监管机构S公司-蛋白质翻译后修饰的硝基化^*

摘要

介绍

在真核细胞中，通过翻译后修饰调节蛋白质特性和功能是介导信号转导的核心分子机制。在过去的十年中，已经建立了S公司-亚硝化，将NO基团添加到Cys硫醇中形成S公司-亚硝基蛋白（SNO-蛋白）调节所有功能蛋白类和检测细胞类型中的广泛蛋白质(1–三). 文献现在约有3000篇S公司-亚硝基蛋白质类（包括那些由外源性生理亚硝化剂识别的），鉴于脱氮酰化酶在确定蛋白质可检测水平方面的新作用，这可能只是冰山一角S公司-亚硝化(4,5). 如本综述所示，所形成的图片表明，细胞信号的传播或调制S公司-亚硝基化通常导致与由翻译后修饰的其他主要机制介导的信号模式的串扰。事实上，迄今为止，在传递细胞信号的翻译后修饰中S公司-亚硝基化可能与磷酸化和泛素化相当，信号串扰是其核心工作原理(6). 最近的一些综述强调了底物特异性的决定因素和S公司-亚硝化/反硝化(1,2,4,5,7). 我们在这里首次总结了S公司-亚硝基化作为蛋白质翻译后修饰的多效性调节剂(图1).

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图1。

翻译后主要机制的示意性总结S公司-亚硝化和分子调控位点。

本文提出的摘要提出了与监管分析普遍相关的问题S公司-亚硝化（如其他翻译后修饰）。关于因果关系，很难预测或评估产生重大监管效果所需的修改程度体内，部分原因是涉及底物蛋白的分区修饰(1,8). 因此，只有一小部分蛋白质，如与受体或其他伴侣相关的蛋白质(1,8,9)，可以传递细胞信号。此外，在功能获得的情况下，修饰的群体化学计量学可能相对不重要，包括诱导的蛋白质相互作用和转录因子或通道的激活，其中少数群体可能传递生物活性。尽管如此，S公司-事实上，已有文献证明，亚硝基化和激活了相当比例的通道群(10)值得注意的是，化学计量比为1S公司-在酶活性（线粒体caspase-3）受到抑制的情况下观察到亚硝化作用(11,12). 目标客户提出了其他挑战S公司-信号通路中多种功能相关元素的亚硝化作用，因为时空分析在很大程度上超出了现有技术的范围S公司-亚硝化与抑制刺激偶联NOS活性可以为生理作用提供有力证据。对特异性决定因素的新认识S公司-亚硝基化突出了NO基团来源与底物直接结合的重要性，靶Cys的反应性，以及亚硝基化试剂的性质，正如新认识到的反亚硝基化酶的作用所表明的那样(7).

磷酸化

监管机构S公司-蛋白激酶和磷酸酶的亚硝化作用影响由磷酸化/去磷酸化介导的广泛信号转导途径，这里提供了说明性的例子(表1). 在许多但并非所有情况下S公司-对激酶或磷酸酶活性的亚硝化作用是抑制性的，是通过修饰单个Cys残基来实现的，在激酶的情况下，可以通过抑制激酶活性或调节激酶与底物的相互作用来直接实现抑制。这些工作原理在MAPK介导的信号传递中得到了很好的说明(1)介导TNFα诱导的细胞凋亡。内源性S公司-MAPK激酶激酶ASK1的亚硝化(一爆裂秒信号调节k个酶-1)单个Cys抑制ASK1与其主要下游效应器MKK3和MKK6的结合(13).S公司-MKK3/6下游MAPK靶点JNK内单个Cys的硝基化抑制JNK介导的c-Jun磷酸化和反式激活(14)，至少部分通过抑制JNK和c-Jun的结合(15). 因此，S公司-特异性调节Cys残基的亚硝化作用可以通过调节MAPK介导的顺序转导阶段来发挥校准的抗凋亡影响。除了CMCG激酶家族的MAPK亚家族外，S公司-亚硝化作用于细胞周期素依赖性激酶亚家族成员(16,17). 内源性S公司-神经元Cdk5的亚硝化作用靶向ATP-结合囊内的一个或两个Cys残基，包括Cys-83，由此产生的激酶活性调节树突生长、分支和脊椎形成(17,18). 过度S公司-Cdk5亚硝化与阿尔茨海默病树突状棘丢失相关(18).

表1

监管示例摘要S公司-蛋白质翻译后修饰的亚硝化

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监管示例S公司-MAPK家族外丝氨酸/苏氨酸激酶的亚硝化作用由Akt激酶（PKB）和G蛋白偶联受体激酶（GRK）提供。² S公司-Akt内单个Cys的硝基化抑制胰岛素刺激的Akt催化活性，AktS公司-糖尿病小鼠模型中亚硝基化增强(19,20). 增强S公司-Akt的亚硝化也与骨骼肌中与衰老相关的缺陷有关(21).S公司-β刺激诱导GRK2激活环内单个Cys的硝基化₂-肾上腺素受体（β₂-AR）与内皮型NOS（eNOS；NOS3）结合，抑制配体刺激的GRK2活化，从而抑制β₂-AR磷酸化，从而抑制与心力衰竭和哮喘相关的受体脱敏和下调(22).S公司-硝基化也抑制蛋白激酶C的活性(23)以及其他丝氨酸/苏氨酸激酶，包括IκB激酶和胰岛素受体激酶，如下所述。

蛋白酪氨酸激酶（PTK）在多种信号通路中发挥作用，以及S公司-亚硝基化已被证明可以调节受体和非受体PTK的功能。S公司-表皮生长因子受体（原型受体PTK）内一个或两个Cys残基的硝基化抑制其自身（反式）磷酸化和下游信号传导(24). 受体PTK的下游信号传递通常由非受体PTK（其原型为c-Src）的磷酸化和活化介导。S公司-c-Src催化域内的单个Cys的硝基化（在非受体PTKs的Src家族的其他成员中是保守的）激活而不是抑制通过酪氨酸自磷酸化和β-雌二醇激活c-Src-癌细胞侵袭中的一个重要步骤评估的c-Src的催化活性，证明依赖于c-SrcS公司-亚硝化(25). 激酶活化的另一个例子S公司-亚硝化作用由（非蛋白）激酶葡萄糖激酶提供。S公司-胰岛β细胞中胰岛素激活神经元NOS（nNOS；NOS1）后，单个Cys残基（Cys-371）的亚硝化作用会破坏葡萄糖激酶和nNOS的结合，从而解除葡萄糖激酶的抑制以促进胰岛素分泌（尤其是胰岛素是受体PTK配体的一个突出例子）(26).

蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶均受S公司-亚硝基化。PTP超家族成员利用一种催化性Cys，众所周知，PTP通过内源性产生的过氧化氢对其进行氧化抑制，过氧化氢可能是可逆的或不可逆的。S公司-通过靶向活性位点Cys，和S公司-亚硝化保护PTP1B免受过氧化氢不可逆氧化(27). 细胞辐射诱导的瞬态S公司-活性位点Cys的亚硝化作用，从而使SH2失活(S公司钢筋混凝土小时同源论2)含结构域的非受体酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2(28). 此外，PTP1B、SHP-1和SHP-2是S公司-亚硝化作用导致eNOS的胰岛素刺激，导致胰岛素受体和下游信号元件（包括Akt激酶）的酪氨酸磷酸化增强，从而增强胰岛素反应性(29). 趋化因子基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）通过涉及JNK3的MAPK级联信号传递，JNK活性由MKP7调节(M（M）AP公司K（K） 第页磷酸酶7). SDF-1α对JNK3的激活依赖于eNOS的激活，并且证明了其对S公司-亚硝化和抑制MKP7，导致JNK3磷酸化增强(30). 因此，S公司-MKP7的亚硝化作用是SDF-1α调节内皮细胞迁移和血管生成的关键环节(30).

最近的结果表明PTEN(第页磷酸酶和十sin同源物）也受S公司-亚硝化。编码PTEN的基因被确定为在许多癌症中突变的肿瘤抑制因子。虽然PTEN的催化结构域与双特异性PTP相似，但其主要底物是磷脂酰肌醇，尤其是磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸。因此，PTEN负调控磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号通路。S公司-PTEN中单个Cys的硝基化抑制磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸磷酸酶活性，尤其是S公司-亚硝基化（Cys-83）是变构的，与PTEN氧化失活的靶点活性位点Cys（Cys-124）不同(31).S公司-PTEN的硝基化增强Akt信号传导（Akt底物的磷酸化），并且S公司-缺血脑组织中PTEN的亚硝化作用增强(31,32)与Akt促进细胞存活的作用一致。增强S公司-在阿尔茨海默病患者的大脑中也观察到PTEN的亚硝化作用(33).

乙酰化

一氧化氮在调节真核基因表达方面发挥着广泛的作用，这种影响至少部分通过S公司-亚硝化(34,35).S公司-转录因子调节性结合伙伴的硝基化可对转录因子激活、稳定性和/或核靶向性产生核外影响，如缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和p53（见下文）(1)、和S公司-转录因子在DNA结合或变构位点的亚硝化可以直接调节细胞核中的基因转录，如NF-κB，其中S公司-关键氧化还原敏感Cys残基的亚硝化抑制NF-κB DNA结合和启动子活性，从而抑制NF-kb依赖性基因转录(36). 此外，还发现S公司-亚硝化作用也可能在转录调控的表观遗传机制中作用于细胞核，特别是通过组蛋白乙酰化/去乙酰化的调控(表1).

HDAC2型(小时活塞d日e（电子）交流电乙酰化酶2)由直接修改S公司-亚硝化。在神经元中，S公司-HDAC2的亚硝基化偶联到BDNF刺激nNOS被定位于两个Cys残基，Cys-262和Cys-274，这两个残基在其他I类组蛋白脱乙酰酶中是保守的(37).S公司-硝基化并不影响脱乙酰酶活性，但它诱导染色质释放HDAC2，从而增强组蛋白的乙酰化和转录激活，特别是cAMP反应元件调节基因的乙酰化。染色质重塑的至少一个功能是控制调节树突生长和分支的基因的激活(37). 在骨骼肌中，HDAC2的表达在肌营养不良MDX小鼠模型中上调，其特征是营养不良肌肉中NOS活性失调(38). HDAC2的下调或NOS的补充都会改善MDX肌肉的病理生理表型，而NOS的增加会导致S公司-HDAC2的亚硝化作用(38).

对核能监管的重要新见解S公司-斯奈德及其同事最近提供了亚硝化反应(39). 这些研究人员确定了酶GAPDH在转运中的作用S公司-从胞浆到细胞核的基于亚硝化的信号：GAPDH，即S公司-在凋亡信号背景下由内源性NO生成的单（活性位点）Cys-150亚硝酰化结合E3泛素连接酶Siah1，从而共同转位到细胞核(40). 随后，他们报告说S公司-GAPDH的亚硝化促进其与核底物的结合，包括HDAC2和III类脱乙酰酶sirtuin-1，随后NO基团从SNO-GAPDH转移到结合伙伴(39). 此外，反式脂肪酸-S公司-亚硝化抑制sirtuin-1活性及其对转录的影响。因此，SNO-GAPDH作为一个核S公司-亚硝化酶促进组蛋白乙酰化从而促进基因转录(7,39). 最近，该小组已经表明，组蛋白乙酰化也通过组蛋白甲基转移酶SUV39H1的Siah1降解而促进，Siah1与SNO-GAPDH共转位到细胞核(苏压缩机v（v）公理化3–9 小时奥莫罗语1) (41). 尽管赖氨酸乙酰化在核组蛋白的背景下最具特征，但蛋白质组学分析表明，哺乳动物乙酰组包含至少1700种参与广泛细胞功能的蛋白质，其中大多数是非核的(42). 的作用S公司-亚硝基化在调节核外赖氨酸乙酰化中的作用尚未探索。

长链脂肪酸S公司-酰化(S公司-棕榈酰化）

蛋白质中的半胱氨酸残基可能会受到硫醚键合聚异戊二烯化或硫酯键合的共价脂质修饰S公司-棕榈酰化。S公司-棕榈酰化是蛋白质的胱氨酸导向和其他共价脂质修饰的独特之处，因为它至少在许多情况下是可逆的和动态的。DHHC家族成员（以天冬氨酸-赖氨酸-胱氨酸活性位点为特征）充当S公司-棕榈酰化酶和两类去棕榈酰化酶类已被鉴定(43).S公司-棕榈酰化已被证明影响广泛的蛋白质特性和功能，包括亚细胞定位和稳定性、蛋白质相互作用和信号传播(43). 与S公司-亚硝化，只有一个或几个Cys残基S公司-大多数修饰蛋白质中的棕榈糖基化。在一定程度上，靶向S公司-棕榈酰化和S公司-亚硝基化是共有的，S公司-棕榈酰化和S公司-亚硝化反应可能是反相的。双方之间的相互竞争关系S公司-棕榈酰化和S公司-亚硝基化最初是基于在一氧化氮供体存在的情况下，多种神经元蛋白（包括GAP-43和SNAP-25）的棕榈糖基化降低，通过代谢标记（纳入[^三H] 棕榈酸酯）(44). 随后的研究也采用了代谢标记，报告了通过S公司-亚硝化剂S公司-哺乳动物β的棕榈酰化₂-AR、转铁蛋白受体和小窝蛋白(45,46)以及冠状病毒棘突蛋白(47).

相互竞争的直接证明S公司-亚硝化和S公司-Ho最近提供了生理条件下神经元中的棕榈酰化等。(48). PSD-95型(第页成本秒突触的d日高密度蛋白95kDa）作为突触后密度的主要支架蛋白，被认为是动态的S公司-Cys-3和Cys-5棕榈酰化(49). 霍等。(48)表明这些残基也受到内源性的影响S公司-亚硝化及其刺激S公司-通过代谢标记和酰基-生物素交换（直接指示了S公司-棕榈酰化底物）。相反，抑制S公司-棕榈酰化，无论是在培养细胞中的药理作用，还是在完整小鼠中通过相关DHHC的基因敲除，都能增强内源性S公司-亚硝化。这种动态相互作用的生理相关性通过发现PSD-95的突触聚集被证明，已知PSD-95需要Cys-3/Cys-5棕榈酰化，并在PSD-95支架的谷氨酸受体的组织中发挥重要作用(49)，通过刺激NMDA受体后nNOS激活而降低。值得注意的是，尽管尚未探索，S公司-亚硝化可能抑制蛋白质S公司-通过靶向CoA中的活性Cys残基进行棕榈酰化，从而抑制脂肪酰基CoA的形成，脂肪酰基-CoA是S公司-酰化或DHHC酶活性部位的活性Cys残基S公司-棕榈糖基化功能。鉴于数百种蛋白质（基本上分布在所有功能类中）被已知的内源性修饰S公司-亚硝化和/或S公司-棕榈酰化，它们相互作用的影响是深远的(表1).

泛素化、SUMO化和ISGylation

泛素化是指8.5-kDa蛋白泛素与目标蛋白Lys残基的连接（单泛素化），随后可能通过将额外的泛素部分连接到共轭泛素内七个Lys残基中的一个或多个，形成泛素链。E1泛素激活酶激活泛素导致泛素与E1活性位点Cys硫醇的硫酯键，然后通过转硫酯化作用将泛素转移到E2泛素结合酶的活性位点Cys硫醇，最后在目标蛋白赖氨酸和泛素的C末端甘氨酸之间形成异肽键，该键由E3泛素连接酶催化，可与E2和底物相互作用。泛素化最初显示通过将修饰底物靶向蛋白酶体的多泛素化来控制蛋白质降解。然而，现在已经确定泛素化的形式（单泛素化与多泛素化和多泛素链中的泛素间连接类型决定了与广泛的细胞过程和信号事件（例如，包括受体和膜运输以及基因转录）相关的不同命运(表1).

在真核生物中，多泛素化介导的一些蛋白质的降解受N端规则控制，根据该规则，N端Asn、Gln或Cys转化为Arg，从而被E3连接酶识别(50). 虽然Asn或Gln在与Arg结合之前酶解脱酰胺为Asp或Glu，但N-末端Cys的精氨化是通过修饰介导的，假设为S公司-亚硝化，然后是O₂-依赖性氧化为半胱氨酸磺酸，如RGS的例子(第页调节器G公司蛋白质秒信号）蛋白质(50). 因此，S公司-亚硝基化可能是实现泛素依赖的蛋白质降解N端机制的必要步骤，从而控制多个底物的周转。

S公司-硝基化已被证明抑制环指E3连接酶活性。S公司-靶向BIR内Cys的神经元环指E3连接酶parkin的硝基化(b条阿昔洛韦病毒我细胞凋亡抑制剂第页epeat基序）和RING结构域在帕金森病啮齿类动物模型和散发性帕金森病患者的大脑中增强，从而抑制帕金森活性（可能在激活之前(50))与帕金森（和其他神经退行性疾病）的蛋白质积累和聚集有关(51,52). 对于无名指E3连接酶XIAP(X（X）-链接的我抑制剂一爆裂第页蛋白质），S公司-分别以RING和BIR结构域内的Cys残基为靶点的亚硝化抑制泛素介导的促凋亡caspase半胱氨酸蛋白酶（caspase-3）的降解，并释放和去抑制XIAP结合的caspase-3，从而促进细胞死亡(53)在患有多种神经退行性疾病的患者的大脑中检测到SNO-XIAP水平升高(53,54). 如上所述，在N端规则路径的情况下，S公司-底物的亚硝化可以调节其泛素化倾向。S公司-铁中单个Cys的硝化反应²⁺-IRP2的相关降解顺序(我隆第页调节第页蛋白质2)据报道可增强其泛素化和蛋白酶体降解(55). 相反，内源性S公司-关键凋亡调节蛋白Bcl-2中一对Cys残基的亚硝化抑制其泛素化和蛋白酶体降解并抑制凋亡(56)，类似地，S公司-抗凋亡FLICE抑制蛋白FLIP中一对Cys残基的亚硝化作用抑制其泛素化并发挥抗凋亡作用，FLIP与凋亡信号相关下调(57). 在“肿瘤抑制”转录因子p53的情况下，环指E3连接酶HDM2的泛素化通过蛋白酶体降解介导快速转换S公司-HDM2内单个Cys的亚硝化作用抑制p53结合，从而稳定p53并激活p53依赖性转录(58,59).

其他示例说明通过以下方式控制泛素化S公司-通过调节选择性翻译后修饰进行亚硝化。转录因子NF-κB与细胞质复合并被IκB隔离在细胞质中(我NF抑制剂-κB)蛋白和IκB激酶复合物（包含催化性IκBkinase（IKK）α和IKKβ亚单位）对IκB的磷酸化诱导IκB-泛素化和降解，使NF-κB移位到细胞核并与DNA结合(60). 雷纳尔等。(61)表明内源性S公司-IKKβ内Cys-179亚硝化抑制IκB磷酸化，从而调节蛋白酶体靶向IκB和NF-κB依赖性转录。在HIF-α的情况下，HIF-β脯氨酸残基的羟基化促进了von Hippel-Lindau蛋白pVHL的结合，pVHL作为E3泛素连接酶的底物识别模块发挥作用。因为羟基化是O₂-依赖性，HIF-α通过缺氧稳定。然而，观察到外源性S公司-亚硝化剂和内源性NOS活性可以在常压下稳定HIF-1α(58,62)后来证明S公司-在HIF-1α的氧依赖降解域内的单个Cys的亚硝化可以抑制正常毒性pVHL结合，从而抑制HIF-1β的泛素化和降解(63). Normoxic公司S公司-靶向缺失反硝化酶可增强小鼠HIF-1α的亚硝化作用S公司-亚硝基谷胱甘肽还原酶和缺血性心肌梗死的影响在这些动物中得到改善，这与HIF-1α上调血管内皮生长因子和增强血管生成有关(64). 此外，如上所述，核蛋白的泛素化部分是通过与GAPDH和E3连接酶Siah1的核结合和共移位实现的，它们依赖于GAPDHS公司-亚硝化(40). SNO-GAPDH的结合稳定了Siah1，从而增强了核蛋白的降解(40).

存在许多泛素样蛋白，最显著的是SUMO家族秒购物中心u个类铋瞬间difiers和ISG15我干扰素-秒刺激的克烯15，以类似泛素化的方式修饰蛋白质Lys残基，以调节广泛的蛋白质功能(58,59).S公司-SUMO E3连接酶Pias3中单个Cys的硝化反应(第页蛋白质我抑制剂一激活的S公司TAT3）通过泛素E3连接酶Trim32促进其与泛素的相互作用和泛素化(三个分裂米含otif32)从而增强Pias3的降解并抑制sumoylation(65). ISG15由直接修改S公司-参与同二聚反应的单个Cys的亚硝化作用，以及S公司-亚硝基化导致ISGylation增强(66).

有数百种哺乳动物E3连接酶，它们分布在至少四个不同的机械类别中(67). 对以下因素的敏感性和潜在功能影响知之甚少S公司-跨E3酶（或E1和E2酶，它们具有活性中心Cys硫醇）的亚硝化作用。可能的角色S公司-亚硝化在调节泛素化介导的信号传导中的作用，至少在一定程度上独立于底物周转，也尚未被探索。

基于Cys的氧化还原修饰（谷胱甘肽酰化、硫水合和选择性Cys氧化）

除了S公司-亚硝基化，蛋白质中的Cys残基可能会经历各种基于氧化还原的修饰和亲电取代(68,69). 有强有力的证据和结构原理表明，硫醇的氧化修饰通常在功能上是不可互换的(8,69)以及一种基于氧化还原的调控分子代码(70). 特定修饰传递生理信号的程度是一个积极的研究领域(69). 迄今为止，通过形成亚硫酸和谷胱甘肽混合二硫化物来修饰Cys残基的生理作用，最好是在细胞增殖和分化的背景下，通过抑制磷酸酶发挥作用(69,71)，但最近出现了调节其他类蛋白质成员的例子，如ATM的激活(一出租车t吨扩张症米过氧化氢介导的二硫键二聚化突变）蛋白激酶(72)可能预示着更广泛的权限。之间的串扰S公司-可以预测亚硝化和选择性氧化还原修饰，因为1）一般来说，S公司-亚硝化将阻止蛋白质硫醇的进一步氧化(27,73); 2)S公司-亚硝化可催化活性或变构位点蛋白质内或蛋白质间邻位硫醇之间形成二硫键(74)尽管加速二硫键形成的生理相关性尚未得到很好的证实；和3）S公司-亚硝化可增强谷胱甘肽酰化(75,76)或硫水合S公司-在特定情况下，亚硝化Cys的结构特征使S-NO倾向于对硫的侵蚀。此外，S公司-可以预见，亚硝化将调节氧化酶和还原酶的活性，这些酶利用活性位点或变构硫醇来控制氧化还原活性第二信使的产生和可能服务于信号传递的蛋白质的氧化还原修饰。一个显著的例子是抑制S公司-过氧化物酶原2的亚硝化反应(77); 过氧化物酶原通过调节PTP活性在PTK介导的信号传导中具有公认的作用(71). 探索两者之间的相互作用和串扰S公司-随着细胞信号转导中替代修饰的生理作用的确立，蛋白质Cys残基的亚硝化、选择性氧化还原和亲电修饰将变得越来越重要(表1).

参考文献