用蛋白质组学评估RNA-Seq和微阵列的准确性

用阵列和测序法测量mRNA

我们首先确定是否可以重现由微阵列和其他研究中报告的RNA-Seq测量的mRNA表达估计值之间的一致性。为此，我们使用这两种方法收集了两个独立小脑样本的mRNA表达数据，每个样本都包含来自5名成人个体的混合mRNA（方法）。两个池之间没有共享任何个人。使用Affymetrix Human Exon 1.0 ST阵列，我们在第一个和第二个合并样本中分别发现8717和6444个mRNA表达高于检测阈值的基因（方法）。在这些基因中，绝大多数（6424）在两个样本中都表达。此外，两个样本中的基因表达值高度相关（Person相关性，第页= 0.95,第页<2.2e-16）（参见附加文件1：图S1）。对于RNA-Seq，我们对两个混合样本中的每一个样本进行了两次测序，总共得到了5067363个序列读取，可以映射到人类基因组（方法）。在该数据集中，21541个带注释的已知蛋白编码基因（Ensembl版本49）中有13582个由至少两个独立序列表示，5724个由至少20个（方法）表示。虽然四个测序实验中的序列总数不同（参见附加文件1：表S2），通过序列覆盖率估计的基因表达水平显示出生物和技术复制之间的高度正相关（参见附加文件1：图S2）。因此，与先前发表的研究一致，基因表达测量在每种方法中显示出相对较小的差异[13,16,17].

与先前的观察结果进一步一致[13,16]，我们发现两种方法估计的基因表达水平之间存在良好的正相关。即，我们观察到Person相关性第页= 0.67 (第页<2.2e-16），这两种技术在两个样本中的至少一个样本中检测到8441个基因的mRNA表达高于背景（图​（图1A1安培和​和1C）。1摄氏度). 当单独考虑两个样本时，相关性的强度相似(第页=0.66（两个样品），图​图1C1摄氏度和其他文件1：表S3）。此外，相关性的强度并不很大程度上取决于序列覆盖率和阵列检测截止值，也不取决于所使用的相关性测试的类型（参见附加文件1：图S3和表S3）。

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图1

Affymetrix微阵列测量的mRNA表达水平与RNA-Seq之间的相关性mRNA表达水平通过RNA-Seq在5个人的两个混合样本中测量，以及通过微阵列在相同样本（A）或5个独立个体样本（B）中测量。所示为8441和4758个基因的表达水平，分别在给定实验中的至少一个微阵列上的背景以上表达，并由RNA-Seq中的至少两个独立序列读取表示（有关详细信息，请参见方法）。（C和D）人员相关系数(第页)通过分别基于每个微阵列的RNA-Seq和微阵列测量值之间的比较，以及分别针对两个集合样本和5个个体样本的所有可能微阵列组合的平均表达（参见附加文件1：详见表S3）。

接下来，为了测试样本之间的生物变异是否会显著降低相关性强度，我们将两个样本集合中由RNA-Seq测定的表达水平与从不同个体获得的微阵列数据进行了比较。为此，我们使用了使用Affymetrix外显子阵列在5个个体成年人类小脑样本中获得的表达测量值，其中没有一个包含在两个合并样本中（参见附加文件1：表S1）。使用这些数据，我们发现微阵列和RNA-Seq表达测量值之间的相关性仅略微降低，这两种测量值都是5个人的平均表达（Person相关性第页= 0.61,第页<2.2e-16）和每个单独测量（图​（图1B1B年和​和1D）。1天). 一般来说，由于所有5个样本的个体测量值高度相关，因此组合任何数量的个体都不会影响结果（图​（图1D1天和其他文件1：表S3）。因此，成人小脑样本之间的个体差异对微阵列和RNA-Seq测量之间的相关性没有太大影响。

RNA制备和cDNA合成

根据制造商的说明，使用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）提取总RNA，并使用无RNase DNase I（Ambion，Austin，TX）在37°C下处理30分钟。根据制造商的说明，使用RNeasy MinElute试剂盒纯化不含DNA-free的总RNA（加利福尼亚州巴伦西亚齐根市）。在合成cDNA之前，用两轮RiboMinus试剂盒（Invitrogen）处理10 ug总RNA，以完全去除核糖体RNA。

对于第一条cDNA合成，将2 ug rRNA-减少的总RNA与500 ng随机引物混合物混合，在70°C下培养5分钟，然后转移到冰浴中。根据标准方案进行第一链cDNA合成。具体而言，在含有400 U Superscript II逆转录酶、75 mM Tris Hcl、pH7.5、100 mM KCl、5 mM MgCl2、0.01 M DTT和20 mM dNTPs（Invitrogen）的反应混合物中，总体积为25 ul；将该反应混合物在42°C下培养60分钟。在含有20 mM dNTPs、15 U大肠杆菌DNA聚合酶I和2 U大肠杆菌RNase H的反应混合物中，使用产生的第一链cDNA制备第二链cDNA，总体积为100 ul；将该反应混合物在16°C下培养2小时。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化得到的双链cDNA。然后使用雾化技术对样品进行碎片化，得到大小为100–300 bps的碎片。

Illumina测序的文库准备

Illumina图书馆是根据制造商的说明准备的[29]具体而言，使用Qiaquick DNA纯化试剂盒（Qiagen）纯化文库。在存在2.5mM dNTP（NEB）和10mM ATP（Illumina，San Diego，CA）的情况下，用末端修复酶对尺寸选择的cDNA进行钝端。在1 mM dATP（NEB）存在下，通过37°C孵育30分钟，将带有Klenow片段（3'至5'外显子）的腺嘌呤核苷酸添加到钝端cDNA的3'端。用Qiaquick DNA纯化柱（Qiagen）纯化末端标记的双链cDNA。在室温下使用T4 DNA连接酶将末端带有A核苷酸的双链cDNA与适配器（Illumina）连接15分钟。然后用Qiaquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）对样品进行纯化。随后，用两个适配引物（Illumina）扩增cDNA，初始变性步骤为98°C 30秒，然后在98°C下进行14次循环30秒，65°C下30秒，72°C下30s，最后在72°C延长循环5分钟。PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒纯化。根据制造商的说明，提取100–300 bp的产品，并使用Illumina的Solexa测序器直接用于聚类生成和测序分析。所有序列均可在http://www.picb.ac.cn/Comparative/data.html.

序列映射

为了将产生的36核苷酸长测序读数映射到人类基因，我们使用SOAP算法将所有读数与整个基因组（hg18）和从Ensembl数据库下载的所有转录物对齐[30]. 我们在每个对齐中最多允许两个不匹配。放弃了具有多个“最佳命中”位置的读取。我们将基因表达水平计算为其亚型上对应的读取数的中位数除以基因长度。

微阵列处理和分析

根据标准基因芯片制备Affymetrix人类外显子1.0 ST阵列的mRNA样本^®全转录（WT）感官目标标记分析（见手册，P/N 701880）[28]. 在进行表达数据分析之前，我们屏蔽了所有与参考人类基因组不完全匹配（hg18）且未映射到唯一位置的探针[31]. 为了确定给定探针的信号强度是否高于预期的背景噪声水平，我们将每个探针的信号密度与具有相同GC含量的抗原探针的信号浓度分布进行了比较。抗原探针由Affymetrix专门设计，用于评估非特异性背景杂交[32]. 如果探针信号的强度大于具有相同GC含量的背景探针的95%，则将其归类为背景以上检测[33]. 如果检测到80%以上的探针，并且每个转录本至少检测到10个探针，则转录信号被分类为检测到每个个体。为了进一步消除阵列之间任何可能的系统实验差异，我们进行了PM-GCBG校正[32]使用R包“affy”进行分位数归一化[34]. 在归一化之前，所有强度都进行了基-二次对数变换。通过中值抛光法总结转录本的强度。我们使用了Transcript Cluster Annotations文件[28]将Affymetrix注释的转录簇映射到Ensemble基因。在多个转录簇映射到同一基因的情况下，我们将基因表达计算为所有相应转录簇的中位数。没有任何转录簇重叠。所有原始微阵列数据保存在GEO数据库[GSE13744]中。

蛋白质样品制备

如其他地方所述，从100 mg冷冻小脑组织样品中提取蛋白质[35,36]稍作修改。即，将每个组织样品切碎，在冰镇PBS中清洗，并使用电均质器在冰镇裂解缓冲液（8 M尿素、4%CHAPS、65 mM DTT、40 mM Tris、鸡尾酒蛋白酶抑制剂、200 mg组织/1 ml）中均质。将所得蛋白质溶液在冰上超声共3分钟，然后在25000 g下在4°C下离心1小时，以去除DNA、RNA和细胞碎片。使用5倍体积的沉淀溶液（乙醇：丙酮：乙酸，体积比50:50:0.1）在4°C下沉淀蛋白质上清液过夜，然后进行离心。将沉淀溶解在变性缓冲液（6M盐酸胍，100mM Tris，鸡尾酒蛋白酶抑制剂，pH 8.3）中，并通过Bradford测定法测定蛋白质浓度。

蛋白质消化按其他说明进行[37]. 简单地说，用DTT（100μg/1μl 1 M DTT）处理每个样品中的600μg蛋白质，用IAA（100μg/kl 1 M IAA）烷基化，并用消化缓冲液（50 mM碳酸氢铵）超滤。所得蛋白溶液在37°C下与胰蛋白酶（酶：蛋白质质量比1:40）孵育过夜，然后超滤和冷冻干燥。然后将冷冻的蛋白质样品溶解在负载缓冲液中，用于LC-MS/MS分析。

2D LC-MS/MS分析和肽鉴定

肽分馏和分析在pH连续在线梯度（pCOG）2D LC-MS/MS系统中进行，如别处所述[38]稍作修改。简言之，将肽溶液装入SCX（强阳离子交换）柱（320μm×100 mm柱技术公司，美国加利福尼亚州），洗脱得到11个组分。然后使用pH连续梯度缓冲液将这些组分中的每一组分加载到两个RP（反相）替代捕集柱（320 mm、620 mm、C18、5 mm，柱技术）上。使用以下RP梯度洗脱肽组分：2至40%流动相（0.1%甲酸（v/v）乙腈），120 min，200μ分流前L/min流量和1.5μ拆分后L/分钟。在数据相关采集模型中，对配备金属针电喷雾界面质谱仪（ThermoFinnigan，San Jose，CA，USA）的LTQ质谱仪进行分析（每次完整扫描，然后对最强烈的离子进行十次MS/MS扫描）。使用的所有其他参数均按中所述进行设置[39].

通过使用BioWorks™3.2软件套件中的SEQUEST程序搜索人类肽组合数据库（IPI人类v3.22）及其反向版本，对肽进行鉴定。允许3.0 Da的质量耐受性和一个缺失的胰蛋白酶裂解位点。半胱氨酸羧氨基甲酰化被设置为静态修饰，未检查其他修饰。所有输出结果都通过内部软件BuildSummary过滤并整合到蛋白质中。当错误发现率（FDR）小于0.5%时，所有通过某一Xcorr和delta CN的匹配都被视为有效。此外，所有可分配给多种蛋白质的肽均被去除。使用Biomart将所有蛋白质ID映射到Ensemble基因ID[40]. 对于每个基因，我们将蛋白质表达水平计算为对应于该基因的任何亚型的所有肽的中位数拷贝数。