抗原特异性T细胞无能的诱导：肿瘤进展过程中的早期事件

摘要

在识别免疫系统T细胞臂识别的肿瘤细胞表达的抗原方面取得了重大进展(1). 这些发现导致了肿瘤抗原特异性疫苗策略的发展，其中一些疫苗目前正在接受临床评估，作为转移癌患者的治疗方法。尽管对癌细胞优先表达的抗原具有特异性的T细胞的存在是产生抗肿瘤免疫反应的先决条件，但对此类细胞在肿瘤进展过程中的命运知之甚少。由于大多数癌症疫苗策略目前都被视为对现有肿瘤负担的治疗而非预防，抗原特异性T细胞与肿瘤相互作用的后果是可能影响这种治疗方法疗效的关键参数。

在大多数肿瘤疫苗的小鼠模型中，当非荷瘤动物首先免疫，然后一段时间后进行肿瘤攻击时，比在肿瘤建立后进行免疫时，可以拒绝更大的肿瘤负荷。在后一种情况下，将从肿瘤激发到接种疫苗的间隔时间延长几天，往往会导致观察到的抗肿瘤免疫反应的效力大大降低。无瘤疫苗受体与含瘤疫苗受体产生的不一致的抗肿瘤免疫反应已被解释为多种因素，如小鼠模型中肿瘤生长的快速动力学、肿瘤诱导抑制性T细胞的生成(2,三)、肿瘤宿主T细胞信号转导的改变(4–9)、肿瘤诱导T细胞凋亡(10)以及对肿瘤抗原的外周耐受性的发展(11).

我们希望研究在肿瘤进展过程中识别肿瘤细胞表达的抗原的T细胞的命运。我们设计了一个系统，在该系统中，可识别的原始CD4群体⁺监测具有特定特异性的T细胞体内在肿瘤进展过程中，通过基因工程表达其抗原。该系统以图形方式证明，抗原特异性T细胞在暴露于荷瘤宿主中的标称抗原后不久，在表型和功能上发生显著变化，导致抗原特异性无反应状态。这些变化发生在肿瘤进展的早期，明显先于更广泛的免疫抑制的发生，而这种免疫抑制通常伴随着晚期肿瘤负担。这些结果表明，T细胞对肿瘤抗原的无能可能对治疗性肿瘤疫苗策略造成重大障碍。

材料和方法

结果

A20是一种BALB/c淋巴瘤，表达高水平的主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类分子以及低水平的T细胞共刺激分子CD80（B7-1）和CD86（B7-2）（图。​（图11一). 它能够提供外源性和内源性抗原，并被广泛用于在体外抗原加工的研究(14). 当静脉注射BALB/c小鼠时，该肿瘤浸润肠系膜淋巴结、脾脏和肝脏，并且可以在骨髓和外周血中发现。因此，它的行为类似体内多种形式的人类B细胞淋巴瘤。与上述模型一样，当肿瘤挑战后5天内发生免疫[用辐射的粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）分泌的A20细胞]时，可以拒绝适度的全身肿瘤负担，但到9天时，免疫接种无效(13).

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图1

A20野生型和A20HA的特征在体外和肿瘤生长动力学体内. (一)流式细胞术分析A20细胞上CD80（B7-1）和CD86（B7-2）的表达。(B类)抗HA/I-E对A20HA的识别^d日TCR转基因T细胞在体外从荷瘤小鼠体内移植A20HA，通过机械分离和尼龙网传代制备单细胞悬液。移植的A20HA细胞（•），传代的A20HA细胞在体外（□），或传代的A20野生型细胞在体外（▴）用10000厘格雷照射，并将其与2×10一起按指示的细胞数镀在96周的微量滴定板上⁵新分离的抗-HA/I-E^d日每孔TCR转基因脾细胞。成立[^三H] 培养三天后测定胸腺嘧啶核苷。(C类)BALB/c小鼠静脉注射1×10⁶在第0天检查A20WT（□）或A20HA（•）肿瘤细胞，每周检查两次肿瘤的发展情况。每组10只小鼠。(D类)静脉注射1×10后9天⁶A20WT或A20HA肿瘤细胞，BALB/c小鼠接受2.5×10⁶CD4细胞⁺针对HA/I-E的TCR转基因T细胞^d日如上所述对小鼠进行检查，并在肿瘤明显时对其实施安乐死。

使用过继转移的TCR转基因小鼠T细胞(15)，我们跟踪了对模型抗原流感病毒HA的免疫反应，该抗原由A20细胞表达或在重组痘苗病毒感染的情况下表达。转染A20细胞表达HA，并选择一种稳定的转染剂，该转染剂表达极低水平的HA。虽然A20HA的HA表达水平低于流式细胞术检测的限值，但CD4⁺I-E限制的HA氨基酸110–120特异性TCR转基因小鼠T细胞^d日(12)与A20HA孵育时增殖旺盛在体外（图。​（图11B类). 尽管如此，HA的表达并没有明显改变A20HA的免疫原性，因为静脉注射带有A20野生型或A20HA基因的BALB/c小鼠导致了具有类似动力学的肿瘤进展（图。​（图11C类). 有趣的是，抗HA/I-E的过继转移不影响肿瘤生长动力学^d日-转基因T细胞（图。​（图11D类)肿瘤激发9天后给予。根据我们之前的观察结果，选择了九天，即在此间隔后，A20不能通过治疗性接种治愈。在随后的实验中，转基因T细胞的转移发生在肿瘤细胞之前或与肿瘤细胞同时进行，得到了类似的结果（数据未显示）。A20HA的生长并没有伴随HA表达的丧失，因为从肿瘤外植体获得的A20HA细胞刺激了抗HA/I-E^d日-与A20HA传代相同的转基因T细胞在体外（图。​（图11B类).

抗-HA/I-E^d日将转基因T细胞过继性转移到无瘤BALB/c小鼠，或已建立A20野生型或A20HA肿瘤的小鼠，以及CD4的百分比⁺T细胞移植后，每周检测一次表达克隆型TCR的脾细胞。T细胞转移后6天的克隆型频率分析显示，相对于携带A20野生型或无肿瘤的小鼠，携带A20HA的小鼠中克隆型阳性T细胞的初始扩增（图。​（图22一). 第一周后，该百分比下降，到T细胞转移后20天（当肝脏和脾脏中可见3-5毫米淋巴瘤结节时），携带A20HA的小鼠中克隆型阳性细胞的百分比接近其他组的基线水平（图。​（图22B类). 尽管A20HA荷瘤小鼠的克隆型阳性T细胞百分比在初始扩增后下降，但从未观察到其完全消除，即使在以后的时间点面对广泛的肿瘤负担。

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图2

克隆型阳性T细胞转移到荷瘤小鼠后的变化。BALB/c小鼠静脉注射1×10⁶A20WT或A20HA肿瘤细胞。9天后，所有小鼠，包括一组未受肿瘤攻击的小鼠，接受2.5×10的剂量⁶抗-HA/I-E^d日TCR公司⁺静脉注射转基因T细胞，在过继转移T细胞后+6、+13和+20天，每组处死4只小鼠。对用FITC-偶联山羊抗小鼠CD4和生物素化大鼠抗克隆型TCR抗体（mAb 6.5）染色的纯化脾T细胞进行流式细胞术分析，然后用PE-偶联链霉亲和素染色。对于每个样本，收集了100000个选通事件。(一)T细胞移植6天后获得的脾细胞的代表性双色FACS分析。(B类)CD4百分比的变化⁺抗HA TCR⁺T细胞移植后T细胞随时间变化。数值表示四只小鼠表达克隆型TCR的细胞百分比的平均值±SE。背景染色小于0.05%。(C类)体外克隆型增殖反应⁺CD4细胞⁺用HA 110–120肽刺激T细胞。纯化T细胞（4×10⁴每孔）一与新鲜脾细胞（8×10）混合⁴每孔）添加HA肽（12.5μg/ml）的幼年BALB/c小鼠。^三孵育3天后分析H掺入量，显示为cpm，从中减去单独培养基的值。数值代表每组四只小鼠每孔克隆型T细胞的平均数（±SE）cpm/绝对数。

克隆型阳性CD4的三色流式细胞术分析⁺进行T细胞以确定在携带A20HA的小鼠中是否发生与抗原识别相关的表型变化（图。​（图3）。三). 与非肿瘤荷瘤小鼠相比，A20HA荷瘤小鼠的HA特异性转基因T细胞上观察到CD44表达增加，CD45RB和CD62L表达减少，尽管在一些荷A20野生型肿瘤的小鼠中也观察到中间变化。

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图3

CD4抗原识别相关的表型变化⁺TCR克隆类型⁺过继性转移到荷瘤小鼠体内的T细胞。BALB/c小鼠静脉注射1×10⁶A20WT或A20HA肿瘤细胞。9天后，所有小鼠接受2.5×10⁶抗-HA/I-E^d日变速箱控制⁺静脉注射转基因T细胞转移后15天，从非肿瘤小鼠（带图案的条）、带A20WT（带图案条）或A20HA（实心条）的小鼠分离T细胞，如图所示。​图22用Cy-Chrome标记的抗小鼠CD4、生物素化抗TCR克隆型mAb 6.5染色，然后用PE-标记的链霉亲和素和FITC-结合的抗小鼠CD44、抗小鼠CD45RB或抗小鼠CD62L染色⁺设置T细胞，每个样本收集100000个事件。CD4表达的每个激活标记的平均荧光强度+SE⁺TCR克隆类型⁺T细胞（每组四只小鼠）。

尽管HA-特异性CD4的初始扩增⁺携带A20HA小鼠的T细胞和原始表型的丢失，该组的T细胞对HA肽的增殖反应减弱在体外（图。​（图22C类). 在携带HA-特异性T细胞的A20HA小鼠中，这种迟钝的反应早在移植HA-特异的T细胞后6天就已明显表现出来，并且在实验期间一直受损。相比之下，在T细胞转移后至少22天内，来自A20野生型肿瘤负担相当的小鼠的转基因T细胞对非肿瘤小鼠的反应相当，即使在这个晚期点存在肉眼可见的肿瘤结节浸润脾脏和肝脏。

与抗原由A20HA细胞表达时HA特异性T细胞的反应性降低相反，在病毒感染的情况下暴露于HA可增强T细胞的响应性。在T细胞转移后，用编码流感病毒HA（vacc-HA）的重组痘苗病毒构建物以不同的时间间隔免疫小鼠（图。​（图4）。4). 免疫接种导致非肿瘤小鼠中克隆型阳性T细胞显著扩增（图。​（图44一). 携带A20野生型肿瘤的小鼠对vacc-HA的反应与非肿瘤小鼠相同，即使在肿瘤进展的后期进行免疫接种。如前所述，未经免疫接种的携带A20HA的小鼠在T细胞转移8天后，克隆型阳性T细胞的百分比增加，随后在稍后的时间点，该百分比下降至其他组的基线水平。引人注目的是，用vacc-HA免疫携带A20HA的小鼠未能导致HA特异性T细胞的克隆扩增。这种对vacc-HA的反应受损并不是由于通过循环抗-HA抗体早期清除重组病毒，因为在携带A20HA的小鼠血清中检测不到此类抗体（数据未显示）。

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图4

HA特异性T细胞对体内在携带A20HA而非A20WT肿瘤的小鼠中启动。给BALB/c小鼠1×10⁶静脉注射A20WT或A20HA肿瘤细胞。9天后，所有小鼠，包括一组未受肿瘤攻击的小鼠，接受2.5×10⁶抗-HA/I-E^d日TCR公司⁺转基因T细胞。每组半数小鼠接种1×10⁷T细胞转移后第2、9或16天皮下注射vacc-HA的pfu，并在免疫后第6天（第8、15或22天）处死进行分析。未免疫的对照组接受0.1 ml HBSS皮下注射(一)通过双色流式细胞术染色分析来自未免疫（固体棒）和vacc-HA-免疫动物（图案棒）的纯化T细胞的CD4与抗-HA TCR克隆型，如图所示。​图2。2值表示表达克隆型TCR的T细胞百分比的平均值+SE。T细胞用单独培养基或HA肽（12.5μg/ml）加新鲜BALB/c脾细胞培养。48小时后，收集上清液并检测γ-干扰素(B类)和IL-2(C类)ELISA（研发系统）。值是每组四只动物的三份培养物的平均值+SE。数据表示为每100个克隆型阳性细胞产生的细胞因子数量。仅在培养基中培养的T细胞的数值小于刺激T细胞数值的10%。(D类)来自免疫动物与未免疫动物的克隆型阳性T细胞的HA特异性增殖反应。数值表示T细胞的平均增殖，从中减去单独培养基的数值。每组分析四只小鼠。

用vacc-HA激发的T细胞体内释放γ-干扰素在体外用HA肽培养（图。​（图44B类). 这种反应在携带野生型A20的小鼠中保持不变，但在携带A20HA的小鼠中显著受损，即使在T细胞转移后2天开始接种vacc-HA，并在6天后进行检测。在任何组中均未观察到可检测到IL-4释放（数据未显示）。尽管与HA肽孵育可导致可测量的IL-2释放，即使没有体内用vacc-HA启动后，这种反应在携带A20HA的小鼠中也会减弱（图。​（图44C类). 最后，在非肿瘤荷瘤小鼠和A20野生型肿瘤荷瘤鼠中，通过vacc-HA启动，HA肽的增殖反应增强，但在A20HA荷瘤小鼠中没有增强（图。​（图44D类). 虽然未接种A20HA的小鼠的整体增殖反应与未接种非肿瘤或A20野生型小鼠的增殖反应相当，但在每个细胞的基础上，这种反应再次减弱，如图所示。​图22C类（未显示数据）。

我们希望进一步证实A20HA诱导的T细胞无反应性对HA是特异性的，并不仅仅反映肿瘤诱导的整体免疫抑制。用vacc-HA激发非肿瘤小鼠或A20HA小鼠，并检测脾细胞对HA肽或感染野生型痘苗的BALB/c脾细胞表达的痘苗抗原的增殖反应在体外（表​（表1）。1). 虽然A20HA荷瘤小鼠对HA肽的T细胞增殖反应再次减弱，但这些小鼠对痘苗抗原的增殖反应与接种vacc-HA的非肿瘤荷瘤小鼠相当。此外，两组对pan-T细胞有丝分裂原Con A的反应相似，表明T细胞储备的其他元素功能完整。有趣的是，携带A20HA的小鼠的转基因T细胞对HA肽的增殖反应在外源性IL-2的存在下部分恢复，这与在在体外T细胞无能模型(16).

讨论

这些发现表明，抗原特异性T细胞无反应性的诱导可能发生在肿瘤与T细胞相互作用的早期，并明显先于更广泛的免疫抑制状态的发展。许多研究支持这样的假设，即肿瘤通过诱导全局免疫抑制状态来逃避免疫排斥。这种状态在患有晚期肿瘤负担的动物或患者身上得到了明确的证明，其特征是对常见召回抗原的挑战反应性低体内，和T细胞功能减弱在体外与T细胞信号转导途径的特定改变相关(4–9). 介导这些变化的一个或多个因素尚未确定，但在很大比例的T细胞池中发现了这些变化，影响了广泛的抗原特异性。虽然这种形式的免疫抑制可能会对晚期恶性肿瘤的疫苗效力产生重大影响，但尚不清楚这些变化能否解释早期事件，这些事件限制了疫苗产生抗肿瘤免疫的反应。

另一种解释是，在既定的肿瘤负担环境中，疫苗反应受损，肿瘤抗原特异性T细胞在遇到抗原时会产生耐受性体内静止T细胞的完全激活不仅需要TCR与适当的肽/MHC复合物结合所提供的抗原特异性信号，还需要由特异性抗原呈递细胞（APC）提供的第二个“共刺激”信号。第二个信号的一个来源是活化的APC表达的B7-1（CD80）和B7-2（CD86）使CD28与T细胞结合。在缺乏共刺激信号的情况下，T细胞与CR的结合会导致T细胞无法发挥完整的效应器功能，并呈现“无反应性”，即使在随后与抗原的接触中提供了这两种信号(17). 这种对T细胞协同刺激的需求被认为是为了维持对无法传递第二个信号的组织中表达的正常自身抗原的耐受性。由于大多数肿瘤细胞是较差的APC，不能表达共刺激分子（但通常表达MHC I类分子，并且可以诱导表达MHC II类分子），因此上述范式预测，肿瘤特异性T细胞在遇到癌细胞MHC分子上的肿瘤抗原时会失去功能。为了支持这一假设，一些研究表明，通过接种转染表达B7–1的肿瘤细胞，增强了启动T细胞介导的抗肿瘤免疫的能力(18–20).

然而，上述推理并不能完全解释APC对癌症免疫反应失败的原因(21). B细胞淋巴瘤等肿瘤表达高水平的MHC I类和II类分子，并可诱导表达B7-1、B7-2和细胞间粘附分子1（ICAM-1）。此外，淋巴瘤细胞系已被证明能够处理并向T细胞提呈抗原在体外，导致T细胞活化(22–24). 尽管有这些特征，淋巴瘤通常是一种高度侵袭性的癌症，在正常产生原发性T细胞反应的地方进展。

对这些发现的一种解释是，淋巴瘤细胞表达的B7-1和/或B7-2水平可能有利于活化T细胞与CTLA4的高亲和力相互作用，而不是与CD28的低亲和力相互作用(25,26). CTLA4的参与被认为对T细胞激活产生反调节抑制，CTLA4表达在T细胞激活后24–48小时达到峰值。我们的模型中观察到T细胞无反应性伴随着初始克隆扩增，转基因T细胞失去了原始表型，这与该假设一致。事实上，在其他系统中，体内已经证明，阻断CTLA4结合可以防止对肽抗原的无能诱导(27)，加剧自身免疫反应(28,29)，增强抗肿瘤免疫反应(30).

或者，除了CD28结合外，可能还需要额外的共刺激信号来启动激活的免疫反应体内B细胞肿瘤不能提供这些未定义的信号可能反映了未转化B细胞激活原始T细胞的一般能力体内(31–34). 有趣的是，在外周耐受模型中，抗原特异性T细胞的表型和功能发生了类似的变化，其中自身抗原受Igκ启动子和增强子的调控，因此主要由B细胞表达(35).

目前尚不清楚抗原特异性CD4的发展⁺T细胞无能是MHCⅡ类阳性肿瘤（如B细胞淋巴瘤）的一个独特特征。尽管我们已经证明A20HA可以被纯化的HA特异性转基因CD4识别⁺T细胞在体外(13)，观察到T细胞功能的变化体内可能是直接接触MHC II类HA肽所致⁺淋巴瘤细胞或宿主APC对抗原的摄取和呈现。如果后一种机制是有效的，这种形式的肿瘤耐受性也可能见于非造血性癌症。值得注意的是，浆细胞瘤是一种B细胞系肿瘤，不能表达MHC II类抗原CD4⁺T细胞对肿瘤Ig独特型蛋白的耐受性得到证实(36). 然而，在这种情况下，耐受性主要由独特型特异性T细胞的克隆性缺失介导，这种克隆性缺失是由血清中大量分泌的肿瘤独特型蛋白以剂量依赖的方式诱导的。在目前的模型中，我们未能检测到血清中的循环抗原，即使是来自具有广泛肿瘤负担的小鼠。

将抗原特异性T细胞无能确定为肿瘤进展的早期事件，对癌症免疫治疗的持续发展具有明确的意义。在用其他治疗方式减轻肿瘤负担后，这种状态的持续性仍有待确定，但以目前的形式，这种策略可能在治疗最小残留疾病方面最有效。确定肿瘤诱导T细胞无能的分子基础和恢复T细胞反应性的策略，将对主动抗肿瘤免疫治疗的最终成功至关重要。

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