为了了解运动诱导疲劳反应的分子基础，我们研究了遗传定义的小鼠模型。我们设计了一个集成体内对清醒小鼠进行测试，让小鼠进行短暂的低速跑步机运动，然后在户外活动室中进行测试（见方法）。我们首先评估了两种营养不良小鼠系——中密度纤维板（杜氏肌营养不良（DMD）模型）4和Sgca公司-null（缺乏α-肌多糖的2D型边缘肌营养不良模型(Sgca公司))5在没有之前的运动的情况下，这些小鼠的活动与野生型小鼠的活动没有区别(补充视频S1a-d,). 在一次轻度运动试验后，观察到显著差异(补充视频S2a-d,)–中密度纤维板和Sgca公司-空白小鼠的垂直活动明显减少。
在营养不良和非营养不良小鼠模型中，轻度运动后，肌膜放大的nNOS丢失导致骨骼肌血管狭窄、毛细血管灌注减少和过度疲劳反应一代表C57BL/10和中密度纤维板小鼠运动前和运动后的区域地图垂直活动轨迹。b条，C57BL/10、C57BL/6运动前后的定量垂直活动，中密度纤维板和Sgca公司-无小鼠菌株（每个菌株n=6）。c（c），根据C57BL/6（n=6）测量EDL肌肉比力，中密度纤维板（n=4），以及Sgca公司-null（n=4）只小鼠。d日未经治疗（n=7）和抗炎治疗者运动前后的垂直活动中密度纤维板小鼠，急性（n=4）或慢性（n=4）服用去甲唑考特或急性服用布洛芬（n=5）。星号表示统计意义。e（电子），量化运动前后微肌营养不良蛋白的垂直活动/中密度纤维板小鼠（n=6）及其中密度纤维板室友（n=4）。插图显示C57BL/6腓肠肌中nNOS检测和微营养素的代表性免疫荧光图像/中密度纤维板老鼠。（f）MCKεSG运动前后的定量垂直活动/Sgca公司-null小鼠（n=6）及其Sgca公司-空窝友（n=6）。插图显示了对匀浆（hom）和粗制骨骼肌膜（cm）中总nNOS的免疫印迹检测。克，MCKεSG骨骼肌血管的代表性Microfil®图像/Sgca公司-运动后的空白小鼠-大箭头标记血管狭窄的延伸区域，小箭头标记桡动脉狭窄的较短延伸。
垂直活动下降中密度纤维板和Sgca公司-与运动前C57BL/6小鼠的EDL比力测量值相比，空白小鼠与EDL比力测量值的差异无关(). 此外，Sgca公司-空白小鼠不会出现大脑、心脏或血管病变6和具有与对照小鼠相似的肌肉力量值7因此，无论是心脏缺陷还是无法产生力量都不是运动后不活动的原因Sgca公司-使鼠标无效。因为炎症是肌营养不良蛋白病的一个特征4，慢性疲劳与肌肉疼痛有关，慢性疼痛与疲劳有关8，我们治疗了中密度纤维板使用deflazacort或布洛芬的小鼠。然而，这两种治疗都没有改善运动后活动()表明轻度运动后立即出现的不活动中密度纤维板小鼠不是因为炎症或疼痛。总的来说，我们的运动活性测试结果表明，这些小鼠的过度疲劳反应并不是由于心脏缺陷、肌肉力量不足、炎症或疼痛所致。
测试运动是否导致中密度纤维板和Sgca公司-无效小鼠是由于肌肉的遗传决定的结构缺陷所致，我们分析了两种与特定肌营养不良蛋白糖蛋白复合物（DGC）缺陷相关的肌肉病理学得到修复的小鼠模型-微肌营养不良/中密度纤维板和MCKεSG/Sgca公司-空。微肌营养不良蛋白/中密度纤维板小鼠（轻度Becker MD模型9-DGC有一个突变但功能性肌营养不良蛋白），微肌营养不良素表达于中密度纤维板小鼠肌肉。在MCKεSG中/Sgca公司-空小鼠，ε-肌聚糖在缺乏Sgca公司(补充图S1). 两株救援菌株均未表现出肌营养不良的病理特征，两株的骨骼肌DGC在生化、结构和功能水平上均已恢复(9,10和补充图S1、S2).
尽管有结构完整的骨骼肌DGC，微肌营养不良蛋白/中密度纤维板小白鼠在轻度运动后活动量显著下降中密度纤维板室友(). Becker MD患者在轻度劳累后表现出极度疲劳11，肌膜放大型nNOS的缺失可作为某些类型Becker MD的诊断指标12，运动后不活动的一个可能原因是失去了肌膜大小的nNOS。为了测试这种可能性，我们探索了微肌营养不良蛋白中nNOS的定位/中密度纤维板骨骼肌，并发现在该救援菌株中产生的DGC未能将nNOS募集到肌膜(，插图）。这些数据与最近关于肌营养不良蛋白缺乏小鼠模型中微肌营养不良素表达的报道一致13此外，数据表明，运动会导致微营养素缺乏活性/中密度纤维板小鼠并非直接由结构缺陷的肌肉DGC引起，肌膜nNOS的丢失不会对肌肉收缩力产生负面影响。因此，肌膜nNOS似乎在运动后活动水平上发挥作用。
与微营养不良蛋白相比/中密度纤维板小鼠，MCKεSG/Sgca公司-空白小鼠大脑和血管系统中的DGC结构完整，但表达ε-肌多糖而不是Sgca公司肌肉DGC中。我们的运动活性测试表明，MCKεSG的运动后活性/Sgca公司-与C57BL/6小鼠相比，空白小鼠显著减少，但与Sgca公司-null和中密度纤维板老鼠(). 由于含有微肌营养不良蛋白的DGC未能招募nNOS，我们推测MCKεSG/Sgca公司-空白小鼠也无法将nNOS定位于肌膜。事实上，尽管MCKεSG肌肉匀浆中的总nNOS水平/Sgca公司-无效小鼠与野生型水平相似，来自救援模型的nNOS未能与膜制剂中含有DGC的ε-肌聚糖共同纯化(，插图）。总之，这些结果与夸大的疲劳反应是一致的，这种疲劳反应不是与结构缺陷的肌肉DGC或肌肉无力直接相关，而是与nNOS的肌膜定位失败有关。
由于肌膜定位的nNOS对维持收缩肌肉的血管调节至关重要14，我们通过灌注MCKεSG来测试轻度运动后骨骼肌与局部血液供应的通信是否不足/Sgca公司-使用Microfil®在运动前后消除小鼠动脉，并检查骨骼肌血管(). 在运动后的样本中，我们发现了沿着动脉的不同长度的血管狭窄，这些动脉只供养骨骼肌，并且还注意到毛细血管缺乏灌注。这个中密度纤维板和微营养不良蛋白/中密度纤维板同样，小鼠只在运动后出现骨骼肌血管狭窄，毛细血管灌注不足(补充图S3c和数据未显示）。这种表型与局部血管收缩诱导的肌肉nNOS信号无效一致。总的来说，这些数据表明，肌膜定量nNOS的丢失会导致骨骼肌运动诱导的血管调节不足，并导致运动后长时间不活动。
为了直接检查eNOS或nNOS产生的NO对过度疲劳反应的贡献，我们测试了两者无操作系统-和电子NOS-在我们的运动活性测试中，小鼠无效。nNOS缺乏的小鼠在肌膜上表达正常水平的DGC成分，肌肉组织学正常15-17。报告表明，这两种小鼠菌株的血管调节都有缺陷18,19; 然而，中密度纤维板和无操作系统-null小鼠对运动有正常的α肾上腺素能血管收缩反应20垂直运动前活动与电子NOS-无效，无操作系统-null和C57BL/6小鼠，表明任一NOS的丢失都不会影响小鼠的活动(). 然而，运动后，无操作系统-零垂直活动显著下降(). 每名运动员运动前后的血清CK水平网络操作系统-空白小鼠与C57BL/6小鼠相似，与中密度纤维板老鼠()，并且在无操作系统-无效股四头肌断面(补充图S4b)这表明肌肉损伤和坏死不是运动后不活动的原因。然后我们测试运动后肌肉收缩力是否影响C57BL/6和无操作系统-在轻度运动后使骨骼肌失去功能以产生力量。我们发现运动后EDL肌肉的比力在无操作系统-与C57BL/6肌肉相比，无肌肉(补充图S4c). 由于缺乏肌肉收缩力并不是导致无操作系统-在运动后使小鼠无效，我们检查是否网络操作系统-无效小鼠运动后骨骼肌血管狭窄，缺乏毛细血管灌注，与营养不良和救援小鼠相似。Microfil®动脉灌注网络操作系统-运动前和运动后的小鼠动脉空白表明缺乏毛细血管灌注，并且只有运动后才出现血管狭窄无S-null骨骼肌(). 我们还发现，用nNOS特异性抑制剂3-溴-7-硝基吲哚唑或血管收缩剂sarafotoxin 6c治疗野生型小鼠会导致运动后不活动(). 这些发现表明，肌膜定量nNOS缺乏会导致运动后供养活动肌肉的血管系统收缩，从而促进轻度运动后长时间不活动。
增强肌肉nNOS激活产生的cGMP信号可减少轻度运动时过度的疲劳反应一，C57BL/6运动后垂直运动的比较，电子NOS-和无操作系统-无小鼠（n=6只）。b条，C57BL/6（n=6）运动前后的血清肌酸激酶水平，电子NOS-空（n＝4），以及无操作系统-null（n=6）小鼠，与中密度纤维板（n=6）。c、，的代表性Microfil®图像无操作系统-运动后无股四头肌骨骼肌动脉-大箭头表示血管狭窄的扩大区域，小箭头表示桡动脉狭窄的较短区域。d日未经治疗的野生型（C57BL/6和C57BL/10）小鼠（n=4）运动前和运动后的垂直活动，与3-B-7-Ni治疗的野生类型小鼠（n=3）和sarafotoxin治疗的野生型号小鼠（n=4）进行比较。e（电子），量化运动前后活动+/-PDE5A抑制剂治疗，in无操作系统-零（n=4），MCKεSG/Sgc公司a-null（n=4），以及中密度纤维板小鼠（n=6）。运动前和运动后垂直活动误差条为标准偏差，比例尺=100μm，星号表示统计显著性。
为了测试血管对运动后活动的影响是否来自NO或NO信号下游，我们绕过了肌膜nNOS信号，通过治疗来减少血管收缩中密度纤维板使用一组促进血管舒张的药物的小鼠；我们发现，过度疲劳反应只有通过磷酸二酯酶（PDE）5A抑制剂治疗才能缓解(补充图S6)这表明我们所看到的疲劳取决于cGMP，它作用于NO生成的下游。有趣的是，PDE活动中密度纤维板小鼠比C57BL/10小鼠高2-6倍21与人类肌肉疾病中PDE活性升高相一致18,21,22.我们治疗了无操作系统-空，MCKεSG/Sgca公司-null，以及中密度纤维板使用PDE5A抑制剂的小鼠，并在我们的运动活性测定中对其进行测试，发现治疗后的MCKεSG/Sgca公司-null和中密度纤维板小鼠运动后活动增加(和补充图S7a-d). 由于PDE5A抑制对运动前的活动没有影响，我们的结果表明，PDE5A抑制通过增强收缩诱导的nNOS刺激产生的cGMP信号来缓解过度的疲劳反应。尽管cGMP的下游效应器众多且各异23，cGMP的半衰期会受到PDE5A活性的影响。我们的数据表明中密度纤维板小鼠提取物可能具有PDE5A活性，在我们测试的救援小鼠模型中，PDE活性也可能升高。
我们的数据表明，运动期间灌注肌膜nNOS缺乏肌肉的小动脉局部阻力增加，轻度运动后缺乏活动将导致肌肉水肿。我们用激光多普勒成像检查运动前后的血流，发现中密度纤维板小鼠没有像C57BL/6小鼠那样增加(和补充图S7a)，但对中密度纤维板服用PDE5A抑制剂的小鼠减轻了这种缺陷()增加肌肉毛细血管灌注(). 鉴于活动肌肉局部血管收缩缓解不足会导致肌肉水肿24患有DMD的男孩表现出肌肉水肿25，我们观察了小鼠后腿肌肉的水分区和动力学变化无操作系统-空，C57BL/10和中密度纤维板小鼠运动前后使用自旋-自旋弛豫时间（T2）-磁共振成像（MRI）。这个无操作系统-null小鼠在运动后没有肌肉损伤或收缩力丧失(和补充图S4b-c)也没有肌肉水肿(补充图S8a)这表明它们缺乏肌肉损伤，从而阻止了组织中的水分积聚。同样，C57BL/10小鼠在运动后几乎没有出现后腿肌肉水肿（0.70%+/-0.50）(和补充图S8b). 然而，后腿肌肉中密度纤维板运动后，小鼠的组织水化持续出现显著变化（25.0%+/-2.45）()这表明运动引起的肌肉水肿。在中密度纤维板肌肉可能是由于小动脉中增加的局部阻力和肌肉纤维的脆弱和损伤共同作用的结果，小动脉为活跃的腿部肌肉提供能量。我们还一致发现，PDE5A抑制剂治疗显著减少了运动性肌肉水肿中密度纤维板小鼠（3.99%+/-0.82）(). 总的来说，我们的数据表明，PDE5A抑制剂治疗可以通过使PDE活性正常化来缓解运动后的不活动，从而使来自肌肉nNOS的可用NO发出活动肌肉中cGMP依赖性血管舒张的信号；PDE5A抑制剂治疗可减少中密度纤维板通过改善小鼠活动肌肉中血管活动的调节，从而防止肌肉水肿加剧肌肉萎缩期间发生的肌肉损伤。
PDE5A抑制剂治疗可改善运动诱导的血管调节，并减少运动诱导的水肿中密度纤维板老鼠一，冠状动脉激光多普勒血流分析的代表性图像中密度纤维板小鼠运动前后（n=3），以及b条,中密度纤维板小鼠运动前后+PDE5A抑制剂治疗（n=3）。c（c），代表性Microfil®图像中密度纤维板+PDE5A抑制剂治疗运动后股四头肌骨骼肌动脉（n=3，比例尺=100μm）。d-e公司，代表性MRI轴向视图：d日,中密度纤维板运动前后（n=5）和e（电子），运动后的后肢肌肉中密度纤维板运动前用PDE5A抑制剂治疗（n＝5）。白色箭头表示水域划分增加的区域。（f）、运动前和运动后肌肉水肿面积百分比和+/-PDE5A抑制剂治疗中密度纤维板小鼠与野生型相比。（野生型和中密度纤维板n=3，中密度纤维板+PDE5A抑制剂n=5，误差条为s.e.m.）
由于60%以上的神经肌肉疾病患者患有严重疲劳2，我们检测了不同肌病患者活检组织中nNOS在肌膜上的定位(,补充图S9和表1). 在大多数评估的肌病活检中，肌膜放大的nNOS要么减少，要么未检测到，这意味着许多肌病疾病可能具有导致严重运动性疲劳的机制。虽然肌肉无力患者不可避免地会出现疲劳增加1，我们的小鼠数据表明，运动诱导的不活动与肌肉无力不同，肌膜放大型nNOS的丢失导致轻度运动的过度疲劳反应。
人类肌肉疾病中nNOS减少各种人类肌肉疾病的代表性免疫荧光染色：在原发性肌营养不良蛋白病中，Duchenne和Becker肌营养不良（分别为DMD和BMD）；多种形式的肢体肌肉营养不良（LGMD）；两例由细胞外基质蛋白突变引起的先天性肌营养不良症（CMD）患者[Ullrich CMD（UCMD），胶原蛋白VI和缺汞CMD（MDC1A），层粘连蛋白2]。星号标记了一些相邻面板中的相同肌肉纤维。（比例尺=100μm）
总之，我们的小鼠数据显示，骨骼肌nNOS减少或定位不当会加剧轻度运动后的疲劳，因为正常收缩诱导的局部血管收缩的cGMP依赖性衰减没有发生，并且这种失败会导致运动后肌肉的血管狭窄。此外，我们的中密度纤维板小鼠数据表明，由于nNOS定位错误和PDE活性增加10,18,21，激活肌肉血管舒张增加的信号传导不足，导致肌肉水肿。这反过来又加剧了肌肉损伤以及运动后的严重虚弱。虽然导致轻度运动后不活动的确切机制尚未简化为单一的开始和结束途径，但我们的数据表明，收缩诱导的cGMP依赖性局部血管收缩减弱在该机制中至关重要。这些发现可能有助于更好地理解肌肉nNOS表达、定位或活动受到影响的其他生理条件下的肌肉疲劳。
