《英国医学杂志》。作者手稿；PMC 2008年7月10日发布。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院43967
中的增益功能突变HIF2A型家族性红细胞增多症的基因
来自北爱尔兰贝尔法斯特市贝尔法斯特市立医院（M.J.P.）和女王大学癌症研究与细胞生物学中心（T.R.J.L.，M.F.M.）；宾夕法尼亚大学医学院，费城（P.W.F.，X.L.，F.S.L.）；和英国曼彻斯特皇家医院。
总结
缺氧诱导因子（HIF）α它有三种亚型，是持续平衡全身氧气供需的关键。高强度聚焦-α是一种调节广泛过程的转录因子，包括红细胞生成、血管生成和细胞代谢。我们描述了一个红细胞增多症家族HIF2A型编码HIF-2的基因α蛋白质。我们的功能研究表明，这种突变导致HIF-2的稳定α蛋白，提示野生型HIF-2α调节成人促红细胞生成素的产生。
氧调节途径的一个广泛认可的例子是促红细胞生成素系统，在该系统中，肾脏感觉减少组织氧合，进而产生促红细胞形成素，从而增加红细胞质量。1调节的研究欧洲专利局基因导致了HIF的发现，HIF由一个不稳定的α亚单位和组成型表达的β亚单位。2在常压条件下α亚单位，由三种亚型HIF-1组成α，HIF-2α和HIF-3α-在两个特定的脯氨酰残基上羟基化。三这种羟基化作用针对HIF-α通过von Hippel–Lindau（VHL）肿瘤抑制蛋白降解。4在缺氧条件下，羟基化被抑制，从而维持稳定的HIF-α蛋白质，它不仅激活欧洲专利局基因，但也有广泛的其他基因，协调适应缺氧。2,5
家族性红细胞增多症为研究氧敏感机制提供了机会。6这种遗传疾病可能是由一种使HIF羟基化的蛋白质发生突变引起的-α（脯氨酰羟化酶结构域蛋白2[PHD2]）7,8或VHL蛋白突变。9,10这些发现提出了HIF是否存在突变的问题-α自身。
参与促红细胞生成素调节的特定HIF亚型一直是深入研究的主题。一些结果指向HIF-1α,11-13但是老鼠Hif-2α（也称为内皮PAS域蛋白1[Epas1]或Hif-1α类因子[Hlf]）被认为是胚胎后小鼠促红细胞生成素的主要调节因子。14-17我们调查了HIF2A型一个红细胞增多症家族的基因，发现一个错义突变，损害HIF-2的羟基化α蛋白质，因此可以维持其稳定构象并诱导红细胞增多。
病例报告
该指数患者为43岁男性，23岁时血红蛋白水平升高（21.7克/分升），红细胞压积升高（64%），白细胞和血小板计数正常(). 通过每年两到三次的静脉注射，红细胞压积保持在55%以下。32岁时，患者的血清促红细胞生成素水平为40.0 mU/ml（正常范围为2.0至20.0），此时血红蛋白水平为18.9 g/dl，红细胞压积为54%。42岁时，出现深静脉血栓形成；因此，随后进行了多次静脉注射，以使他的红细胞压积保持在45%以下。除痛风外，他43岁时身体状况良好。在最近一次检测中（2006年12月），血红蛋白水平为18.6克每毫升，红细胞压积为55%，白细胞计数为6300个每立方米，血小板计数为178000个每立方毫米，血清促红细胞生成素水平为31.1 mU每毫升（正常范围为2.5至10.5 mU每毫米）。
表1
HIF-2家族的发病年龄和血液学值α–相关红细胞增多症。*
| 价值 | 为患者编制索引 | 无动于衷的兄弟 | 母亲 | 父亲 | 外祖母 |
|---|
| 呈现年龄（年） | 23 | — | 35 | — | 54 |
| 血红蛋白（g/dl） | 21.7 | 15.6 | 16.3 | 13.4 | 19.1 |
| 红细胞压积（%） | 64 | 46 | 50 | 39 | 54 |
| 白细胞计数（每毫米三) | 7200 | 6100 | 正常 | 6900 | 6900 |
| 血小板计数（每毫米三) | 226,000 | 193, 000 | 正常 | 183,000 | 106,000 |
| 血清促红细胞生成素（mU/ml）† | 31.1 | 10.9 | 63.3 | 16.2 | 118.6 |
索引患者有红细胞增多症家族史(). 当他的母亲35岁时，她的血红蛋白水平为16.3克每分升，红细胞压积为50%，白细胞和血小板计数正常。红细胞质量升高（每公斤33毫升）。她正在接受定期的静脉切开治疗。最近的检测（2006年12月）显示血红蛋白水平为14.5克每分升，红细胞压积为48%，白细胞计数为7000个每立方毫米，血小板计数为187000个每立方厘米，血清促红细胞生成素水平为63.3 mU每毫升。在最近一次检测前一年，63岁的她患有心肌梗死。
HIF2A型遗传性红细胞增多症家系的基因型及G1609→T突变的鉴定遗传性红细胞增多症和突变体家族的系谱HIF2A型如图A所示。方形代表男性家庭成员，圆圈代表女性家庭成员，实心符号代表红细胞增多症家庭成员；基因型显示在每个符号下面。索引患者用箭头表示。未显示基因型不可用的指数患者的一个未受影响的妹妹，以及指数患者的两个姨妈和两个姨父，他们既没有病史也没有基因型。B组显示第12外显子1599至1621个核苷酸HIF2A。测序时，与野生型序列（底部）相比，在索引患者中检测到1609碱基处的杂合G→T变化（顶部图、星号和箭头）。该指数患者的外祖母也有突变（中间图，箭头）。C组显示了对外周血单个核细胞进行扩增-不耐突变系统（ARMS）-聚合酶链反应（PCR）检测G1609→T突变的结果。含有G或野生型等位基因的样本产生184 bp的PCR产物，而T或突变型等位蛋白为204 bp。受影响的指数患者及其母亲和祖母都有野生型和突变等位基因（分别为2、3和5道）。T等位基因在指标患者未受影响的父亲和兄弟中缺失（分别为第4和第6车道）。通道1包含一个100 bp的DNA大小标记，所有其他通道包含333 bp的PCR控制带。通道7包含G1609→T突变阴性的对照样本。图D列出了缺氧诱导因子（HIF）的氨基酸序列（用单字母符号表示）α残基526至549（人HIF-2α命名法）用于人类、小鼠、鸡、，非洲爪蟾，和斑马鱼，以及来自黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫。阴影表示保守的残基，星号表示羟基受体脯氨酸（HIF-2中的Pro531α)倒置三角形表示人类HIF-2的Gly537α.
患者89岁的外祖母在54岁时出现血红蛋白、红细胞压积和红细胞质量升高（分别为19.1克/分升、54%和35毫升/公斤），白细胞和血小板计数正常。她的骨髓是非细胞的。每年进行两到三次性交，以保持红细胞压积低于50%。除此之外，她的病史仅以高血压和憩室炎著称。自81岁起就不需要性交，因为血红蛋白水平在每分升14.0到15.5克之间，红细胞压积在45%到52%之间。她一直很好。最近的检测（2006年12月）显示血红蛋白水平为14.3克每分升，红细胞压积为46%，白细胞计数为6700个每立方毫米，血小板计数为186000个每立方厘米，血清促红细胞生成素水平为118.6 mU每毫升。
方法
患者
该指数患者来自181名红细胞增多症患者，他们是从英国和爱尔兰的医院转诊过来的。10所有患者的红细胞压积均升高，并且红细胞生成素水平范围广泛。患者不符合英国血液学标准委员会制定的真性红细胞增多症诊断标准。18所有患者在进入研究时均出具了书面知情同意书，该同意书由贝尔法斯特女王大学研究伦理委员会批准，并根据赫尔辛基宣言进行。进入登记处后，患者会定期进行红细胞生成素受体缺陷筛查，19这个VHL（甚高频）基因，9,10,20和第2页基因。7
突变分析HIF2A型
第12外显子HIF2A型用正向引物5′TTGAGCAGCACTGTGAAACA′3、反向引物5’ACATGGCTTGAGGTGATTCC′3和55℃退火温度，通过聚合酶链反应（PCR）从外周血单个核细胞DNA中扩增基因。使用BigDye Terminator试剂盒（Applied Biosytems）对纯化的773-bp PCR产物进行测序。为了鉴定G1609→T突变，使用Ye等人设计的引物设计程序设计了扩增不耐突变系统（ARMS）-PCR引物。21(http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/primer1.html)（序列可根据要求提供）。此外，还通过ARMS-PCR对患者直系亲属外周血单个核细胞的DNA样本和来自英国（人类随机控制DNA小组，欧洲细胞培养物收集）无血缘关系、种族匹配的献血者的200份正常对照样本进行G1609→T突变筛查。
血浆、蛋白质、肽和细胞系
人类HIF-2的编码序列α从基因组及其表达的集成分子分析（IMAGE）联盟克隆6305604（美国型培养物收集）中获得，与N末端3xFlag标签一起亚克隆到质粒pcDNA5/FRT/TO中。使用标准方法，我们构建了含有Gly537→Trp或Pro531→Ala突变的质粒，以及质粒pcDNA3–GAL4–HIF-2α（516–549）有或没有Gly537→Trp突变。肽由GenScript合成。（他的）6标志PHD2和GST–HIF-1α（531–575）种蛋白质是按照前面描述的方法制备的。22使用TNT试剂盒（Promega）制备体外翻译蛋白。根据制造商的说明，使用Flp重组酶（Promega）生成稳定转染的HEK293 Flp-In T-Rex细胞系（Invitrogen），其中pcDNA5/FRT/TO载体整合到单个定义的基因组位点。
分析
如前所述进行结合分析、羟化酶分析、实时PCR和蛋白质印迹。7,22,23小于0.05的P值被认为具有统计学意义。
简单地说，对于结合分析，35S-标记，体外翻译野生型或Gly537→Trp GAL4–HIF-2α（516–549），使用小麦胚芽提取物制备，用或不用2μg of（他的）6标志PHD2.（他的）6用抗Flag抗体对FlagPHD2进行免疫沉淀和洗涤，并评估结合程度。对于竞争实验，GST–HIF-1α通过重组PHD2将预先结合到谷胱甘肽琼脂糖的（531-575）羟基化，我们评估了0.75-nM野生型羟脯氨酸（Hyp）-HIF-2的容量α（527–542）肽或Gly537→Trp-Hyp–HIF-2α（527–542）肽抑制35S-标记的网织红细胞裂解物-将VHL转化为羟基化GST-HIF-1α(531–575).
用于羟化酶分析，野生型HIF-2α（527–542）肽和Gly537→Trp HIF-2α用重组（His）处理（527–542）肽6FlagPHD2或用单独的反应缓冲液模拟处理；多肽在4700蛋白质组分析仪（应用生物系统）上进行基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱分析。
对于Western blotting，HEK293 Flp-In T-Rex细胞系稳定表达诱导野生型Gly537→Trp或Pro531→Ala 3xFlagHIF-2α或亲代细胞系，分别给予或不给予0.1μ每毫升多西环素g，持续16小时。收集细胞，用Western blotting方法检测等量的细胞裂解物，并使用抗Flag或抗–β-微管蛋白抗体。细胞系暴露于体内200缺氧工作站（Ruskin Technologies）的缺氧条件下（1%氧气、5%二氧化碳和94%氮气）。对于实时PCR检测，用1μ每毫升多西环素g，持续16小时。然后从细胞中提取总RNA并逆转录。肾上腺髓质素信使RNA（mRNA）水平(ADM公司)，N-myc下游调控基因1(国家发改委1)和血管内皮生长因子(血管内皮生长因子)在7300型实时PCR机（ABI）上使用实时PCR进行测量。通过ΔΔC进行相对定量吨方法，带有β-肌动蛋白作为内源性调控。使用Primer Express软件3.0版（Applied Biosystems）设计SYBR Green引物。
在另一个实验中，用0.1μ在常压条件下，每毫升添加1克强力霉素16小时。用20μ克每毫升环己酰亚胺最多45分钟，以阻止蛋白质合成。收集细胞，然后用抗病毒抗体进行Western blotting检测等量的裂解物。使用ChemiDoc-It成像系统（UVP）对信号进行量化。
结果
突变分析
基因第12外显子1609碱基处的杂合G→T改变HIF2A型在索引患者中检测到基因(). 这种变化预示着氨基酸537处的色氨酸将取代甘氨酸。我们使用ARMS-PCR分析，在患有红细胞增多症的索引患者的母亲和外祖母以及未受影响的父亲和兄弟姐妹的样本中筛查G1609→T突变。结果表明，该突变与红细胞增多症表型分离(). PCR-直接测序证实了受影响家庭成员中存在G1609→T突变(). 为了检测该突变是否为单核苷酸多态性，采用ARMS-PCR对200份DNA样本进行了对照组筛选；发现突变为阴性（数据未显示）。Gly537在所有已知HIF-2中保守α蛋白质，位于Pro531（HIF-2的主要羟基化位点）附近α)HIF-1中不存在α，在HIF-3中α，或在黑腹果蝇或秀丽隐杆线虫().
结合和羟化酶分析
体外功能测试表明，PHD2（羟基化蛋白）与突变的Gly537→Trp HIF-2结合更弱α（516–549）肽比野生型肽(). 野生型GAL4–HIF-2的平均相对回收率（±SD）α三个重复（以任意单位表示）的（516–549）为100±12，而Gly537→Trp GAL4-HIF-2α（516–549）为12±7（P<0.001）。
Gly537→Trp低氧诱导因子（HIF）2的功能表征α突变体面板A显示了结合分析的结果。输入量占野生型Gly537总量的1%→Trp GAL4–HIF-2α（516–549）与（His）孵育6图B显示了羟化酶分析的结果，包括基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱。未修饰肽的野生型位置为1877 amu，Gly537→Trp的位置为2007 amu，羟基化肽的位置为1893个原子质量单位（野生型）和2023 amu（作为钾加合物）。未处理样品中1893和2023的小峰值（星号）可能代表肽中蛋氨酸的氧化。图C显示了检测野生型或Gly537→Trp HIF-2的能力的实验结果α（527–542）肽与羟基化GST–HIF-1竞争α（531–575）用于VHL结合。输入占这些实验中添加的VHL总量的25%。面板D和F显示了蛋白质印迹的结果。图D显示了野生型和突变型HIF-2的稳态蛋白水平α而面板F显示了使用环己酰亚胺阻止蛋白质合成后的蛋白质水平。面板E显示了实时PCR分析的结果。肾上腺髓质素基因信使RNA转录水平(ADM公司)，N-myc下游调控基因1(国家发改委1)和血管内皮生长因子基因(血管内皮生长因子)使用实时PCR进行测量。显示了三个独立实验的平均值。T形条表示标准偏差。P值用于与强力霉素诱导的野生型HIF-2水平的比较α。在面板F中，对于每个构造，相对恢复被标准化为0分钟的值，第一条通道显示亲本细胞系的结果。Hyp表示羟基脯氨酸和PHD2脯氨酰羟化酶结构域蛋白2。
我们还用野生型或Gly537→Trp HIF-2培养PHD2α（527–542）肽，并使用MALDI-TOF质谱法评估羟基化。我们发现突变型HIF-2的羟基化较少α(). 此外，竞争实验表明VHL与突变体Gly537→Trp HIF-2的脯氨酰羟基化形式结合α（527–542）与野生型对应物相比较弱(). 野生型Hyp–HIF-2的平均抑制程度α（527-542）为92±1.5%，而Gly537→Trp-Hyp–HIF-2α（527-542）为1±31%（P=0.008）。这些数据证明突变影响HIF-2的羟基化αPHD2以及随后对HIF-2的认可α由VHL提供。
WESTERN BLOTTING和实时PCR
我们产生了等基因、稳定转染的HEK293细胞，可以诱导其表达标记的野生型HIF-2α，Gly537→Trp HIF-2α，或Pro531→Ala HIF-2α（作为羟化缺陷对照）。包含编码表位标签的核苷酸序列特异引物的实时PCR显示野生型和Gly537→Trp结构中信使RNA的水平相似（数据未显示）。Western blotting结果显示，在常氧条件下，突变型Gly537→Trp HIF-2的水平α高于野生型蛋白质水平，但没有Pro531→Ala HIF-2高α水平(). 缺氧条件（1%氧气），增加野生型HIF-2的稳态水平α，减少但不消除野生型和Gly537→Trp HIF-2之间的蛋白质水平差异α（未显示数据）。在常氧条件下，与野生型HIF-2的表达相比α，Gly537→Trp HIF-2的表达α诱导来自ADM公司基因国家发改委1基因，以及血管内皮生长因子基因，所有靶点HIF2A型5(). 在转录起始位点上游含有三个人类促红细胞生成素增强子拷贝的转染报告基因中也发现了类似的结果（数据未显示）。用环己酰亚胺处理HEK293细胞以阻止蛋白质合成后，HIF-2的Gly537→Trp突变α降解速度比野生型HIF-2慢α虽然没有Pro531→Ala突变株慢(). 总之，功能分析结果表明Gly537→Trp突变导致HIF-2功能增强α.
讨论
我们的发现证明HIF-2α是调节人类促红细胞生成素水平的转录因子；该结果也支持先前的研究结果，即Hif-2具有相同的作用α在胚胎后小鼠中。14-17我们的数据不排除HIF-1的作用α促红细胞生成素在某些情况下的调节；有证据表明，这种亚型在胚胎发生期间和成人视网膜中的促红细胞生成素生成中起作用。12,13
先前的体外研究表明，在HIF的初级羟基化位点附近，可以耐受范围出乎意料的广泛氨基酸替换-α.22,24我们的研究表明，在生理学背景下，耐受性氨基酸替换的范围可能比预期的要小得多，这为HIF羟基化位点附近氨基酸的保存提供了理论依据-αGly537占据了HIF-2独有的位置α亚型；该突变分离出高度保守的氨基酸序列，至少在HIF-1中是如此α–VHL互动，建立关键联系。4
我们的研究结合以往的研究确定了PHD2–HIF-2α–VHL途径是调节人类促红细胞生成素生产的核心分子机制。有趣的是，在该途径的每一步中，部分而非完全丧失或获得功能足以诱导红细胞增多症表型。红细胞增多症可由PHD2的近单倍体不足引起7,8或编码VHL的低形态等位基因的两个拷贝。9,10在我们研究的家族中，这是由于编码HIF-2的超纯等位基因的一个拷贝所致α总之，这些发现表明，这三种蛋白质中的每一种都对维持适当水平的促红细胞生成素起着关键作用。
在小鼠中，一种肝脏特异性高f2 A获得功能突变和VHL功能丧失都会导致红细胞增多症和肝血管瘤，15,25提高我们研究的患者可能具有冯·希佩尔-林道综合征的特征的可能性。然而，这些患者没有肾细胞癌、嗜铬细胞瘤或中枢神经系统血管母细胞瘤病史，这是von Hippel-Lindau综合征的特征。这可能是由于VHL的HIF独立功能造成的。这也可能是因为本案例代表HIF-2的部分增益，而非完全增益α功能，如Gly537→Trp突变体与Pro531→Ala突变体的活性所示()从而使人类结果和动物结果的比较复杂化。尽管我们在患者中观察到的特异性红细胞增多表型表明红细胞生成素基因是HIF-2α–针对成年人的特定靶点，我们必须承认HIF-2具有更广泛谱的证据α靶基因。5
致谢
部分资金由美国国立卫生研究院（R01 C090261，Lee博士）提供。
李博士报告说，他获得了葛兰素史克公司的资助。未报告与本文相关的其他潜在利益冲突。
我们用HIF2A型变异，V.Sen博士允许接触一名患者，宾夕法尼亚大学蛋白质组学核心设施的C.-X.Yuan博士和C.Busch女士执行质谱分析，以及所有将英国和爱尔兰的红细胞增多症患者转介至我们的注册处并提供样本的临床医生。
工具书类
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