β表达的星形胶质细胞的自噬空泡标记物LC3的细胞质染色增强。比例尺：50μm。

为了进一步表征HD天冬氨酸细胞中观察到的细胞质空泡化，我们进行了透射电子显微镜（TEM）。星形胶质细胞的超微结构检查证实存在大量大小和形状不同的电子透明空泡（图​（图7A）。7A） ●●●●。细胞质内也检测到含有1-2个髓磷脂螺旋的自噬空泡，但其丰度低得多（图7B和​和7C）。7C） ●●●●。偶尔，我们也观察到星形胶质细胞有清晰的空泡（图​（图7D），7D） ，自噬体（图​（图7E）7E） 以及与脂滴相容的致密颗粒（图​（图7F）7F） 共存。一贯地，氯喹治疗增加了星形胶质细胞细胞质中检测到的液泡数量，许多液泡出现了电子不清楚的溶酶体（图7G、，​G、 7小时，7H、 和​和7I）。7一） ●●●●。总之，这些研究表明，星形胶质细胞具有HTT公司突变表现出电子透明空泡以CAG依赖的方式快速积累。

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D-HD-iPSC衍生星形胶质细胞的超微结构变化。一：在星形胶质细胞的细胞质内观察到许多电子透明的空泡。B、 C类：星形胶质细胞中有一些自噬细胞空泡和髓鞘螺纹（箭头）。D类：含有许多空细胞质空泡的星形胶质细胞的样本图像。高倍镜显示自噬细胞空泡伴髓磷脂螺旋(E类)和代表脂滴的大球形细胞质颗粒(F类).G、 H、I氯喹处理的星形胶质细胞表现出大量细胞质空泡化和溶酶体增殖。比例尺：2μm（A-D、G、H）或500 nm（E、F、I）。

讨论

HD是一种破坏性的神经系统疾病，目前尚无治愈方法，治疗方案也很少。鉴于HD的严重性，我们非常需要模型系统来进一步了解该疾病的发病机制，并作为发现或评估治疗化合物的筛选工具。在这项研究中，我们开发了一个在体外该模型系统来源于HD患者的细胞，iPSC系之间具有独特的遗传关系。一个iPSC系来源于携带一个HTT50个CAG重复的突变和成人发病HD。第二行是从他的女儿那里衍生出来的HTT公司109个CAG重复序列的突变和青少年发病HD。受影响父亲的后代中，三核苷酸重复序列长度经常增加，这种现象随着父亲重复序列长度的延长而加剧，这也解释了遗传预期[15,16]. 这种遗传不稳定性的潜在机制尚不清楚。父子对的HD-iPSC，包括此处报道的父子细胞，可能被用作一个模型系统来研究这一有趣的现象。

本研究中获得的HD-iPSC株表现出典型的人胚胎干细胞形态，表达多能性标记，保持正常的核型并产生畸胎瘤体内[42].所有细胞系都能形成神经祖细胞，而神经祖细胞又能最终分化在体外转化为表型正常的功能神经元，这些神经元可以激发动作电位并表现出功能性突触传递。虽然HD-iPSC衍生神经元中存在突变的HTT蛋白，但在基础条件下未检测到异常的神经元表型[43]. 此前，研究人员利用HD-iPSCs报告称，在正常情况下，神经元水平没有明显异常[44]. 此外，在使用来自其他神经退行性疾病患者的多能干细胞的研究中，普遍缺乏神经元表型，例如帕金森病（PD）患者的多巴胺能神经元[45]和ALS的运动神经元[46]. 这些发现表明，仅仅将iPSCs定向到特定的神经元亚型可能不足以产生某些衰老依赖性神经疾病的疾病表型，并且可能需要广泛的环境操作或培养中的长期观察。例如，在中等棘神经元分化方案下，细胞应激源导致HD iPSC衍生神经元的毒性[43]. 诱导HD患者神经退行性变所需的环境线索可能很复杂，需要复杂的环境，包括生长因子、形态因子和适当的应激源。可能有必要进一步定义在体外培养条件以完全重现患者中观察到的神经元病理学，例如HTT细胞内含物的形成。

无法长时间维持人类神经元，限制了我们在培养中模拟迟发性神经疾病的能力；然而，针对患者的iPSC技术的发展为将动物模型系统与细胞移植相结合进行纵向研究提供了可能性。我们评估了短期体内F-HD-iPSC的植入能力。我们证明，将F-HD-iPSCs衍生的神经前体细胞移植到成年NOD-SCID小鼠的神经原性SVZ中，能够沿着RMS迁移并在嗅球中生成神经元。重要的是，移植后HD-iPSC衍生的细胞能够在小鼠大脑中存活至少八周。我们异种移植实验的结果为未来的长期植入研究奠定了基础，这种系统可能用于评估长期神经元存活和退化体内作为临床前体内用于测试治疗方法的模型。

星形胶质细胞是成人大脑中丰富的一种细胞类型，它们具有重要而复杂的功能，例如为神经元提供代谢和营养支持，以及整体结构支持[47,48]. 星形胶质细胞功能障碍与包括ALS在内的几种神经退行性疾病的发病机制有关[49,50]，PD[51]和阿尔茨海默病[52]. 星形胶质细胞对HD的发展和进展的作用尚待阐明[9,22]. 最近的研究表明，星形胶质细胞中突变的N末端亨廷顿蛋白片段的表达抑制了BDNF的分泌[53]. 使用患者衍生iPSC开发在体外实验系统是iPSC产生任何感兴趣的细胞类型的能力[31]. 我们利用iPSCs的多功能特性，将其区分为GFAP+和S100β+星形胶质细胞。在两种HD-iPSCs来源的星形胶质细胞的细胞质中检测到引人注目的、离散的、大小可变的、清晰的液泡，其中D-HD-星形胶质细胞具有明显较多的细胞质液泡。当用电子显微镜检查时，细胞质中除了少量的自噬液泡和脂滴外，还含有明显的空泡。有趣的是，在HD患者的原始淋巴母细胞中观察到细胞质空泡化，发现CAG重复长度与细胞质空穴数量之间存在相关性[54,55]. 与我们在星形胶质细胞中观察到的结果一致，淋巴母细胞的超微结构发现，空泡、自噬细胞空泡和脂滴的数量增加。

已有报道使用iPSC技术成功模拟神经系统疾病，但主要是神经发育障碍，如脊髓性肌萎缩[56]，Rett综合征[57]和家族性自主障碍[58]. 虽然已经产生了许多针对神经退行性疾病的疾病特异性iPSC株，但很少有已发表的研究确定了疾病相关表型[31]. 在我们的研究中，我们确定了神经退行性疾病HD患者的iPSC产生的星形胶质细胞的表型。值得注意的是，这种表型是在没有额外应激源的基础条件下检测到的。重要的是，星形胶质细胞中的空泡特征与从HD患者中获得的原代淋巴母细胞中的特征一致[54,55]提示细胞空泡化可能是一种疾病相关异常，可作为HD的生物标志物。未来的研究将侧重于进一步确定疾病相关性和机制研究，以探索表型与HD发病机制的关系。

结论

我们从一个患有HD的女儿和她的父亲身上获得了特定于患者的iPSC，这提供了一种独特的在体外研究HD的系统，HD是一种定义明确的遗传性神经退行性疾病。来自两种疾病细胞系的iPSCs被分化为神经前体细胞并进一步分化为功能神经元在体外，移植后在成年小鼠大脑中产生神经元体内HD iPSCs衍生的星形胶质细胞表现出增加的细胞质空泡化。最重要的是，我们能够在基础条件下重述先前在HD患者的原代细胞中记录到的表型。这些结果为今后HD发病机制、疾病建模和高通量治疗筛选的机制研究铺平了道路。

方法

诱导多能干细胞的衍生和鉴定

皮肤活检取自一名成年亨廷顿病男性患者（50个CAG重复序列）和他患有青少年HD的女儿（109个CAG反复序列）。如前所述，从皮肤活检中建立皮肤成纤维细胞培养物，用于iPSC衍生[59]. 无关的新生儿包皮成纤维细胞取自美国型培养物收集（CRL-2097，28个CAG重复），用于生成对照iPSC。iPSC系是根据先前公布的方法，通过四种因子（Oct3/4、Sox2、c-MYC和Klf4）的逆转录病毒转导获得的[60]. 将iPSC细胞系保存在辐照小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的hESC培养基（hESM）中，该培养基由Dulbecco改良的Eagle培养液（DMEM）/F12（Invitrogen）组成，并辅以20%敲除血清替代物（KOSR，Invitrogen）、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mMβ-巯基乙醇、0.1mM非必需氨基酸溶液（NEAA）和8 ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Preprotech）。约翰霍普金斯医学院的细胞遗传学核心对所有iPSC系进行了染色体组型分析的G显带。所有程序均遵循机构IRB和ISCRO委员会批准的协议。

如前所述，用免疫组织学方法评估多能性标记的表达[59,61]. 细胞在室温下用4%多聚甲醛固定10分钟，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，并用10%驴血清在0.25%Triton X-100中的PBS中封闭1小时。标本在4%的PBS中的1%驴血清溶液中孵育过夜，温度为4°C，含有以下主要抗体：山羊抗Nanog（R&D Systems，1:250）、小鼠抗TRA 1-60（Millipore，1:250，）、小鼠抗血清SSEA4（Millibore，1:400）、鼠抗OCT3/4（Santa Cruz，1:400，）。在用PBS洗涤三次之后，样品在带有1%驴血清的PBS中与适当的二级抗体孵育1小时。用PBS清洗样品，并用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚，二盐酸盐（DAPI）进行反染色，以观察细胞核。FITC-和Cy3-结合的二级抗体来自Jackson ImmunoResearch。共聚焦显微镜系统采集图像。根据制造商说明，使用SigmaFAST BCIP/NBT试剂盒（Sigma）检测碱性磷酸酶活性。

对于在体外评估多能性，如前所述进行胚胎体测定[59]. 通过与胶原酶IV（Invitrogen）孵育，从MEF中酶解分离iPSCs。菌落用PBS（Invitrogen）清洗，重新悬浮并用超低附着板（Corning）悬浮培养。两天后，将培养基改为DMEM/F12，补充20%胎牛血清（FBS，HyClone）2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mMβ-巯基乙醇、0.1 mM-NEAA。胚状体形成开始两周后，将聚集物培养在明胶涂层板上，以便附着、生长和进一步分化。用于细菌层评估的主要抗体包括：小鼠抗人α-甲胎蛋白（Millipore，1:250）、兔抗巢蛋白（Milliepore，1.250）和小鼠抗人β-平滑肌肌动蛋白（Mililipore，1:500）。

评估体内如前所述，对产生的多能干细胞系进行多能干性、畸胎瘤形成试验[62]. 4-6周龄雌性NOD。哥伦比亚广播公司17-Prkdc公司科学情报部/J小鼠（Jackson实验室）将从一个汇合的六孔板收集的细胞皮下注射到背侧翼。通过用胶原酶IV（Sigma）孵育收获细胞，并将其重悬于补充有30%基质胶（BD Biosciences）的DMEM/F12培养基中。经常监测动物，并在注射后8至12周内切除可见肿瘤。组织用10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切片并用苏木精和伊红染色以进行组织学评估。所有动物程序均由约翰·霍普金斯大学医学院动物护理和使用委员会批准。

HTT表达评估

为了测定HTT表达，在RIPA缓冲液（1%NP-40，0.1%SDS，PBS中0.5%脱氧胆酸钠）中用蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（Roche）制备细胞裂解物。使用Pierce BCA蛋白质分析试剂盒（Thermo Scientific）测定蛋白质浓度。为了确保野生型和突变型HTT蛋白的分离，将预制的3-8%醋酸三钠凝胶（Invitrogen）在70V下运行30分钟，然后在4°C下运行110V 9小时。使用小鼠抗HTT抗体（Millipore MAB 2166，1:10000）和驴抗小鼠HRP缀合的二级抗体（Jackson ImmunoResearch，1:5000）进行蛋白质印迹分析。

iPSC的神经分化和功能评估

采用两种方法对iPSCs进行神经分化：无供体法和依赖供体法。我们使用了之前描述的无馈方法的修改版本[36]. 简言之，通过胶原酶IV培养，iPSCs从MEF中酶解分离。用PBS洗涤菌落，在添加20 ng/ml bFGF的hESM中重新悬浮，并使用超低附着板在悬浮培养中培养。五天后，将培养基更换为神经诱导培养基，包括添加2%B27（Invitrogen）、1%谷氨酰胺和40 ng/ml bFGF的神经基础培养基（Invit罗gen）。第二天进行部分培养基更换，观察菌落的神经球形态。为了最终分化为神经元，神经前体细胞通过研磨成单个细胞悬浮液进行机械分离，并在24孔板中以30000个细胞/孔的浓度涂上聚-L-鸟氨酸（Sigma，20μg/ml）和层粘连蛋白（BD Biosciences，10μg/ml。为了启动分化，将分离的神经前体细胞培养在不含bFGF（神经分化培养基）的神经诱导培养基中。每三到五天更换一次培养基，并经常监测细胞的神经生长情况。在没有bFGF的情况下，在电镀后一周观察到神经元分化。为了确认神经分化，使用了以下主要抗体：小鼠抗Nestin（Chemicon，1:250）、兔抗β-微管蛋白（TUJ1；Sigma 1:2000）、小鼠抗MAP2ab（Sigma，1:2500）和山羊抗DCX（Santa Cruz Biotechnology，1:500）。

根据先前公布的方案，利用PA6基质细胞系（RIKEN）通过依赖饲料的方法进行神经分化[37]. PA6细胞保存在补充有10%FBS和1%青霉素-链霉素（P/S）的最低基本培养基α培养基（Invitrogen）中。一旦基质细胞系形成融合的单层，它就被用于神经分化。使用STEMPRO EZPassage工具（Invitrogen）从MEF中机械采集iPSCs，用PBS洗涤，并在神经诱导培养基中重新悬浮，该培养基由格拉斯哥最低必需培养基（Invit罗gen）、10%KOSR、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和0.1mMβ-巯基乙醇和1%P/S。将小iPSCs菌落接种到PA6单层上，每三天更换一次培养基。每天监测培养物的神经元分化情况。

为了评估神经元功能，对来自对照iPSCs和HD衍生iPSCs的神经元进行电生理学研究，如前所述[39]. 通过研磨分离由无饲料方法获得的神经前体细胞，并将单个细胞镀到大鼠海马星形胶质细胞层上[47,63,64]. 对于全细胞膜片钳记录，用以下内部溶液填充贴片移液管（3-7 MΩ）以记录动作电位和mEPSC：（以mM计）葡萄糖酸钾130、KCl 4、HEPES 10、EGTA 2、ATP 4、GTP 0.3和磷酸肌酸7（pH 7.3），外部溶液具有以下组成（以mM计）：NaCl 140、KCl 3、CaCl22、氯化镁21.3、HEPES 10和葡萄糖10（pH 7.4）。对于mEPSC记录，向外溶液中添加10μM荷包牡丹碱和1μM河豚毒素。Axopatch 200B放大器（Axon Instruments/Molecular Devices Corp.，Union City，CA）用于神经元记录，并使用Clampfit 9.02（AxonInstruments）进行分析。数据在10 kHz下用2 kHz低通滤波器进行数字化。

iPSC-derived神经前体细胞的移植及植入评估

GFP公司+通过用移液管尖端研磨，将来自F-HD-iPSC系的神经球机械分离成单细胞悬浮液。通过离心法造粒细胞，并将其重新悬浮在浓度为100000个细胞/μl的Neurobasic培养基中。4-6周龄雌性NOD。第17页-Prkdc公司科学情报部/小鼠作为移植受体。将小鼠麻醉，并将400000个细胞立体定向注射到每只小鼠的脑室下区（4μl/部位；AP：1 mm，ML：1 mm；DV：距Bregma 2 mm）。在三周、六周和八周龄时处死小鼠，以评估神经祖细胞的植入情况。从移植小鼠中制备脑切片，并按照所述进行免疫染色[65,66]. 以下主要抗体用于免疫组织化学：小鼠抗NeuN（Chemicon，1:500）、兔抗GFP（1:1000）和小鼠抗人细胞核（HNA，Millipore，1:100）。使用多轨道配置，在META多光子共焦系统（蔡司LSM 510）上采集图像。手术按照约翰·霍普金斯大学动物护理和使用委员会的规定进行。

iPSCs的星形胶质细胞分化及其特性

使用无饲料方法获得的神经球以机械方式分离成单个细胞悬浮液，通过细胞过滤器过滤，然后镀在涂有聚-L-鸟氨酸-层粘连蛋白的烧瓶上。细胞在星形胶质细胞培养基（ScienceCell）中培养，必要时传代。一旦细胞表现出星形胶质细胞形态并形成连续单层，则使用兔抗GFAP（Dako，1:500）和鼠抗100β（Sigma，1:500。为了量化细胞质空泡化的星形胶质细胞数量，对每个细胞系随机选择的600个细胞进行了检查，并测定了四个实验中空泡化细胞的平均百分比。使用兔抗LC3 A/B（细胞信号，1:200）对自噬标记LC3进行免疫染色，以检测星形胶质细胞是否存在自噬体。为了诱导自噬体的形成，用50μM二磷酸氯喹（Invitrogen）处理星形胶质细胞过夜。

透射电子显微镜（TEM）

细胞在2.5%戊二醛、3mM氯化钙和1%蔗糖中，在0.1 M二羧酸钠缓冲液（pH 7.2）中室温下固定1小时。缓冲液冲洗后，样品在缓冲液（1）中的1%四氧化锇中后固定样品用2%醋酸铀水溶液染色，在分级系列乙醇中脱水，并嵌入Eponate 12（Ted Pella）树脂中。样品在60°C下聚合过夜。在Reichert-Jung Ultracut E超薄切片机上用金刚石刀制备超薄切片，并用200目裸铜网格拾取。网格用50%甲醇中2%醋酸铀酰染色，细胞用日立7600 TEM在80 kV下观察。图像用AMT CCD（1K x 1K）相机拍摄。TEM是在约翰·霍普金斯基础生物医学科学研究所的显微镜设备上进行的。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

T.A.J.、R.L.M、C.A.R.、G.L.M.和H.S.构思了这项研究。T.A.J.领导了该项目并进行了大部分实验。W.R.K.进行了移植实验。C.C.衍生iPSC线。H.Y.进行了电生理分析。R.L.M.和C.A.R.提供了HD患者的皮肤活检样本。T.A.J.、G.L.M.和H.S.撰写了这篇论文。所有作者都阅读并批准了手稿。

补充材料

附加文件1：

图S1。体外D-HD-iPSC的特性。一：多能性标记的表达。核标记物nanog和八聚体结合转录因子3/4（OCT3/4）、细胞表面标记物TRA1-60和阶段特异性胚胎抗原4（SSEA4）免疫染色阳性。B类:体外通过类胚体实验，从三个主要胚层中产生细胞，证实了其具有多能性。鉴定了代表内胚层的α-胎蛋白（AFP）阳性细胞、代表中胚层的平滑肌肌动蛋白（SMA）表达细胞和代表外胚层的巢蛋白阳性细胞。比例尺：100μm。C类：Western blot分析证实了突变和野生型HTT蛋白在来源于D-HD-iPSC的成纤维细胞、iPSCs和神经球中的表达。人胚胎干细胞株H1只表达一条带，对应于野生型蛋白。

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致谢

我们感谢Y.Sun和T.Dawson的建议，感谢Ming和Song实验室成员的意见，感谢C.Obie和D.Valle对患者皮肤成纤维细胞培养物的推导，感谢Hopkins用于EM和核型分析的核心设施，感谢L.Liu、Y.Cai、M.Jardine Alborz和Q.Hussaini的技术支持。本研究得到了马里兰州干细胞研究基金会对G.L.M.、霍普金斯脑科学研究所和NIH（MH087874）对H.S.的资助，马里兰州干电池研究基金会向T.A.J.、W.R.K.、C.C.和H.Y.提供的博士后奖学金，以及韩国研究基金会（KRF-2008-357-E00001）向W.R.K提供的博士后奖学金。

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