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单元格。作者手稿；PMC 2011年4月11日发布。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2008年8月22日；134(4): 657–667.
数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2008.06.049
预防性维修识别码：PMC3073300型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院133324
PMID：18724938

活化星状细胞的衰老限制肝纤维化

瓦列里·克里扎诺夫斯基,1 莫妮卡·尹,1,2 罗斯·A·狄金斯,1 斯蒂芬·赫恩,1 珍妮尔·西蒙,1,三 科尼利厄斯·米廷,1 赫尔曼·耶伊,4 拉尔斯·泽德,1,5和斯科特·劳伊1,三，6
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补充资料

总结

细胞衰老是一种有效的肿瘤抑制机制；然而，其对非癌症病理的功能性贡献尚未被研究。在这里，我们发现衰老细胞在经过处理的小鼠肝脏中积累，产生纤维化，这是肝硬化的前兆病理。衰老细胞主要来源于活化的肝星状细胞，其最初增殖是为了应对肝损伤，并产生沉积在纤维化瘢痕中的细胞外基质。在缺乏关键衰老调节剂的小鼠中，星状细胞继续增殖，导致过度肝纤维化。此外，衰老激活的星状细胞表现出与细胞周期退出一致的基因表达谱，细胞外基质成分分泌减少，细胞外矩阵降解酶分泌增加，免疫监视增强。因此，自然杀伤细胞在体内外优先杀死衰老活化的星状细胞，从而促进纤维化的解决。因此，衰老程序限制了对急性组织损伤的纤维生成反应。

介绍

细胞衰老是一种稳定的细胞周期阻滞形式，可能限制癌前细胞的增殖潜能(Campisi和d'Adda di Fagagna，2007年). 最初由培养中经历复制衰竭的人成纤维细胞表型定义(海弗利克和穆尔哈德，1961年)，衰老可以在多种细胞类型中触发，以应对各种形式的细胞损伤或应激(Campisi和d'Adda di Fagagna，2007年;Serrano等人，1997年). 虽然细胞衰老曾被认为是一种组织培养现象，但最近的研究表明，细胞衰老对肿瘤的发生具有强大的阻碍作用，并有助于某些抗癌药物的细胞毒性(Braig等人，2005年;Chen等人，2005年;Collado等人，2005年;Michalloglou等人，2005年;Schmitt等人，2002年). 有趣的是，在某些老化或受损的组织中也观察到了衰老细胞；然而，细胞衰老对非癌症病理的功能性贡献尚未得到研究。

衰老细胞表现出巨大的扁平形态，并积累衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性，使其区别于大多数静止细胞(Campisi和d'Adda di Fagagna，2007年). 此外，它们经常下调参与增殖和细胞外基质生成的基因，上调炎症细胞因子和其他已知调节微环境或免疫反应的分子(Campisi和d'Adda di Fagagna，2007年;Schnabl等人，2003年). 衰老细胞激活p53和p16/Rb肿瘤抑制通路，这与细胞衰老作为恶性转化屏障的作用是一致的(Campisi和d'Adda di Fagagna，2007年;Collado等人，2007年). p53通过抑制增殖的反式激活基因促进衰老，包括p21/Cip1/Waf1细胞周期素依赖性激酶抑制剂和miR-34类microRNA(He等人，2007年). 相反，第16页墨水4a通过抑制细胞周期素依赖性激酶2和4促进衰老，从而阻止Rb磷酸化，并允许Rb促进抑制异染色质环境，使某些增殖相关基因沉默(成田等人，2003年). 虽然p53和p16/Rb途径并行促进衰老，但它们对程序的相对贡献可能依赖于细胞类型(Campisi和d'Adda di Fagagna，2007年).

虽然衰老细胞在培养中可以无限期存活，但它们在组织中的命运并没有很好的特征。一方面，良性黑色素细胞痣（痣）富含衰老细胞，但也可能终生存在于皮肤中(Michaloglou等人，2005年)这意味着衰老细胞可以稳定地并入组织。另一方面，体内诱导肝癌细胞衰老的细胞可以被先天免疫系统的成分清除，从而导致肿瘤退化(Xue等人，2007年). 因此，在某些情况下，衰老细胞可以在体内翻转。

肝硬化是世界范围内的主要健康问题(巴特勒和布伦纳，2005年)和12第个美国最常见的死因(NCHS，2004年). 肝纤维化是肝硬化的前兆，由肝炎病毒感染、酗酒或非酒精性脂肪性肝炎（NASH，脂肪性肝病）引起的慢性肝损伤触发。肝星状细胞（HSC，也称为伊藤细胞）是导致肝纤维化的关键细胞类型。肝损伤后，HSC被“激活”，即分化为肌成纤维细胞，增殖并产生细胞外基质网络，这是纤维化瘢痕的特征(巴特勒和布伦纳，2005年). 急性损伤后激活的HSC可能支持肝细胞增殖和器官修复(Passno等人，2007年); 然而，在慢性损伤过程中，这些细胞产生的过量细胞外基质会破坏肝脏的细胞结构，最终导致肝硬化和肝衰竭(巴特勒和布伦纳，2005年).

在人类肝硬化患者的肝脏中观察到SA-β-gal阳性细胞(Wiemann等人，2002年)尽管这些假定的衰老细胞的性质及其对肝脏生物学的影响尚不清楚。为了研究细胞衰老在肝硬化中的潜在作用，我们使用了一个成熟的小鼠模型，在该模型中，CCl慢性治疗会产生纤维化4，一种肝脏损伤剂(巴特勒和布伦纳，2005年). 我们检测了CCl后衰老细胞的积累4治疗以及CCl后的命运4撤回。我们还检测了突变株小鼠的肝纤维化过程，其中衰老程序通过禁用p53和/或p16/Rb通路而减弱。出乎意料的是，我们的结果证实，细胞衰老限制了肝损伤后纤维化的程度，并强调了衰老细胞与组织微环境之间的相互作用。

结果

衰老活化的星状细胞在肝硬化中积聚

为了研究纤维化与细胞衰老之间的关系，我们对7–9周龄雌性小鼠进行了为期6周的CCl治疗4，一种广泛用于诱导实验动物纤维化的化学物质(巴特勒和布伦纳，2005年). 通过苏木精-伊红和天狼星红染色评估，该方案产生纤维化，直接标记活化HSC沉积的细胞外基质(图1A). 通过定量激光扫描细胞术评估，大约2%的肝脏呈天狼星红阳性，比未经治疗的对照组增加了3-4倍。此外，CCl4治疗使活化的HSC急剧扩张，通过肝切片的免疫荧光染色观察活化HSC标记物结蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）（数据未显示，另见图2).

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纤维化肝脏中存在衰老细胞

A.CCl4（纤维化）但非溶媒（对照）治疗的肝脏显示纤维化瘢痕（通过H&E和天狼星红染色评估）。瘢痕周围的多个细胞对衰老标记物染色阳性（SA-β-gal和p16染色）。B.瘢痕周围的细胞也共同表达衰老标记物p21、p53和Hmga1，与增殖的Ki67阳性细胞不同。左下角的数字表示p21阳性细胞（绿色）中双阳性细胞（黄色）的数量。比例尺为50μm。

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衰老细胞来源于活化的HSC

A.通过p53和Hmga1阳性染色鉴定的衰老细胞表达活化的HSC标记物Desmin和αSMA。上面板：同一细胞中的Hmga1阳性细胞核（红色箭头）和Desmin细胞质染色（绿色箭头）。下面板：相同细胞中p53阳性细胞核（绿色箭头）和αSMA（红色箭头）细胞质染色。B.衰老细胞，经SA-β-gal染色鉴定，HSC标记物αSMA在小鼠纤维化肝脏的连续切片上呈阳性。C.衰老细胞，通过p21或p16染色在人类纤维化肝脏的连续切片上HSC标记物αSMA阳性进行鉴定。正常肝切片中无p21和p16阳性细胞。

鉴定衰老细胞就地，我们对CCl的肝脏切片进行了染色4和车辆处理（对照）小鼠，以获取一组与衰老相关的标记，包括SA-β-gal和与衰老程序有因果关系的蛋白质，如p16、p21、p53和Hmga1(Collado等人，2007年;成田等人，2006年;Serrano等人，1997年). SA-β-gal和每个衰老相关蛋白染色阳性的细胞积聚在纤维化肝脏中，并且总是沿着纤维化瘢痕分布(图1). 这些细胞典型地表达多种衰老标记，并且没有增殖（只有p21、p53和Hmga1细胞核染色的细胞被认为是阳性的）。例如，在纤维化肝脏中发现的p21阳性细胞中，87%的p53免疫染色阳性，90%的Hmga1染色阳性(图1B)尽管Ki-67阳性细胞的频率普遍增加，但只有8%的细胞共同表达增殖相关标记Ki-67(图1B). 值得注意的是，这些衰老标记物在对照肝脏中没有表达(图1B，数据未显示）。此外，用DDC（3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢可待因）治疗的小鼠的肝脏中也积累了衰老细胞，DDC是另一种导致肝纤维化和肝硬化的药物（数据未显示）。

虽然肝细胞是肝脏中最丰富的细胞类型，但衰老细胞在人类肝纤维化瘢痕中的位置(Wiemann等人，2002年)、和鼠标(图1B)肝脏增加了这些细胞来源于活化的HSC的可能性，HSC最初在肝损伤后增殖，并在纤维化过程中产生大量细胞外基质。因此，在小鼠纤维化肝切片中，衰老相关标记物p53和Hmga1染色阳性的细胞HSC标记物desmin和αSMA也阳性，在连续切片中，大多数SA-β-gal阳性细胞也表达αSMA(图2B). 同样，在从人类肝硬化获得的连续切片中，表达衰老标记物p21和p16的细胞与表达αSMA的细胞共定位(图2C). 因此，衰老激活的HSC积聚在纤维化肝脏中。

纤维化的进展受到完整的衰老机制的限制

肝星状细胞最初增殖是为了应对肝损伤，因此它们的衰老如何最终影响纤维化的进展尚不清楚。因为p53导致大多数小鼠组织中的细胞衰老(Collado等人，2007年)，来自小鼠的细胞缺乏第53页通常在培养中表现出增强的增殖能力(谢尔，1998). 为了评估衰老对肝纤维化的生物学影响，我们首先比较了野生型和野生型肝脏的组织病理学第53页−/−CCl治疗小鼠4六周后，使用天狼星红染色和Tgfb1型，一种在纤维化进展中上调的主要细胞因子(巴特勒和布伦纳，2005年).

令人惊讶的是，肝脏来源于第53页−/−与野生型对照组相比，小鼠的纤维化组织明显增多(图3A、B，数据未显示，p=0.008），并且还显示Tgfb1型表达式(补充图1). 纤维化的增加与活化HSC的异常扩张有关，通过αSMA表达作为该细胞类型丰度的替代标记进行评估(图3C,补充图1). 相反，肝脏来源于第53页−/−CCl治疗小鼠4显示出更多的增殖细胞(补充图2)与野生型对照组相比，SA-β-gal染色减少(图3A). 这些观察结果表明，在没有第53页肝损伤导致衰老细胞减少，活化的HSC、细胞外基质沉积和纤维化相应增加。

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完整的衰老途径是限制纤维化进展所必需的

A.缺乏老鼠第53页CCl后出现明显纤维化4处理，如天狼星红染色所示。来自wt或第53页−/−CCl治疗小鼠4收获后进行天狼星红和SA-β-半乳糖染色，p16免疫细胞化学和p53免疫荧光分析。根据SA-β-gal活性鉴定，突变肝脏中的衰老细胞较少。B.基于天狼星红染色的纤维化定量。数值为平均值+SE。使用Student t检验将突变动物的纤维化面积与相应时间点的野生型（wt）进行比较（*-p<0.05，**-p<0.01）。C.免疫印迹显示CCl治疗小鼠肝脏中αSMA的表达4。中有更多激活的HSC第53页和INK4a/ARF公司免疫印迹分析显示，活化HSC标记物αSMA的蛋白表达高于野生型。两个上部面板表示αSMA的不同曝光时间。D.在来自wt和DKO小鼠的活化HSC中加入BrdU超过2小时。来自wt和wt的肝脏中的E.SA-β-gal活性和纤维化（由天狼星红评估）第53页−/−;INK4a/ARF型−/−CCl治疗的（DKO）小鼠4.比例尺为100μm。F.如前所述量化纤维化。缺乏这两者的小鼠有更强的纤维化第53页和INK4a/ARF公司G.通过免疫印迹法评估αSMA在野生型和DKO纤维化肝脏中的表达。H.TRE-shp53（Tg）和GFAP-tTA的纤维化；如前所述，对TRE-shp53（DTg）进行量化。I.通过免疫印迹法评估αSMA在Tg和DTg纤维化肝脏中的表达。J.来自CCl治疗小鼠的DTg肝脏中有更多增殖激活的HSC（Ki67和αSMA阳性）4.

在许多细胞类型中，p53和p16/Rb通路都有助于衰老，因此缺乏这两条通路的细胞会保留剩余的衰老反应(Serrano等人，1997年). 事实上，肝脏来源于第53页−/−CCl治疗小鼠4仍显示SA-β-gal阳性细胞有所增加，并保持其上调p16的能力(图3A). 此外，CCl4处理过的肝脏INK4a/ARF型−/−小鼠也仅表现出衰老的部分减少[对应于HSC的增加(图3C)和纤维化（数据未显示）]，p53仍上调（数据未示）。为了确定破坏这两个基因座对肝脏衰老和纤维化的影响，我们制作了第53页−/−;INK4a/ARF公司−/−复合突变小鼠。由于不到5%的雌性双突变体小鼠成年，所以这些实验只使用雄性动物。值得注意的是，雄性小鼠比雌性小鼠发生更严重的纤维化[比较图4B至4C; 另请参见(清水等，2007年)]使同性之间的比较变得至关重要。

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完整的衰老反应促进纤维化的解决

用CCl治疗小鼠4持续6周，在停止治疗后10天和20天收获肝脏。A.纤维组织在第53页−/−在10天和20天的时间点，通过天狼星红染色将肝脏与wt肝脏进行比较。SA-β-半乳糖染色显示，在纤维形成治疗停止后10天和20天，纤维化肝脏出现衰老细胞。纤维化逆转期间，衰老细胞从肝脏中清除。量化wt和第53页−/−（B） ，或wt和第53页−/−;INK4a/ARF公司−/−（DKO）（C），基于肝脏天狼星红染色的小鼠。数值为平均值+SE；使用Student t检验将突变动物的纤维化面积与相应时间点的wt进行比较（*-p<0.05，**-p<0.01，***-p<0.001）。

与预测的后果一致第53页和INK4a/ARF公司双基因敲除肝脏中分离的HSC在培养中没有衰老，与野生型细胞相比，SA-β-gal活性低得多，BrdU掺入多，野生型细胞在几代后衰老(图3D;补充图3; 数据未显示）。CCl衍生的生命4缺少这两者的老鼠第53页和INK4a/ARF公司与野生型动物相比，出现了严重的纤维化，纤维化面积增加了50%以上，纤维化瘢痕变宽，瘢痕分支明显增多(图3E、F). 此外，双突变肝脏中含有少量SA-β-gal阳性细胞(图3E)根据αSMA蛋白的测定，活化的HSC大量增加(图3G)mRNA表达（数据未显示，与对照组相比为35倍，p=0.02）。双基因敲除动物也出现了清晰可见的腹水，这是肝硬化的临床表现之一，与对照组相比，导致腹部明显变宽(补充图4，p=0.006）。因此，活化的HSC缺乏第53页和INK4a/ARF公司基因（以及ARF/p53和p16/Rb通路）不能衰老，并在慢性肝损伤时不适当地扩张，导致更多的细胞外基质生成和纤维化。

为了证实上述表型是活化HSC衰老受损而非其他肝细胞类型所致，我们特异性抑制了HSC中p53的表达，并检测了CCL后肝纤维化和活化HSC增殖的程度4治疗。携带四环素反应元件（TRE）驱动的短链RNA（shRNA）的转基因小鼠能够有效抑制p53表达(Dickins等人，2007年)与携带GFAP启动子表达的tTA（四环素控制的反式激活因子）转基因小鼠杂交(Wang等人，2004年)在肝脏中是HSC特异性的(巴特勒和布伦纳，2005年;Zhuo等人，2001年). 由于tTA反式激活子结合TRE启动子缺席对于四环素，双转基因小鼠（DTg）应组成性表达p53 shRNA，事实证明是这样的(补充图5). 与p53缺失动物的观察结果一致，p53在HSC中被特异性抑制的双转基因小鼠发生的纤维化明显多于对照组(图3Hp=0.0009）；此外，免疫荧光研究表明，他们的肝脏中含有更多增殖的HSC（Ki-67和αSMA阳性）(图3I，J). 显然，活化星状细胞的衰老限制了纤维化的进展。

细胞衰老促进纤维化的逆转

虽然肝硬化伴随的结构改变被认为是不可逆的，但现在很明显，即使是在更晚期的患者中，纤维化也可以在疾病触发因素消除后退化(巴特勒和布伦纳，2005年). 因此，野生型动物的肝纤维化在停止CCl后10天内消失4治疗后20天几乎无法检测到(图4A). 随着纤维化的逆转，野生型肝脏中衰老细胞的频率下降，HSC的数量也下降，因此在治疗后20天的肝脏中未检测到SA-β-gal阳性细胞，α-SMA的数量显著下降。与之形成鲜明对比的是，激活的HSC在来自第53页−/−治疗后20天的小鼠，这与纤维化逆转受损相关(图4A、B，p=0.014，p=0.006，治疗后10天或20天）。甚至更多的纤维化病变和活化的HSC被保留在第53页−/−;INK4a/ARF公司−/−此时点的老鼠(图4C,补充图6).

与缺乏p53时纤维化组织清除受损一致，肝脏来源于第53页−/−CCl后动物TGFβ和αSMA水平明显升高4与对照组相比，停药意味着他们保持了更大的纤维生成信号和更活跃的HSC(补充图1).第53页−/−与野生型对照组相比，肝脏还保留了更多的增殖（Ki67阳性）细胞(补充图2)表明p53缺乏激活的HSC可以绕过衰老反应，继续增殖并在瘢痕中沉积细胞外基质。因此，我们假设衰老限制活化HSC的增殖，并促进其从肝脏中清除。

衰老激活的造血干细胞上调免疫调节剂的表达

作为定义活化的星状细胞如何经历衰老并从组织中清除的第一步，我们比较了培养的原代人类活化HSC的转录谱，这些HSC通过DNA损伤剂足叶乙甙治疗而增殖或触发衰老。与IMR-90正常二倍体成纤维细胞（一种衰老已被广泛研究的细胞类型）一样，活化的HSC在依托泊苷治疗的几天内停止增殖，积累SA-β-gal活性，并获得衰老相关的异色灶，但保留了活化的HSC标记物αSMA、GFAP和波形蛋白(图5A). 因此，根据几个标准，依托泊甙处理的活化HSC会衰老。

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衰老激活的HSC下调细胞外基质的生成并上调调节免疫监视的基因

A.用DNA损伤剂足叶乙甙（衰老）处理过的活化HSC和完整增殖细胞（生长）通过免疫荧光染色（绿色）对SA-β-gal活性和HSC标记物（αSMA、GFAP、Vimentin）的表达进行染色，并用DAPI（蓝色）进行复染。插图：DAPI染色的细胞核DNA高倍放大显示衰老细胞中存在异色病灶。箭头指向插图中显示的细胞核。B.定量RT-PCR分析显示衰老激活HSC中细胞外基质成分的表达降低。C.细胞外基质降解基质金属蛋白酶在衰老激活的HSC中上调。值表示来自微阵列的重复样本的平均值。D.定量RT-PCR分析显示，与生长细胞相比，衰老激活的HSC和IMR-90细胞中细胞因子、粘附分子和NK细胞受体配体的表达增加。

使用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays对两种不同活化的HSC制剂进行基因表达谱分析，并使用基因本体（GO）分析差异表达的基因，以确定以无偏见的方式改变的生物过程和途径。与伴随衰老的增殖停滞相一致，在下调基因中，“生物过程”一词表达最显著的是“细胞周期”(补充表1，p=1.72E-21），并包括细胞周期进展所需的基因，如CDKN3型，CyclinB(CCNB1、CCNB2),CDC20型和E2F靶基因CDC2(CDC2（CDC2）)，CyclinA2(CCNA2型)和胸苷激酶(TK1型). 编码细胞外基质成分的基因在下调基因中也显著过度表达，包括与“细胞外基质”（细胞成分术语）和“细胞外矩阵结构成分”（分子功能术语）相关的基因（分别为p=3.44E-6和p=1.75E-6）。有趣的是，I型、III型、IV型胶原蛋白和纤维结合蛋白是纤维化瘢痕的成分(巴特勒和布伦纳，2005年)这些基因中的大多数在我们的微阵列上被下调(补充图7)和定量RT-PCR分析(图5B). 这些观察结果表明，衰老程序限制了活化HSC的增殖和成纤维潜能。

衰老的人成纤维细胞也显示出一种基因表达模式，涉及分泌蛋白酶、蛋白酶调节剂、生长因子和细胞因子的上调，通常被称为“衰老相关分泌表型”(Campisi和d'Adda di Fagagna，2007年). 同样，衰老激活的HSC上调具有纤溶活性的基质金属蛋白酶(图5C). 此外，这些细胞上调了与“细胞外区域”和“细胞因子活性”相关的基因（分别为p=4.18E-12，p=1.98E-10）。上调基因中最显著的过度表达生物过程术语是“免疫反应”（p=2.84E-10），因此，上调基因中唯一的过度表达KEGG途径是“细胞因子-细胞因子受体相互作用”（p=6.24E-4，补充表1,补充图8).

衰老激活的HSC中许多基因上调，编码细胞因子或受体，增强自然杀伤（NK）细胞功能。例如通过RT-QPCR证实，MICA公司NK细胞受体NKG2D的配体在衰老激活的HSC以及通过复制衰竭、致癌Ras表达或足叶乙甙治疗触发衰老的IMR-90细胞中上调(图5D). 此外，细胞因子IL8号机组，NKG2D受体配体ULBP2型和粘附分子CD58型（介导NK靶细胞相互作用），在衰老激活的HSC和IMR-90细胞中也上调(图5D). 因此，衰老激活的HSC上调了预测增强免疫监视的基因。

在纤维化肝脏中发现免疫细胞与衰老细胞接近

上述数据增加了衰老可能通过下调细胞外基质生成、上调细胞外基质降解酶和刺激活化HSC的免疫清除来限制肝纤维化的可能性。NK细胞是先天免疫系统的主要组成部分，可识别肿瘤、病毒和MHC不匹配骨髓移植物(Raulet和Vance，2006年). 这些细胞可以直接裂解靶细胞，并影响包括T细胞在内的适应性免疫系统成分的杀伤(Raulet和Vance，2006年). 肝硬化期间，NK细胞和其他免疫细胞类型迁移到纤维化瘢痕中，形成炎症环境(巴特勒和布伦纳，2005年;Muhanna等人，2007年). 因此，我们通过流式细胞术观察到各种免疫细胞在纤维化肝脏中的积聚（数据未显示）。利用电子显微镜通过形态学特征和基于免疫荧光的免疫表型鉴定细胞，我们观察到CCl纤维化肝组织中活化的淋巴细胞（包括NK细胞）、巨噬细胞和HSC附近的中性粒细胞4治疗小鼠，但非正常对照(图6A). 这些免疫细胞通常与表达衰老标记物p53、p21和Hmga1的细胞非常接近(图6B). 这些数据，再加上我们的表达分析，增加了衰老细胞产生信号吸引免疫细胞进入纤维化病变的可能性。

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免疫细胞识别衰老细胞

A.免疫细胞与激活的HSC相邻体内通过电子显微镜对正常和纤维化小鼠肝脏进行鉴定。免疫细胞（lp-淋巴细胞、mφ-巨噬细胞、np-中性粒细胞）位于活化的HSC附近。比例尺为5μm。B.由CD45R（CD45）识别的免疫细胞与小鼠纤维化肝脏中的衰老细胞（由p21、p53和Hmga1识别）非常接近。C、 D.免疫细胞可以识别衰老在体外。在NK细胞（未着色）与生长（C）或衰老（D）IMR-90（假彩色，绿色）细胞相互作用开始（0）和10小时后，同一区域的延时显微镜图像。原始图像和时间点显示在补充图4.比例尺为100μm。E、 F.人类NK细胞系YT具有优先的细胞毒性在体外与生长细胞相比，衰老激活的HSC（E）或衰老的IMR-90细胞（F）。在IMR-90细胞中，衰老是由DNA损伤、培养中的广泛传代或致癌感染引起的ras（拉斯维加斯）V12版本使用未感染和空载体感染的生长细胞作为对照。至少进行了三项独立的重复实验。显示了基于OD595结晶紫定量的细胞毒性，**-p<0.005使用Student t检验。

衰老星形细胞被NK细胞选择性靶向

我们之前发现，体内清除衰老肿瘤细胞需要NK细胞(Xue等人，2007年). 由于发现衰老活化的HSC和IMR-90细胞表达NK细胞识别所需的所有成分，我们测试了它们是否能被NK细胞选择性杀死在体外和体内在最初的实验中，我们使用IMR-90细胞，因为它们很容易获得。我们将生长和衰老的IMR-90细胞和NK细胞以1:10的靶细胞：效应细胞比率共同培养，并通过延时显微镜监测细胞活力，并在12小时时进行量化。作为NK细胞的来源，我们使用了YT系，该系具有NK细胞免疫表型和识别能力(Drexler和Matsuo，2000年).

与生长细胞相比，衰老的IMR-90细胞对NK细胞介导的杀伤更为敏感。因此，在这些共培养条件下，生长细胞不会受到YT细胞的攻击，并且仍然附着在培养皿上(图6C,补充图9,补充电影1). 相反，衰老细胞容易吸引YT细胞，然后发生凋亡并从培养皿表面脱落(图6D,补充图9,补充电影2).

接下来，我们通过定量检测YT细胞是否对衰老激活的HSC表现出细胞毒活性在体外细胞毒性试验。在这些研究中，用足叶乙甙处理激活的人HSC，使其衰老，并与足叶乙苷、复制衰竭或致癌引起的IMR-90细胞进行比较ras（拉斯维加斯）(Narita等人，2003年;Serrano等人，1997年). 根据12小时时细胞群的结晶紫染色评估，衰老细胞对NK介导的杀伤更敏感(图6E、F激活HSC的p=0.0007，依托泊苷、复制衰竭或致癌的p=0.002，p=0.0008，p=0.001ras（拉斯维加斯）诱导细胞）。尽管这种选择性效应可以在较高的NK细胞浓度下被克服（数据未显示），但这些细胞可以在体外优先攻击衰老细胞。

为了确定NK细胞是否能在体内靶向衰老细胞及其对肝纤维化的影响，我们评估了调节NK细胞功能如何影响衰老活化HSC的频率以及在六周CCl疗程后小鼠肝脏纤维化的消退4或在停止治疗后的不同时间。为了耗尽NK细胞，我们用中和抗体[抗AsialoGM1(Radaeva等人，2006年;Xue等人，2007年)]CCl后的期间4撤回。相反，为了增强免疫反应，我们用聚肌苷多囊酰酸（polyI:C）治疗小鼠，它可以诱导干扰素-γ并增强肝脏中NK细胞的活性(Radaeva等人，2006年).

NK细胞活性对衰老细胞的清除和纤维化的消退有显著影响。因此，与盐水或同种型IgG处理的对照相比，用抗NK抗体处理的小鼠的肝脏保留了许多衰老细胞，并表现出明显更多的纤维化(图7A–C; 数据未显示）。相反，与对照组相比，用polyI:C治疗10或20天的小鼠肝脏的衰老细胞和纤维化组织更少。这些变化与激活的HSC数量相关，因为抗NK抗体治疗后αSMA mRNA和蛋白水平增加，而polyI:C治疗后降低(图7D、E). 因此，免疫系统可以有效地清除纤维化组织中的衰老细胞，从而有助于纤维化的解决。

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NK细胞参与纤维化逆转和衰老细胞清除体内

A.用CCl治疗的野生型小鼠4在肝脏收获前，用抗NK抗体（耗尽NK细胞）、polyI:C（作为干扰素-γ激活剂）或生理盐水（作为对照）治疗10或20天。肝切片SA-β-gal染色显示，在小鼠抗NK抗体治疗后NK细胞耗竭后，阳性细胞仍保留在纤维化肝脏中。相反，用polyI:C处理可提高衰老细胞的清除率。B.与生理盐水或polyI:C处理的小鼠相比，天狼星红染色显示NK细胞耗竭后，纤维组织保留，而生理盐水或聚I:C治疗的小鼠耗竭效率更高。C.用生理盐水、抗NK抗体或PolyI:C治疗10或20天后，根据天狼星红染色定量纤维化。数值为平均值+SE。使用Student t检验，将抗NK或PolyI:C处理动物的纤维化面积与相应时间点的生理盐水处理动物进行比较（*-p<0.05，**-p<0.01）。D、 E.经抗NK抗体治疗10天后，纤维化肝脏中αSMA的表达与生理盐水治疗相比增加，而经定量RT-PCR分析（D）和免疫印迹（E）评估，经polyI:C治疗的小鼠中αSMA的表达降低。

讨论

纤维化是创伤愈合反应的一部分，在灾难性组织损伤后维持器官完整性，但也可能导致各种人类疾病，包括肝硬化(巴特勒和布伦纳，2005年). 在这项研究中，我们在CCl的纤维化肝脏中鉴定了衰老细胞4治疗后的小鼠，并显示这些细胞来源于活化的星状细胞，星状细胞是一种对肝细胞死亡最初增殖的细胞类型，负责细胞外基质的生成，而细胞外基质是纤维化瘢痕的标志。令人惊讶的是，我们发现活化的HSC的衰老限制了慢性肝损伤后纤维化组织的积聚，并有助于消除损伤剂后的纤维化。因此，我们证明了细胞衰老的作用是限制对组织损伤的纤维化反应，从而为衰老程序在癌症以外的病理生理环境中发挥作用。

肝硬化涉及肝脏所有细胞成分的急剧变化，与肝细胞死亡、库普弗细胞和HSC的激活以及炎症细胞的侵袭有关(巴特勒和布伦纳，2005年). 以前的报道已经在肝硬化中发现了SA-β-半乳糖阳性细胞，并提示这些细胞可能来自受损的肝细胞。然而，衰老细胞的免疫类型及其沿纤维化瘢痕的位置强烈表明，这些细胞中的大多数来自衰老激活的HSC。此外，增加或减少肝脏中衰老细胞数量的治疗对活化的HSC积累和纤维化具有相反的作用，缺乏关键衰老调节因子的小鼠肝脏显示出HSC的异常扩张和增强的纤维化反应。然而，我们的数据并没有排除在肝病后期肝脏中可能存在衰老肝细胞的可能性。

为什么激活的HSC最终会衰老尚待确定。而端粒缩短是培养人细胞复制性衰老的驱动力(Campisi和d'Adda di Fagagna，2007年)小鼠细胞的端粒较长，在我们六周的治疗期内，端粒可能无法缩短到足以引发衰老。相比之下，在小鼠和人类细胞中由促细胞致癌基因诱导的衰老背景下，也描述了类似的增殖和衰老现象(Lin等人，1998年). 在某些情况下，衰老是由过度活跃的Akt信号介导的(Chen等人，2005年)事实上，我们在纤维化小鼠肝脏中的活化HSC或培养中老化的HSC中检测到磷酸化（活性）AKT(补充图10). 尽管相关，但这些结果与活化HSC的衰老可能是由触发其初始扩张的过度增殖信号引起的这一可能性一致。

我们已经证明，活化的HSC的衰老提供了一个限制肝纤维化的屏障。细胞衰老的标志是其稳定的细胞周期阻滞，事实上，我们表明，在培养的HSC中，这一过程可以被急性触发，并与许多细胞周期调节基因的下调有关。毫无疑问，体内激活的HSC的细胞周期阻滞通过限制产生纤维化瘢痕的细胞类型的扩张，阻止了对损伤的纤维化反应。

除了阻止增殖外，衰老细胞——包括此处研究的活化HSC——也可以在其分泌特性上显示出巨大的变化。例如，衰老细胞下调编码细胞外基质成分的基因，上调细胞外基质降解酶（例如基质金属蛋白酶），尽管尚未考虑这些影响的生物学后果。此外，衰老细胞通常会上调过多的基因，以刺激免疫监视。我们认为，这些变化以协调的方式有助于抑制纤维化——一方面通过限制成纤维蛋白的分泌和降解存在的蛋白，另一方面通过信号传递扩大的活化HSC群体的免疫清除(补充图11). 因此，衰老代表一种体内平衡机制，使组织恢复到其预先受损的状态。这种方案可能与其他伤口愈合反应广泛相关。

衰老激活的HSC的免疫清除机制来自自然杀伤细胞的细胞毒性作用，尽管其他免疫成分也起作用。因此，NK细胞功能拮抗剂延迟衰老细胞的清除和纤维化的解决，而刺激NK细胞活化的药物则具有相反的效果。有趣的是，之前的一份报告表明，NK细胞可能以纤维化肝脏中活化HSC的部分为靶点(Radaeva等人，2006年)尽管此次袭击的信号尚不清楚。虽然我们不能排除自发凋亡或其他细胞死亡模式有助于清除活化的HSC的可能性体内，我们的研究表明，通过激活免疫监视因子，衰老细胞向免疫系统自我识别，从而有效清除衰老细胞，这一过程可以重述在体外虽然详细的机制尚待确定，但我们发现衰老激活的HSC具有明显更高的MICA表达，MICA是NK细胞受体NKG2D的配体。值得注意的是，Rae家族蛋白，即小鼠体内的NKG2D配体，在DNA损伤时被上调(Gasser等人，2005年)，这也是细胞衰老的诱因(Bartkova等人，2006年;Di Micco等人，2006年;Mallette等人，2007年).

我们先前研究表明，小鼠肝癌中内源性p53的激活可在体内诱导衰老和肿瘤退化(Xue等人，2007年). 肿瘤消退与炎症细胞因子和免疫细胞粘附分子的上调有关，先天免疫系统的几个成分有助于清除衰老细胞。衰老激活的HSC可以通过类似机制作为靶点的证明进一步强调了这样一个事实，即至少在某些情况下，衰老细胞可以在体内翻转以解决组织病理学问题。然而，并非所有衰老细胞都可能成为免疫系统的目标。例如，在良性黑色素细胞痣的情况下，衰老细胞在衰老组织中的积聚可能部分与免疫系统功能随着年龄的增长而下降有关。有趣的是，正如在这里研究的小鼠模型中观察到的那样，临床数据表明免疫抑制患者更迅速地发展为肝硬化(Berenguer等人，2000年)而免疫刺激疗法具有保护作用(Rehermann和Nascimbeni，2005年). 我们的研究表明，提高衰老细胞清除率的免疫刺激疗法应用于肝纤维化患者的潜在治疗，尤其是在早期或短期接触肝毒性药物后。

我们认为，在组织损伤后，HSC被激活并强烈增殖，衰老，并最终被清除，以保护肝脏免受急性损伤的过度纤维化反应。然而，为了应对慢性组织损伤，例如由病毒性肝炎或脂肪肝疾病引起的慢性组织损伤，连续几轮的肝细胞死亡和HSC增殖使衰老细胞的产生速度超过其清除速度，导致持续的炎症和纤维化。这种状态虽然最初有益，但最终可能会触发受损肝细胞的异常增殖和转化，从而导致癌症。事实上，混合实验表明，衰老的成纤维细胞可以促进癌前上皮细胞的转化体内(Krtolica等人，2001年). 这种模型为肝硬化如何诱发肝细胞癌提供了一种解释，并可能与发生纤维化的其他环境有关。

实验程序

动物

基因分型方案第53页−/−,INK4a/Arf公司−/−和TRE-shp53小鼠(Dickins等人，2007年;Schmitt等人，2002年). GFAP-tTA小鼠取自Jackson实验室。野生型，第53页−/−,INK4a/Arf公司−/−和第53页−/−;INK4a/Arf公司−/−小鼠每周接受两次连续12次腹腔注射1ml/kg CCl4诱导肝纤维化。GFAP-tTA；对TRE-shp53小鼠进行2周的类似治疗。最后一次注射后48–72小时处死动物，并将其肝脏用于进一步分析。为了改变NK细胞功能，每周对小鼠进行三次静脉注射抗Asialo-GM1抗体（25μl溶于200μl生理盐水，美国弗吉尼亚州瓦科市），持续10或20天，或静脉注射polyI:C（美国西格玛）1mg/kg。冷泉港实验动物护理和使用委员会批准了本工作中描述的所有程序。

组织学分析

石蜡包埋组织切片用苏木精-伊红染色进行常规检查，或用天狼星红染色以显示纤维化沉积。用激光扫描细胞仪（CompuCyte，MA）对每只动物的至少3个完整切片进行扫描，以进行纤维化定量。使用NIH ImageJ软件对这些图像进行量化(网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/). 我们计算了患病动物的纤维化组织数量，与正常肝脏中天狼星红染色的基本数量相对。

如前所述检测SA-β-gal活性(Serrano等人，1997年)小鼠组织pH=5.5，人类细胞pH=6.0。用0.5%戊二醛在PBS中固定冷冻的肝组织切片或贴壁细胞15分钟，用添加1mM MgCl的PBS清洗2并在含有1 mM MgCl的PBS中染色5-6小时2每1mg/ml X-Gal和5mM铁氰化钾和亚铁氰化钠。切片用曙红复染。

如前所述进行免疫染色(Xue等人，2007年). 使用了以下抗体：Ki67（德国Dianova）、p21（美国BD Pharmingen）、αSMA（丹麦DakoCytomation）、p16、p53、Desmin和GFAP（均来自美国圣克鲁斯）。用HMGA1蛋白中与氨基酸79至94相对应的肽免疫家兔，产生抗-HMGA1抗体，发现其与HMGA1反应（且与HMGA2无交叉反应）(成田等人，2006年). AlexaFluor缀合的第二抗体用于信号检测。

电子显微镜

将小鼠肝脏样品固定、脱水并包埋在Epon-Araldite中（美国宾夕法尼亚州电子显微镜科学）。切片在日立H7000T透射电子显微镜中进行对比和成像。

组织培养

在标准条件下培养人IMR-90成纤维细胞（ATCC）和原代人肝肌纤维细胞（活化HSC）（Dominion Pharmakine，西班牙）(成田等人，2003年). 长期培养、足叶乙甙（100μM，Sigma，USA）治疗或感染致癌的IMR-90细胞可诱导衰老ras（拉斯维加斯）V12版本如所述(成田等人，2003年). 对于在体外细胞毒性试验，将生长或衰老细胞以50000个细胞/孔的速度放置在6孔板中。5×105随后将YT细胞（来自德国DSMZ）添加到目标细胞中。将平板在正常条件下培养12小时，然后使用剩余贴壁细胞的结晶紫染色或随后使用配备37°C培养箱罩和6.3%CO的蔡司AxioObserver显微镜来测定NK细胞的细胞毒性2封面。

免疫印迹法

使用组织匀浆器在Laemmli缓冲液中溶解肝组织。在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离等量的蛋白质，并转移到PVDF膜上。使用抗αSMA（丹麦DakoCytomation）、抗βActin（美国西格玛AC-15）进行检测。

表达阵列分析和定量RT-PCR

如前所述进行RNA制备、cDNA合成和定量PCR(Xue等人，2007年). Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array用于鉴定HSC中表达的基因。基因本体（GO）(http://www.geneontology.org/)和KEGG途径(网址：http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)使用g:Profiler网络工具对上调和下调基因进行分析(http://biit.cs.ut.ee/gprofiler网站/).

补充材料

01

单击此处查看。（2.9M，文档）

02

单击此处查看。（870万avi）

03

单击此处查看。（540万美元）

致谢

我们感谢M.Spector对手稿的深刻建议和批判性阅读与编辑；G.P.Amarante-Mendes提供试剂和建议；M.J.Bahr阅读手稿；M.McCurrach提供编辑建议；Lowe实验室成员鼓励讨论；E.Hernando和L.Chiriboga代表IHC；K.Diggins、L.Bianco和CSHL动物设施帮助动物；P.Moody和CSHL流式细胞术设备，帮助进行激光扫描细胞术。这项工作得到了白血病和淋巴瘤学会（V.K.）博士后奖学金的支持，并获得了美国国立卫生研究院（S.W.L.）AG16379的资助。M.Y.由国家科学技术发展委员会（CNPq）的博士研究金资助。L.Z.是Seligson临床研究员，并得到德国研究基金会（Emmy Noether计划，ZE-545/2-1和卓越集群“重生”）的支持。S.W.L.是霍华德·休斯医学研究所的研究员。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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