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生理学杂志。2006年5月1日；572（第3部分）：677-689。
2006年3月9日在线发布。 数字对象标识：10.1113/jphysiol.2005.103820
预防性维修识别码：PMC1780004（项目编号：1780004）
PMID：16527858

肿胀激活兴奋性氨基酸释放与Cl的药理学比较−培养大鼠星形胶质细胞的电流

伊斯干达F阿卜杜拉耶夫,1 阿莱娜·鲁德库斯卡娅,2 Gary P学校,1 哈罗德·基梅尔伯格,1和亚历山大·蒙金2
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关联数据

补充资料

摘要

普遍表达的容积调节阴离子通道（VRAC）是氯离子通道，可渗透多种小有机阴离子，包括兴奋性氨基酸（EAAs）谷氨酸和天冬氨酸。广谱阴离子通道阻滞剂可显著降低脑缺血和其他与星形细胞肿胀相关的病理状态下EAA的释放。然而，尚不确定VRAC是否是肿胀细胞释放EAA的主要途径。在本研究中，我们测量了EAAs的膨胀激活释放d日-[三H] 天冬氨酸流出和VRAC介导的Cl−培养大鼠星形胶质细胞的全细胞膜片钳电流。我们比较了溶胀激活EAA释放途径和Cl的药理学特征−电流。候选Cl的表达−通道经RT-PCR证实。最大Cl−通道（p-VDAC）阻断器Gd3+，ClC-2抑制剂Cd2+MDR-1阻滞剂维拉帕米不影响EAA释放或VRAC电流。钙敏感氯离子拮抗剂−通道（CaCC），即硝氟米酸，对EAA的释放几乎没有影响，仅部分抑制膨胀激活的Cl−电流。阻隔ClC-3介导的Cl的佛波酯PDBu−电流对VRAC电流和上调的EAA释放没有影响。相反，选择性抑制VRAC的DCPIB能有效抑制EAA释放和VRAC电流。另外两种相对选择性的VRAC抑制剂，三苯氧胺和根皮素，也阻断了VRAC电流，并强烈减少了EAA的释放。综上所述，我们的数据表明：（i）星形胶质细胞体积依赖性EAA释放主要由VRAC介导，（ii）ClC-2、ClC-3、ClC-4、ClC-5、VDAC、CaCC、MDR-1和CFTR基因产物对EAA通透性没有贡献。

到目前为止，在绝大多数研究的真核细胞类型中都存在有机渗透物的膨胀激活通透性途径(张伯林与斯特朗出版社，1989年;Kirk&Strange，1998年;Junankar&Kirk，2000年). 这些途径可能有助于许多细胞功能，包括细胞容积调节、细胞凋亡、有机溶质的运输以及通过释放生物活性有机物质进行细胞间通讯(奇怪等。1996;冗长的等。1998;Kirk&Strange，1998年;帕森特斯·莫拉莱斯等。2000). 在大脑中，下丘脑视上核中，星形胶质细胞释放的非必需含硫氨基酸牛磺酸对体积敏感，可调节大细胞神经元的电活动(赫西等。1997;德勒兹等。1998;赫西等。2000). 一些脑部疾病，如缺血、低钠血症和脑外伤，与明显的细胞肿胀有关，这种肿胀主要见于星形胶质细胞(Kimelberg，1995年;帕森特斯·莫拉莱斯等。2002;Mongin&Kimelberg，2005年一). 星形胶质细胞培养中，细胞肿胀可激活兴奋性氨基酸谷氨酸和天冬氨酸的释放(基梅尔伯格等。1990). 在大脑中，兴奋性氨基酸可以通过谷氨酸受体的过度激活促进神经细胞损伤(迪纳格尔等。1999). 缺血大脑皮层中谷氨酸和天冬氨酸的释放对广谱氯通道阻滞剂他莫昔芬、4-乙酰氨基-4′-异硫氰基二苯乙烯-2,2′-二磺酸（SITS）、4,4′-二硝基二苯乙烯-2，2′-双磺酸（DNDS）、5-硝基-2-（3-苯丙基氨基）苯甲酸（NPPB）和双嘧达莫敏感(菲利斯等。1997;费城等。1998;塞基等。1999;费斯特尔等。2004).

有机渗滤液膨胀激活释放的一种假设途径是普遍表达的容积调节阴离子通道（VRAC），它被细胞膨胀激活，可渗透多种无机和小有机阴离子，包括氨基酸牛磺酸、谷氨酸和天冬氨酸(奇怪等。1996;冈田，1997;尼利乌斯和德罗格曼斯，2003年). 在电生理研究中，VRAC电流是根据生物物理特性的组合来确定的，例如适度外向整流、正电位下的时间依赖性失活和艾森曼I型阴离子选择性序列（SCN−>我−>英国−>氯离子−>F类−>葡萄糖酸盐）(冈田，1997年;尼利乌斯等。1997). 然而，尽管进行了广泛的实验研究，但VRAC的分子性质尚未确定。

尽管VRAC的氨基酸渗透性已在许多电生理研究中得到证实(班德拉利和罗伊，1992年;Jackson&Strange，1993年;杰克逊等。1994;罗伊，1995年;博伊斯等。1996)目前仍不确定VRAC是否是细胞膨胀激活氨基酸释放的唯一途径，甚至是主要途径(Junankar&Kirk，2000年). 一些研究小组报告称，至少在某些细胞类型中，膨胀激活的氯离子−有机渗透通量由单独的传输机制介导(Lambert&Hoffmann，1994年;托马森等。2004). 此外，其他间接证据表明，对体积敏感的有机渗透剂释放可能涉及多个渗透途径(鲁富斯等。1996;蒙金等。1999).

在Cl中−迄今为止已克隆的通道ClC-2、血浆膜VDAC（p-VDAC或VDACL）和ClC-3表现出体积敏感性，但其其他特性与VRAC特性不同(格伦德等。1992;段等。1997;萨比罗夫等。2001). 其中至少有两个通道VDAC和ClC-3对兴奋性氨基酸具有可测量的渗透性(段等。1997;萨比罗夫等。2001). 本研究的目的是确定氯离子−完全或部分参与肿胀的通道激活了肿胀大鼠星形胶质细胞兴奋性氨基酸的释放。为了达到这一目的，我们使用了一些药物，这些药物区分了特定的氯离子−频道。这份手稿中包含的一些数据已经以初步形式呈现(蒙金等。2005).

方法

细胞培养物

如前所述，从新生Sprague-Dawley大鼠的大脑皮层制备融合的原代星形胶质细胞培养物(Frangakis&Kimelberg，1984年)，稍作修改，如下所示。所有动物程序均按照NIH动物护理指南进行，并由机构动物护理和使用委员会批准。简单地说，用快速斩首法杀死新生大鼠，将大脑皮层从脑膜和基底神经节中移除并分离，并用中性蛋白酶分解组织。分离的细胞接种在聚乙烯上d日-赖氨酸涂层18-mm玻璃盖玻片（美国北卡罗来纳州伯灵顿卡罗来纳生物供应公司），并在补充有10%热灭活马血清（HIHS）、50 U ml−1青霉素和50μg ml−1链霉素，37°C，5%CO加湿2−95%大气。每周更换两次培养基。培养2周后，从培养基中取出青霉素和链霉素。免疫细胞化学显示，～98%的细胞对星形细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）呈阳性染色。

兴奋性氨基酸流出量测量

如前所述进行兴奋性氨基酸流出量测量(蒙金等。1999;Mongin&Kimelberg，2002年). 简单地说，在玻璃盖玻片上生长的星形胶质细胞在一夜之间被装载d日-[三H] 天冬氨酸（4μCi ml−1)在含有10%HIHS的2.5 ml MEM中，置于5%CO的培养箱中237°C时为−95%空气。在外排测量开始之前，在Hepes缓冲溶液中清洗细胞，使其不含细胞外同位素和含血清的培养基。等渗Hepes-buffered培养基含有（m米)135氯化钠，3.8氯化钾，1.2硫酸镁4，1.3氯化钙2，1.2千赫2人事军官4, 10d日-葡萄糖和10个Hepes，用NaOH调节pH至7.4。在CdCl的实验中2经测试，从溶液中除去磷酸盐。将盖玻片插入Lucite灌注室，灌注室底部有一个凹陷，以容纳盖玻片和聚四氟乙烯螺钉顶部，在细胞上方留有约100–150μm高的空间。以1.2 ml min的恒定流速过度搅拌细胞−1在37°C的培养箱中，使用Hepes-buffered培养基。在低渗透介质中，NaCl浓度降至85 m米用冰点渗透压计（μOsmette，型号5004，Precision Systems，Natick，MA，USA）检查所有缓冲液的渗透压，等渗和低渗介质的渗透压分别为287±2和198±2。以1分钟的间隔收集过多融合蛋白组分。在每个实验结束时，用含有1%十二烷基硫酸钠和4m的溶液提取细胞中剩余的同位素米EDTA公司。添加4毫升Ecoscint闪烁鸡尾酒（美国佐治亚州亚特兰大国家诊断公司），并计算每一部分三Packard Tri-Carb 1900TR液体闪烁分析仪中的H（美国伊利诺伊州唐纳斯·格罗夫市PerkinElmer）。通过将每个1分钟间隔内释放的放射性除以细胞中剩余的放射性（剩余部分至被测部分开始时的所有放射性计数之和加上细胞消化物中剩余放射性），计算出每个时间点的部分同位素释放百分比使用自定义计算机程序。

电生理实验

为了进行电生理测量，使用重组蛋白酶TrypLE（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分离融合培养物中生长的原代星形胶质细胞，并在聚d日-添加10%HIHS的MEM中低密度赖氨酸处理玻璃盖玻片。第二天，含血清培养基被无血清Opti-MEM（Invitrogen）替换，添加300μ米二丁酰环腺苷酸（dbcAMP），并在24–72小时内对单个细胞进行拼接。如前所述，在室温下进行全细胞记录(Kubo和Okada，1992年;线路接口单元等。1998). 使用微量移液器（P-87，Sutter Instruments，Novato，CA，USA），用硼硅酸盐玻璃毛细管制作贴片电极，当填充移液管溶液时电阻为3–3.5 MΩ。串联电阻≤15 MΩ。使用Axopatch 200B放大器（Axon Instruments，Union City，CA，USA）记录电流。pCLAMP软件（9.2版，Axon Instruments）用于命令脉冲控制、数据采集和分析。电流信号用四极贝塞尔滤波器在2 kHz下过滤，并在4 kHz下数字化。通过每隔15秒从0至±40 mV的保持电位施加交替的2 s步进脉冲来监测电流发展的时间进程−电流，我们通过应用0 mV的2 s步进脉冲以20 mV增量测试−100至+100 mV的电位来测试其生物物理特性。等渗外溶液包含（m米)：110 CsCl，2 CaCl2，1 MgSO4、5葡萄糖、10 Hepes和60甘露醇（pH 7.4、290 mosmol l−1). 低渗溶液是通过从等渗溶液中省略甘露醇制成的，其渗透压为230 mosmol。吸管溶液包含（m米)：110 CsCl，1 MgSO4，1钠2-ATP，0.3钠2-GTP、15 Na-Hepes、10 Hepes、1 EGTA和10甘露醇（pH 7.3，255 mosmol l−1). 移液管溶液的渗透压设定为低于等渗槽溶液，以防止达到全细胞模式后自发的细胞肿胀(沃雷尔等。1989).

总RNA分离和RT-PCR

总RNA是从培养的星形胶质细胞中分离出来的，这些细胞生长在60-mm的培养皿中汇合。根据制造商的说明使用TRIzol试剂（Invitrogen），以改进由Chomczynski&Sacchi（1986）.RNA样品在29°C下与DNA酶I混合物在RNase抑制剂存在下孵育15分钟，以消化任何污染的基因组DNA。然后将RNA样本转移到冰上米将EDTA（pH 8.0）加入到每个试管中。在75°C下培养5分钟后，PCR试管立即再次放在冰上。浓缩试剂混合物，含10×PCR缓冲液，10 m米dNTP，0.1米DTT、RNA酶抑制剂和5 ngμl−1将随机六聚体添加到反应管中。然后将反应混合物在42°C下加热3分钟。然后添加一个未提取单位的Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶（Invitrogen），并继续培养60分钟。然后通过在65°C下加热反应混合物10分钟使酶失活。RT反应产物储存在−20°C下，直到用于PCR。

我们使用了之前发布的ClC-1、ClC-2、ClC-3、ClC-4、ClC-5、CFTR、MDR-1和VDAC-1的寡核苷酸引物序列（参见表1引物序列和参考文献）。将含有10 pmol每种5′-和3′-引物的十毫升等分试样添加到10μl RT反应混合物中，并覆盖30μl矿物油。将反应管置于热循环块（iCycler，Bio-Rad，Hercules，CA，USA）中，并在94°C下加热2分钟。五微升含有dNTPs和1.5 U塔克然后添加聚合酶（Invitrogen）。所有成分的最终浓度如下：1×无镁PCR缓冲液2+（罗氏），200μ米每个dNTP（Invitrogen）的2.0 m米氯化镁2, 1 μ米每种底漆，30 mUμl−1属于塔克聚合酶。反应设定为38个周期。变性温度设置为94°C，延伸温度设置为72°C，退火温度设置为60°C。

表1

用于RT-PCR的序列特异性引物列表。
基因产物正向底漆反向底漆预期长度参考
氯C-1TGTGGAACGCTCAGAACTGCAGTC公司TCTAGTGCCAAGAACCTCTGAGC公司656库尔卡等。(2002)
氯C-2中国民航总公司GAACTGTCAAAAGCCAGGG公司499Enz公司等。(1999)
氯化物-3CCTCTTTCCAAAGTATACAC公司TTACTGGCATTCATGTCATTTC公司552酶等。(1999)
氯化物-4ggtacatggctgaacttcGAGTCATGTTGGGGTCATTG公司297酶等。(1999)
氯-5TGCTGACTGTCCTTACTCAG公司CAGGATGTTTCCGAAGCTTCA公司269库尔卡等。(2002)
立方英尺CGCAGGTTCTCAGTGGACGATGCC公司CCTCAACCAGAGAAAACCAGCACA公司607胡贝尔等。(1998)
MDR1型CCCATTGCAATAGCAGG公司TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA公司158阿尔伯曼等。(2005)
VDAC-1型GGACCGAGTATGGGCTGACG公司GCTGCTATTCAAAAGCGAGTGTTAC公司478布雷斯等。(2000)

PCR产物（每个9μl）在预加载1μg ml的1.5%琼脂糖凝胶上分离−1溴化乙锭，在紫外光下可见。将PCR产物的分子量与100-bp DNA梯形图（Invitrogen）进行比较。通过测序确认PCR产物的相同性。对DNA污染的控制如上所述，但不包括反应混合物中的逆转录酶。

材料

d日-[三H] 天冬氨酸（比活性～18 Ci m米−1)获得于美国马萨诸塞州波士顿的PerkinElmer Life Sciences或美国新泽西州皮斯卡塔韦的Amersham Biosciences。Dispase（中性蛋白酶Dispase II级）购自罗氏公司（美国洛杉矶巴吞鲁日）。所有细胞培养试剂均来自Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）。4-[（丁基-6,7-二氯-2-环戊基-2,3-二氢-1-氧代-1H（H）-茚-5-基）氧基]丁酸（DCPIB）和维拉帕米是从托克里斯（美国密苏里州埃利斯维尔）获得的。Phorbol 12,13-二丁酸酯（PDBu）来自Calbiochem（美国加利福尼亚州La Jolla）。Phloretin和所有其他试剂和盐均购自Sigma（美国密苏里州圣路易斯），是可用的最高等级试剂。

数据分析

使用重复测量ANOVA分析低渗介质暴露期间的氨基酸释放，以测试药物的影响以及时间的影响及其相互作用(P（P）-药物作用的数值包含在图例中）。分析还包括使用Fisher的LSD试验对受试药物存在或不存在时的平均峰值释放值进行计划比较（这些P（P）-值显示在结果部分的文本中）。在暴露于低渗透介质的第2分钟和第3分钟之间观察到峰值释放值，代表氨基酸渗透途径的最大活性。在电生理实验中，抑制剂的作用被标准化以控制氯离子−同一实验中的电流。在这些实验中，使用Student的t吨将药物存在时的归一化电流与100%进行比较的测试(P（P）-值显示在结果部分的文本中）。使用Statistica 6.1（美国俄克拉何马州塔尔萨市StatSoft）或Origin 7.5（美国马萨诸塞州北安普敦市Origin Lab）进行统计分析。

结果

膨胀-激活d日-[三H] 天冬氨酸释放和氯−培养大鼠星形胶质细胞中的电流对广谱氯敏感−通道阻断剂NPPB

在培养的大鼠星形胶质细胞中，介质渗透压降低30%可诱导短暂的d日-[三H] 天冬氨酸的最大释放率为～1.0–1.5%，是等渗条件下非刺激细胞释放率的10–20倍(图1一). 广谱Cl−通道阻滞剂NPPB，100μ米，阻断了67±7%的峰值释放（与对照释放显著不同，P（P）= 0.003,图1一). 在平行实验中，我们测量了全细胞氯离子−介质渗透压降低20%时产生的电流。培养的星形胶质细胞形态极为平坦，因此在接触低渗透介质期间很难对细胞进行贴壁并保持密封。因此，在电生理实验中，我们用二丁酰环腺苷酸预处理细胞，使细胞体更圆。这种处理提高了实验成功率，同时不会引起电流密度或膨胀活化Cl的生物物理性质的任何实质性变化−电流（未显示数据）。如中所示图1B类，低渗应激激活大细胞氯离子−电流。平均稳态电流密度从3.1±0.5 pA pF增加−1在等渗条件下达到19.7±3.3 pA pF−1+40毫伏时(n个=5，数据未显示）。这些电流在大的正电位下表现出适度的外向整流和时间依赖性失活(图1B类，插图）。如所示图1B类, 100 μ米NPPB强烈可逆地抑制膨胀活化Cl−电流，减少95.2±3.4%(n个= 5,P（P）<0.001）。因为Cl活化较慢−电生理实验中的电流(图1B类)，与的激活相比d日-[三H] 外排实验中天冬氨酸的释放(图1一)，我们还对d日-[三H] 天冬氨酸和36氯−低渗性肿胀细胞中的通量。在完整的细胞中d日-[三H] 天冬氨酸和36氯−发布同时发生（在线补充材料，补充图1).

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广谱阴离子通道阻滞剂NPPB能有效抑制肿胀激活的兴奋性氨基酸释放和氯离子−培养大鼠星形胶质细胞的电流

一，NPPB对肿胀激活的影响d日-[三H] 天冬氨酸释放。如图所示，细胞在有（□）或无的情况下暴露于低渗透介质中10分钟(▪) 100μ米NPPB公司。数据为平均值±s.e.m.公司。共5个实验**P（P）=0.007，影响NPPB与对照，重复测量方差分析。B类，代表Cl的5个电生理记录−单一培养星形胶质细胞暴露于低渗透介质中的电流。将细胞保持在0 mV，并应用±40 mV的交替脉冲来测量Cl的活化−电流。NPPB（100μ米）在Cl后施用−电流接近稳态水平。插图：Cl−在星号指示的时间点，对从−100到+100 mV的阶跃脉冲的电流响应以20 mV为增量。

Cl的表达−培养星形胶质细胞中的通道

确定哪个候选CI−通道在我们培养的星形胶质细胞的制备中表达，我们使用RT-PCR方法和先前发表的序列特异性引物分析了这些细胞中的mRNA(胡贝尔等。1998;酶等。1999;布雷斯等。2000;库尔卡等。2002;阿尔伯曼等。2005; 有关引物序列，请参见表1). 如中所示图2，所有候选CI−在mRNA水平上，我们的制剂中存在通道。得到的PCR产物与其预测的分子量相对应，并通过测序证实了它们的分子身份。Cl的蛋白质表达−除ClC-4外，培养的星形胶质细胞中感兴趣的通道以及类似的mRNA表达先前已经通过Parkerson&Sontheimer（2004）我们对RT-PCR反应使用了两个阴性对照。为了检查基因组DNA污染，我们从反应混合物中省略了逆转录酶。这导致PCR信号消失。此外，我们对ClC-1基因产物使用了序列特异性引物，该产物在大脑或培养的星形胶质细胞中不表达。如预期，没有与ClC-1对应的信号(图2).

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不同Cl的mRNA转录表达−原代星形胶质细胞培养中的通道

不同Cl转录物的PCR产物的溴化乙锭染色−研究了渠道候选人。在用DNA酶处理的mRNA样品进行逆转录酶处理后，使用序列特异性引物进行PCR，以去除任何基因组DNA污染。有关引物序列和其他详细信息，请参见方法。可见带对应于ClC-1（通道2、3）、ClC-2（4、5）、ClC-3（6、7）、ClC－4（8、9）、ClClC-5（10、11）、CFTR（12、13）、MDR-1（14、15）和p-VDAC（16、17）的预期产物。未检测到ClC-1产品。当指示时，从反应混合物中省略逆转录酶（RT）作为阴性对照。车道1和18包含一个100-bp MW阶梯。

血浆膜VDAC抑制剂Gd的作用3+膨胀激活d日-[三H] 天冬氨酸释放和氯−电流

Maxi氯离子通道（p-VDAC或VDACL）最初是从牛脑中克隆的(德米策尔等。1994)并在培养的大鼠皮层星形胶质细胞中功能性表达(Jalonen，1993年;Parkerson&Sontheimer，2004年). p-VDAC对体积敏感，有足够大的孔来传导兴奋性氨基酸(萨比罗夫等。2001;Sabirov&Okada，2004年). 为了测试p-VDAC对兴奋性氨基酸释放的贡献，我们使用30μ米Gd公司3+，在这种浓度下区分了p-VDAC和VRAC(萨比罗夫等。2001). 如中所示图3，Gd3+有轻微刺激肿胀的趋势d日-[三H] 天冬氨酸释放(P（P）=0.219）和Cl−电流(P（P）= 0.050).

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p-VDAC阻断剂Gd3+不影响肿胀激活d日-[三H] 天冬氨酸释放和氯−电流

一，Gd的影响3+膨胀激活d日-[三H] 天冬氨酸释放。如图所示，细胞在有（□）或无的情况下暴露于低渗透介质中10分钟(▪) 为30μ米Gd公司3+数据为平均值±s.e.m.公司。共5个实验。NS，不显著(P（P）=0.181），Gd3+与对照，重复测量方差分析。B类，Gd的影响3+膨胀活化Cl−电流。6个电生理记录的代表。Gd公司3+(30 μ米）在Cl后施用−电流接近稳态水平。

镉的影响2+膨胀激活d日-[三H] 天冬氨酸释放和氯−电流

我们已经使用了300μ米氯化镉2以探测ClC-2通道的潜在参与。ClC-2是一种广泛表达的Cl−通道，也受细胞肿胀调节(格伦德等。1992)，在培养的星形胶质细胞中表达(费罗尼等。1997;Parkerson和Sontheimer，2004年). 镉2+(300 μ米)抑制ClC-2电流约70%(克拉克等。1998). 然而，在我们的实验中2+未能抑制膨胀激活d日-[三H] 天冬氨酸释放(图4一,P（P）=0.134）或Cl−电流(图4B类,P（P）= 0.689).

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ClC-2抑制剂Cd2+不影响肿胀激活d日-[三H] 天冬氨酸释放和Cl−电流

一，镉的影响2+膨胀激活d日-[三H] 天冬氨酸释放。如图所示，细胞在有（□）或无的情况下暴露于低渗透介质中10分钟(▪) 300μ米镉2+数据为平均值±s.e.m.公司。5-6个实验。NS，不显著(P（P）=0.294），镉2+与对照，重复测量方差分析。B类，300μ的影响米镉2+膨胀活化Cl−电流。6个电生理记录的代表。

佛波酯PDBu对d日-[三H] 天冬氨酸释放和氯−电流

ClC-3通道已从大鼠脑中克隆，并被PKC的激活有效抑制(川崎等。1994). PKC激活剂PDBu强烈下调溶胀活化的Cl−心肌细胞和肺动脉平滑肌细胞的电流(段等。1999;钟等。2002). ClC-3在培养的星形胶质细胞中表达(Parkerson&Sontheimer，2004年). 在我们手中，500 n米PDBu对膨胀活化Cl无影响−电流(图5B类,P（P）=0.727），并且强烈上调d日-[三H] 天冬氨酸释放(图5一，峰值释放为对照的170.4±11.6%，P（P）< 0.001).

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PDBu通过PKC依赖机制下调ClC-3活性，但不抑制肿胀激活d日-[三H] 天冬氨酸释放和氯−电流

一，500 n的影响米膨胀激活PDBud日-[三H] 天冬氨酸释放。如图所示，细胞在有（□）或无的情况下暴露于低渗透介质中10分钟(▪) PDBu的。在暴露于低渗透介质之前和期间10分钟施用PDBu。数据为平均值±s.e.m.公司。共5个实验**P（P）=0.002，PDBu与对照，重复测量方差分析。B类，500 n的影响米膨胀活化Cl上的PDBu−电流。6个电生理记录的代表。

钙活化氯的作用−通道阻滞剂尼氟米酸对肿胀的抑制作用d日-[三H] 天冬氨酸释放和氯−电流

众所周知，低渗透介质可升高细胞内钙2+多个细胞中的浓度(麦卡蒂和奥尼尔，1992年)，可能触发钙敏感Cl的激活−频道。ATP和其他钙2+-动员剂强烈增强星形胶质细胞和其他几种细胞类型中溶胀诱导的有机渗透物释放(Mongin&Kimelberg，2002年;Loveday（情人节）等。2003;佛朗哥等。2004)这意味着钙敏感Cl的潜在贡献−频道。这些通道被100μ米硝基苯甲酸(Large&Wang，1996年;佩德森等。1998). 在我们的实验中，100μ米硝氟米酸对肿胀激活的兴奋性氨基酸释放无效(图6一,P（P）= 0.585). 当ATP与低渗透介质共同作用时，它会强烈增强d日-[三H] 天冬氨酸释放，现在对100μ米硝基苯甲酸(图6一，22.5±1.4%抑制，P（P）= 0.047). 膨胀活化氯−电流对硝氟米酸更敏感(图6B类，41.1±2.5%抑制，P（P）< 0.001).

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钙的阻滞剂2+-活化Cl−通道，硝氟胺酸，弱影响肿胀激活d日-[三H] 天冬氨酸释放和氯−电流

一，效果为100μ米膨胀激活的硝基苯甲酸（NA）d日-[三H] 天冬氨酸在10μ米ATP。如图所示，细胞在有（□，•）或无的情况下暴露于低渗透介质中10分钟(▪, •) 100μ米硝氟酸。ATP存在于所示的低渗介质中（○，•）。数据为平均值±s.e.m.公司。共5个实验。NS，不显著(P（P）=0.074），硝氟酸与控制*P（P）=0.04，ATP与ATP加硝氟酸，重复测量ANOVA。B类，效果为100μ米膨胀活化Cl上的硝氟酸（NA）−电流。代表6个电生理记录。

维拉帕米对肿胀的影响d日-[三H] 天冬氨酸释放和氯−电流

多药耐药-1基因的产物，P-糖蛋白或MDR-1，以前被认为是VRAC，但现在被认为只起VRAC调节剂的作用(瓦尔弗德等。1992;《葡萄酒与幸运》，1996年). 该蛋白在培养的星形胶质细胞中表达(罗纳尔森等。2004). 我们使用了100μ米维拉帕米，在这个浓度下完全抑制MDR-1功能(幸运等。1994)测试MDR-1是否直接或间接参与兴奋性氨基酸释放。在我们的实验中，维拉帕米对峰值没有影响d日-[三H] 天冬氨酸释放(P（P）=0.402），但强烈抑制了暴露于低渗透介质期间释放的时间依赖性失活(图7一). 在相应的电生理研究中，100μ米维拉帕米不能影响膨胀激活的Cl−电流(图7B类,P（P）= 0.323).

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MDR-1抑制剂维拉帕米不能阻止肿胀激活d日-[三H] 天冬氨酸释放和氯−电流

一，效果为100μ米维拉帕米（VRP）激活肿胀d日-[三H] 天冬氨酸释放。如图所示，细胞在有（□）或无的情况下暴露于低渗透介质中10分钟▪) 维拉帕米。数据为平均值±s.e.m.公司。共5个实验*P（P）=0.015，维拉帕米与控制（主要效果）***P（P）<0.001，维拉帕米与对照组（组和时间交互作用效应），重复测量方差分析。这种显著的相互作用反映了维拉帕米组的释放时间进程受到显著影响。B类，效果为100μ米维拉帕米对膨胀活化Cl的作用−电流。6个电生理记录的代表。

VRAC阻滞剂DCPIB、三苯氧胺和根皮素对肿胀的影响d日-[三H] 天冬氨酸释放和Cl−电流

如中所示图1B类低渗溶液诱导的全细胞氯的应用−具有适度外向整流和大正电位失活的电流是VRAC的典型特征。为了探讨VRAC活性对兴奋性氨基酸释放的贡献，我们测试了一种新型选择性VRAC阻断剂DCPIB。DCPIB抑制小牛肺动脉内皮细胞（CPAE）、豚鼠心房心肌细胞和爪蟾卵母细胞，但不影响内源性或异源表达的ClC-1、ClC-2、ClC-4、ClC-5、CFTR和钙激活的Cl−通道(德彻等。2001). IC50DCPIB对VRAC电流的抑制为4.1μ米(Decher公司等。2001). 在我们的实验中，20μ米DCPIB阻止肿胀激活d日-[三H] 天冬氨酸释放76.0±4.5%(图8一,P（P）< 0.001). 当低渗透介质与20μ米列车自动防护系统(图8一，94.9±1.7%抑制，P（P）< 0.001). 与文献报道的效果一致，20μ米DCPIB几乎完全抑制了膨胀活化的Cl−电流(图8B类抑制率为93.5±1.7%，P（P）< 0.001).

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选择性VRAC阻断剂DCPIB能有效抑制肿胀激活d日-[三H] 天冬氨酸释放和氯−电流

一，20μ的影响米膨胀激活的DCPIBd日-[三H] 20μ米ATP。如图所示，细胞在有（□，○）或无的情况下暴露于低渗透介质中10分钟(▪, •) DCPIB，在应用低渗透介质之前和期间给药10分钟。ATP仅存在于低渗介质中（○，•）。数据为平均值±s.e.m.公司。共5个实验***P（P）<0.001，DCPIB与控制；††P（P）< 0.001; 列车自动防护系统与ATP加DCPIB，重复测量方差分析。B类，20μ的影响米膨胀活化Cl上的DCPIB−电流。6个电生理记录的代表。

另一种众所周知的溶胀抑制剂激活Cl−三苯氧胺通道完全抑制全细胞VRAC电流(图9B类，102.6±6.3%抑制，P（P）< 0.001). 令人惊讶的是，急性应用三苯氧胺和低渗透介质只产生微弱的抑制肿胀激活作用d日-[三H] 天冬氨酸释放（数据未显示）。当我们在应用低渗透介质之前和之后将细胞暴露于三苯氧胺10分钟时，抑制作用明显更强(图9一抑制率为43.2±10.7%，P（P）= 0.040). 在暴露于低渗透介质和10μ米ATP，三苯氧胺效力进一步增加(图9一，79.1±7.1%抑制，P（P）< 0.001).

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VRAC阻滞剂他莫昔芬适度抑制肿胀激活d日-[三H] 天冬氨酸释放并完全抑制体积敏感性氯−电流

一，效果为10μ米他莫昔芬对肿胀激活的作用d日-[三H] 天冬氨酸在10μ米ATP。如图所示，在存在（□，○）或不存在的情况下，将细胞暴露于低渗透培养基10分钟(▪, •) 10μ米三苯氧胺，在接触低渗透介质之前和期间使用。ATP仅存在于低渗介质中（○，•）。数据为平均值±s.e.m.公司。5到7个实验**P（P）=0.002，三苯氧胺与控制；††P（P）<0.001，ATP与ATP加三苯氧胺，重复测量方差分析。B类，效果为10μ米三苯氧胺对溶胀活化Cl的作用−电流。6个电生理记录的代表。

如前所述(Mongin&Kimelberg，2002年;哈斯克·莱顿等。2005)另一种相对选择性的VRAC阻滞剂根皮素强烈抑制容积敏感性d日-[三H] 天冬氨酸释放。在这里，我们比较了根皮素对同一细胞制剂中VRAC电流和兴奋性氨基酸释放的影响。Phloretin（100μ米)部分抑制兴奋性氨基酸的释放(图10和补充图2，49.9±5.0%抑制，P（P）< 0.001). VRAC电流抑制稍强(图10和补充材料，82.3±5.3%抑制，P（P）< 0.001). 该根皮素浓度下的预期VRAC抑制率为~80%，如最初的风扇等。(2001)在T84、C127/CFTR和肠道407细胞中。

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不同抑制剂对肿胀激活兴奋性氨基酸释放和氯离子的影响综述−大鼠培养星形胶质细胞的电流

绘制了所有受试抑制剂存在时的标准化（相对于低渗对照）释放值，用于标准化VRAC电流旁边的肿胀激活兴奋性氨基酸释放。如果可用，还显示了ATP存在下的标准化兴奋性氨基酸释放。PHL、根皮素；NA，硝氟酸；VRP，维拉帕米；坦，他莫昔芬。

讨论

在迄今为止研究的绝大多数细胞类型中，细胞膨胀激活有机渗透剂的释放，这种释放对广谱氯离子敏感−通道阻断剂(奇怪等。1996;Kirk&Strange，1998年;冗长的等。1998;Junankar&Kirk，2000年). 在培养的神经胶质细胞中，NPPB、DIDS、SITS、DNDS、双脱氧福斯克林和根皮素都能有效抑制肿胀诱导的兴奋性氨基酸释放，这些都是已知的抑制VRAC电流的药物(Jackson&Strange，1993年;桑切兹·奥莱亚等。1993;冈田，1997;布雷斯等。2000;Mongin&Kimelberg，2002年;哈斯克·莱顿等。2005). 然而，由于这些化合物的低选择性，VRAC是否是依赖于体积的兴奋性氨基酸流量的主要途径尚不确定。在本研究中，我们利用了几种商用化合物，这些化合物区分了许多克隆和表征的氯离子−频道。我们的药理学数据强烈表明，ClC-2、ClC-3、p-VDAC、CaCC、CFTR和MDR-1并不介导任何实质性的星形细胞兴奋性氨基酸释放。另一方面，本研究中测试的所有VRAC阻断剂均强烈抑制d日-[三H] 肿胀细胞释放天冬氨酸，表明推测的VRAC是容积敏感性兴奋性氨基酸流量的主要贡献者。

本研究的一个重要发现是选择性VRAC阻断剂DCPIB几乎完全抑制了溶胀活化的有机渗透剂释放。在最近的一项研究中Decher公司等。(2001)，DCPIB抑制膨胀活化Cl−电流，即VRAC，在几种电池类型中，而不影响Cl−内源性或异源表达的ClC-1、ClC-2、ClC-4、ClC-5、CFTR和钙激活的Cl携带的电流−频道。因此，VRAC可能是培养的星形胶质细胞中有机渗透素释放量依赖性的主要途径。与此结论一致，10 m米细胞外ATP，在高浓度下充当VRAC开放通道阻滞剂(都村等。1996)，有效抑制培养的星形胶质细胞中肿胀激活的兴奋性氨基酸释放(Mongin&Kimelberg，2002年;哈斯克·莱顿等。2005). 此外，100μ米根皮素，区分VRAC、CFTR和Ca2+-活化Cl−通道(风扇等。2001)，也强烈抑制星形细胞氨基酸释放(Mongin&Kimelberg，2002年;哈斯克·莱顿等。2005; 和图10在本研究中）。

尽管Decher及其同事关于DCPIB对VRAC的特异性抑制的数据非常令人信服，但该化合物的选择性尚未得到其他实验室的验证。因此，使用其他Cl获得的信息−通道阻断剂可用于证实DCPIB数据并测试VRAC非依赖性渗透途径的可能贡献。在我们的研究中，Gd3+和Cd2+不影响肿胀激活的兴奋性氨基酸释放。自Gd以来3+和Cd2+分别有效阻断p-VDAC和ClC-2(萨比罗夫等。2001;克拉克等。1998)，这些结果排除了这两种容积敏感性途径的参与。由于维拉帕米没有抑制MDR-1活性，因此排除了MDR-1对有机渗透剂释放的贡献(幸运等。1994). 有趣的是，维拉帕米显著抑制了d日-低渗肿胀细胞中天冬氨酸的释放（参见图6一). 这种失活被认为是由于调节性容积减少（RVD）。维拉帕米在几种细胞类型中阻断RVD，并可能通过抑制Ca发挥作用2+流入或K+电导(麦卡蒂和奥尼尔，1990年;德斯梅特等。1998).

与上述所有候选通道不同，ClC-3没有选择性抑制剂。ClC-3对DCPIB的敏感性尚未测试。然而，该通道的一个独特特征是受到PKC的强烈抑制。佛波醇酯，例如佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯（PMA）和PDBu，可消除ClC-3介导的Cl−渗透性肿胀细胞中的电流(段等。1997;钟等。2002). 相反，PDBu和PMA刺激VRAC介导的Cl−电流和溶胀激活的有机渗透液释放至少在某些细胞类型中(Jackson&Strange，1993年;Loveday（情人节）等。2003;龚等。2004). 在我们的实验中，500 n米PDBu强烈增强了膨胀活化的有机渗透通量，因此不太可能与ClC-3有关。PDBu不刺激Cl−我们电生理实验中的电流。一种可能的解释是PDBu通过Ca的一种作用2+-依赖性PKC亚型，在缺乏钙的情况下不被激活2+在我们的吸管溶液中。

接下来我们测试了Ca的参与2+-活化Cl−通道（CaCCs）。虽然CaCC对体积不敏感，但我们将其列入候选名单，因为细胞肿胀会增加细胞内Ca2+因此可以间接激活钙2+-敏感的运输途径。还发现ATP和其他Ca2+动员激动剂强烈增强容积敏感性外排125我−和肿胀细胞中的有机渗透物(蒂莉等。1994;Loveday（情人节）等。2003;佛朗哥等。2004). 在培养的星形胶质细胞中，ATP增强低渗透介质诱导的d日-[三H] 天冬氨酸释放2到3倍，这种效果完全依赖于细胞内钙2+和钙调蛋白(Mongin&Kimelberg，2005年b条). ATP可能激活单独的Ca2+-除VRAC外，肿胀细胞中的敏感渗透剂释放途径。李等。(2004)最近初步报告了ATP、缓激肽和其他钙2+-释放激动剂通过CaCC诱导星形细胞释放谷氨酸。在他们的工作中，CaCC被100μ米硝氟酸，如许多其他研究中所示(Large&Wang，1996年;佩德森等。1998;李等。2004). 在我们手中，100μ米在没有细胞外ATP和存在细胞外ATP的情况下，硝氟米酸对肿胀激活的兴奋性氨基酸释放的抑制作用可以忽略不计。这些结果似乎排除了CaCC的参与。

也许我们研究中最令人困惑的结果是三苯氧胺对肿胀激活氨基酸释放的抑制作用相对较弱。三苯氧胺是一种有效的VRAC阻滞剂，常用于电生理研究。然而，VRAC对该化合物的敏感性因细胞类型而异，从HEK293和I-407细胞的高敏感性到人类癌症KB3和大鼠RBL-2H3细胞的部分抑制，再到培养的皮层神经元的完全不敏感性(尼留斯等。1994;井上等。2005). 在我们的实验中，10μ米三苯氧胺完全阻断肿胀激活的氯离子−但令人惊讶的是，对容量依赖性d日-[三H] 天冬氨酸释放。此外，其对有机渗透剂释放的抑制作用需要预先培养。在细胞中，ATP的应用增强了肿胀激活的兴奋性氨基酸释放，三苯氧胺抑制释放约80%，接近选择性VRAC阻断剂DCPIB的疗效。这种对三苯氧胺的不同敏感性可以用该化合物对VRAC的间接钙调素依赖性效应来解释，最初由柯克和柯克（1994）与这种想法一致，其他钙调素拮抗剂更有效地阻止ATP刺激的细胞中膨胀激活的氨基酸释放，细胞内钙增加2+上调钙调素依赖过程(Mongin&Kimelberg，2005年b条).

如摘要所示图10，在培养的大鼠星形胶质细胞中，肿胀激活的Cl−电流和兴奋性氨基酸释放具有相似的药理学特征。特别是，最近表征的选择性VRAC阻断剂DCPIB几乎完全抑制了体积依赖性有机渗透剂释放以及VRAC电流。使用其他Cl获得的数据−通道抑制剂符合DCPIB选择性的观点，并排除了ClC-2、ClC-3、p-VDAC、CaCC、CFTR和MDR-1对膨胀细胞有机渗透液释放的贡献。因此，我们现在提出VRAC是调节有机渗透剂释放的主要候选途径。此外，DCPIB是一种有价值的工具，可用于探索VRAC对有机渗透液生理和病理释放的贡献体内和在体外.

致谢

我们感谢Artur Chernoguz对实验的贡献，感谢Paul J.Feustel博士对手稿的批判性阅读和对统计分析的帮助，感谢Min Zhou博士对电生理实验的有益讨论。这项研究得到了NINDS向香港提供的NS-35205赠款的部分支持。

补充材料

本论文的在线版本可访问：

内政部：10.1113/jphysiol.2005.103820

http://jp.physoc.org/cgi/content/full/jphysiol.2005.103820/DC1并包含由两个数字组成的补充材料：

补充图1

同步测量d日-[三H] 天冬氨酸和36氯−培养星形胶质细胞暴露于低渗透介质中的释放

补充图2

VRAC阻滞剂根皮素强烈抑制肿胀激活d日-[三H] 天冬氨酸释放和氯−电流

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文章来自生理学杂志由以下人员提供生理学会