简介
当真核细胞受到氮饥饿或特定激素刺激的挑战时，它们会做出一系列生理变化，以适应这些新条件。这些反应的一个重要方面是自噬，自噬是一种由信号转导机制诱导的分解代谢的膜转运事件（在Abeliovich和Klonsky，2001年;Kim和Klinsky，2000年). 自噬过程中，细胞内膜，在某些情况下被确定为来源于内质网(邓恩，1990年a,1990亿)吞噬并隔离细胞质物质于独特的双双层囊泡中，称为自噬体。自噬体随后获得内体和溶酶体特征，导致胞质衍生物质降解回细胞构建块(邓恩，1990年a,1990年b). 这种反应在酵母中是保守的酿酒酵母，自噬体（直径300-900nm）与酵母溶酶体（液泡）融合，释放内囊泡（称为自噬小体）进入液泡腔(武繁等。, 1992). 在酵母中，自噬对于氮饥饿期间的生存和产孢至关重要(Tsukada和Ohsumi，1993年). 一种相关的途径，细胞质-空泡靶向（Cvt）途径在正常生长条件下的酵母细胞中是活跃的。Cvt途径充当生物合成管道(克利恩斯基等。, 1992)，携带酵母液泡蛋白酶氨肽酶I（Ape1）进入液泡腔。在这一途径中，Ape1的细胞溶质前体prApe1（61 kDa）在可溶性核糖体上合成，并被特异性地固定在称为Cvt囊泡（直径140–160 nm）的双层囊泡中。随后，Cvt囊泡的外双层与酵母液泡的限制膜融合，导致内囊泡（Cvt体）释放到液泡的腔中。然后Cvt体被降解，使prApe1成熟为活性50-kDa形式(Kim和Klinsky，2000年;Abeliovich和Klonsky，2001年).
过去几年对Cvt途径和自噬的遗传学研究揭示了这些过程所需的基因(Tsukada和Ohsumi，1993年;图姆等。, 1994;哈丁等。, 1995). 这些研究发现，自噬的分子机制和Cvt途径在很大程度上重叠，反映了这两个过程之间的高度相似性(哈丁等。, 1996;爸爸等。, 1997;斯科特等。, 1997). 事实上，prApe1是Cvt小泡和自噬体的特异性载体(斯科特等。, 1996); 这种特异性由受体/适配器蛋白Cvt19与prApe1的结合介导(斯科特等。, 2001). 因此，当前的思维假设非特异性货物通过自噬隔离过程被随机捕获，而以prApe1为例的特异性货物则通过与Cvt19等蛋白质的相互作用而被物理招募。尽管自噬和Cvt途径所需的大多数基因是共享的，但仍有一组Cvt通路特异性基因(哈丁等。, 1996;阿贝利奥维奇等。, 1998;斯科特等。, 2000)以及一小部分但不断增长的自噬特异基因(卡马达等。, 2000;石原等。, 2001).
自噬的诱导包括诱导自噬体形成的直接信号转导步骤以及依赖从头合成蛋白质的二级扩张步骤(阿贝利奥维奇等。, 2000). 第二步是形成大小合适的生理活性自噬体所必需的(阿贝利奥维奇等。, 2000). 启动这一过程的直接信号转导机制尚未完全了解。在酵母中，小分子大环内酯类抗生素雷帕霉素可以诱导自噬，雷帕霉素通过抑制高度保守的蛋白激酶Tor来模拟饥饿(Noda和Ohsumi，1998年). 托尔激酶控制所有真核生物的各种营养反应和细胞生长决定（综述于Klinsky和Emr，2000年). 在酵母中，雷帕霉素对Tor的抑制和氮饥饿导致Apg13的快速去磷酸化，Apg13是一种通常在富培养基中过度磷酸化的蛋白质(卡马达等。, 2000;斯科特等。, 2000). 就像自噬体的诱导一样，这一事件也与从头开始的蛋白质合成无关(阿贝利奥维奇等。, 2000). Apg13与一种名为Apg1的Cvt途径和自噬所需的蛋白激酶结合，有人认为Apg13的去磷酸化会导致Apg1活性的变化(卡马达等。, 2000)导致从Cvt途径转向自噬性贩运。
Apg1是一种由897个氨基酸组成的大蛋白，其N-末端激酶结构域横跨24-325个氨基酸。在人类、小鼠、蠕虫和其他基因组中存在假定的Apg1同源物，表明其功能是保守的。Apg1参与自噬体诱导和Cvt途径的确切方式一直存在一些争议。众所周知，在apg1型Δ突变体prApe1在被Cvt小泡或自噬体隔离之前积累，这意味着Apg1在自噬体囊泡形成的早期事件中发挥作用(哈丁等。, 1996).松浦等。(1997)发现Apg1经历了自磷酸化，通过自磷酸化测定的Apg1激酶活性在自噬条件下受到抑制。相反，卡马达等。(2000)据报道，在诱导自噬后，观察到Apg1与Apg13的结合以及用髓磷脂碱性蛋白作为底物在体外测定的Apg1激酶活性都增加。
在这项研究中，我们已着手进一步阐明Apg1的变化影响自噬性贩运转变的方式。为此，我们使用了类似物敏感突变方法(主教等。, 2000). 在这项技术中，蛋白激酶的活性部位发生突变，从而能够容纳非特异性激酶抑制剂的细胞渗透性类似物。尽管非特异性抑制剂PP1（4-氨基-1-叔丁基-丁基-3-苯基吡唑[3,4-d日]嘧啶）能够结合蛋白激酶活性位点中的广谱ATP结合位点，体积庞大的类似物1-NA-PP1不能从野生型蛋白激酶的活性位点取代ATP。用类似物特异性等位基因替换野生型基因会造成这样一种情况，即设计的ATP竞争性抑制剂是一种高度特异的试剂，它只影响依赖于所检测的特定激酶活性的细胞事件（参见主教等。, 2001). 我们发现，抑制Apg1激酶活性可以消除Cvt途径，但不能消除自噬。我们的研究结果表明，Apg1在诱导自噬体中具有非激酶相关的作用。此外，我们发现Apg1在Tor抑制下发生构象变化，这些变化取决于蛋白质C末端的氨基酸残基。
材料和方法
菌株、质粒和生长条件
酵母在YPD培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）或合成最小培养基（SD；0.67%酵母氮基，2%葡萄糖，以及所需的营养缺陷氨基酸和维生素）中生长。饥饿培养基为SD-N（0.17%酵母氮基，不含硫酸铵或含有2%葡萄糖的氨基酸）。先前描述了菌株HAY395(阿贝利奥维奇等。, 2000). 菌株HAY75(材料α,leu2–3112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-Δ901 lys2-801 suc2-Δ9)是一个材料HAY70菌株的α分离物(阿贝利奥维奇等。1999). 菌株HAY437(材料α,第四人民党Δ：：LEU2 LEU2–3112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 APG1-蛋白A:：HIS5 S.p.）通过将蛋白A（prA）盒（见下文）整合到APG1公司应变TVY1中的读数框(格哈特等。, 1998)创建全长APG1公司-prA融合阅读框。菌株HAY512(材料a、，leu2–3112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-Δ901 APG1-蛋白A:：HIS5 S.p.pep4Δ：LEU2)和HAY524(材料a、，leu2–3112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-Δ901人4Δ：：LEU2)是材料HAY437和SEY6210.1杂交的后代。通过将prA盒整合到HAY75中，分别将prA标签融合到密码子800、850、880、886和897（全长），构建了HAY453、HAY454、HAY45、HAY518和HAY 370菌株。通过将prA盒整合到菌株TVY1中，构建了菌株HAY478，以将prA标签融合到APG1公司阅读框。通过PCR和抗prA抗体的Western blotting验证标签的正确整合。菌株HAY571(apg1型Δ：URA3）是通过破坏APG1公司TDY27中的基因(材料α,卢2-3112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 vam3ts秒)单元格(阿贝利奥维奇等。, 1999). 菌株HAY572(apg1型Δ：：URA3）通过中断APG1公司TN124菌株中的基因(材料一leu2–3112 trp1 ura3-52 pho8：：pho8Δ60磷13Δ：：LEU2) (野田佳彦等。, 1995). 菌株HAY595(材料a、，leu2–3112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-Δ901页apg1Δ：：URA3 S.p.pep4Δ：：LEU2）是HAY395和HAY524杂交的单倍体后代。菌株HAY603(材料α,自动发电机组Δ：：URA3 apg13Δ::KanR leu2–3112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-Δ901赖氨酸2-801 suc2-Δ9)是菌株HAY595和BY4742杂交的单倍体后代apg13型Δ：：KanR（ResGen Corp.，Carlsbad，CA），回传至HAY75背景。菌株HAY487是通过整合prA盒后的880密码子构建的APG1公司在BY4742中apg13型Δ::KanR突变生成截断APG1公司基因融合。HAY591菌株是HAY512和BY4742菌株杂交的后代cvt9型Δ：：KanR（ResGen），回传至HAY75背景。
GFP-AUT7（414）质粒通过连接生态RI公司/Xho公司来自pAUT7的I片段（416）(黄等。, 2000)进入生态里/Xho公司I定位pRS414以生成pAUT7（414）。这个Bgl公司II限制位点随后在AUT7（自动变速器7）pAUT7（414）上的基因，使用QuikChange Site-directed Mutagenesis kit（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫内）生成pAUT7BglII（414。编码GFP（S65T）的DNA片段巴姆然后将两侧的HI位点连接到Bgl公司pAUT7BglII（414）的II位点生成pGFP-AUT7（414。这个APG1公司基因被克隆到Spe公司我和萨尔pRS415的I位点(西科斯基和希特，1989年)通过使用含有Spe公司我和萨尔I站点。
试剂
如前所述合成激酶抑制剂PP1和1-NA-PP1(主教等。, 1999). 已描述抗Ape1血清(克林斯基等。, 1992). 完成TM（TM）无EDTA蛋白酶抑制剂片来自罗氏分子生物化学公司（印第安纳波利斯）。其他试剂来自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯），除非另有规定。
抗-Apg1抗体
Apg1阅读框的密码子1-250在框中克隆到Nde公司我和巴姆质粒pET-14b的HI位点（威斯康星州麦迪逊诺瓦根）。重组6xHis标记蛋白根据Novagen手册在Ni-NTA琼脂糖上纯化，多克隆兔抗血清由Covance Research Products，Inc.（Denver，PA）产生。
体外诱变
M102A突变在APG1公司阅读框采用定点PCR诱变（基因SOE；波古利斯等。, 1996)，并通过阅读框的DNA测序验证了突变。K54A、L886G和N884A突变是使用Stratagene QuickChange试剂盒（StratageneInc.）引入的。
用蛋白A的2X-IgG结合域整合标记Apg1
质粒pHAB102通过激活派克靴我-AscI公司pFA6a-GFP（S65T）-His3MX6片段(朗廷等。, 1998)并将其替换为派克靴我-AscI公司PCR片段携带2×重复的金黄色葡萄球菌prA IgG结合结构域（Peter Rehling博士赠送）。为了生成整合模块，设计DNA引物扩增prA/His5区域，5′和3′40-碱基悬垂对应于目标整合位点。
免疫沉淀和蛋白激酶分析
对数生长细胞培养（40 A600单位），并重新悬浮在300μl裂解缓冲液中（50 mM HEPES，pH7.5，1 M NaCl，1 mM EGTA，1 mM-MgCl2，30%甘油，30 mM焦磷酸钠，0.2 mM钠三VO（旁白）4、50 mM NaF、2.5 mM EDTA、亮氨酸肽和胃蛋白酶抑制素各1μg、1 mM PMSF，补充完整的无EDTA蛋白酶抑制剂片）。添加500μl酸洗玻璃珠，并在4°C下旋转细胞5 min。用1.5 ml IP缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.5，100 mM NaCl，2.5 mM EDTA，0.5%吐温-20，10%甘油，0.2 mM Na）稀释细胞提取物三VO（旁白）4，leupeptin和pepstatin各1μg，以及1 mM PMSF），并在13000×克将提取物（8 mg总蛋白，0.7 ml）在IP缓冲液中进一步稀释两倍，并在4°C下与10μl抗Apg1抗体轻轻搅拌培养2 h。添加300微升10%prA-sepharose悬浮液，再培养1.5小时。免疫复合物在IP缓冲液中洗涤一次，在洗涤缓冲液中清洗三次（50 mM HEPES，pH 7.5，0.5 M NaCl，2.5 mM EDTA，10%甘油，0.5%吐温20），在激酶缓冲液中冲洗三次20.1%吐温-20和10%甘油）。将免疫沉淀物平均分为四个管，再悬浮在100μl含有0或20μM 1-NA-PP1的激酶缓冲液中5分钟。通过离心收集沉淀物，再悬浮于30μl含有适当抑制剂浓度加上5μM ATP和20μCiγ-32P-ATP（4500 Ci/mmol，ICN生化，加利福尼亚州科斯塔梅萨）。反应在30°C下培养30 min，并通过添加30μl 2×SDS样品缓冲液停止。在8%SDS-PAGE上分离30微升的每个反应，并使用美国伯乐（加利福尼亚州里士满）个人分子成像仪FX磷光成像仪，配备Quantity One软件。
IgG琼脂糖的亲和纯化
含有所需prA标记基因的酵母细胞在YPD中生长到中对数期，40 A600用100μg/ml草酸酶（发酵剂，Corvallis，OR）在30°C的成球培养基（YPD，20 mM HEPES，pH 7.0，和1 M山梨醇）中以摇动方式将等同物球状化20分钟。然后使用或不使用0.2 ng/ml雷帕霉素处理细胞，并再培养15分钟。然后在冰镇裂解缓冲液中对细胞进行裂解（20 mM HEPES，pH 7.0，0.5%Triton X-100，5 mM EDTA，1 mM MgCl2，100 mM KCl，5 mM磷酸钾）补充完整的EDTA无蛋白酶抑制剂片和1μg/ml亮氨酸蛋白酶和胃蛋白酶抑制素A。提取物通过在100000×克在Beckman Optima MAX-E超离心机（加州伯克利）中于4℃下培养15分钟，然后在4℃下用40μl 50%的IgG sepharose珠浆（vol/vol）培养1.5小时（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）。然后用裂解缓冲液洗涤珠子一次，用洗涤缓冲液洗涤三次（20 mM HEPES，pH 7.0，0.5%Triton X-100，5 mM EDTA，1 mM MgCl2，200 mM KCl，5 mM磷酸钾），一次用预溶缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.0，5 mM EDTA，1 mM MgCl2，5 mM磷酸钾），并用200 mM醋酸铵（pH 3.5）洗脱。将洗脱液在真空下干燥并溶解在SDS样品缓冲液中。
速度梯度沉积
如上所述培养酵母细胞，并在20 mM HEPES中溶解，pH 7.0，100 mM KCl，5 mM磷酸钾，1 mM MgCl2，5 mM EDTA，0.2%Triton X-100，补充完整的EDTA无蛋白酶抑制剂片和1μg/ml亮肽和胃蛋白酶抑制素A。提取物通过在100000×克在Beckman Optima MAX-E超离心机和100μl（8 a600等同物）加载在5–20%蔗糖梯度上。梯度在259000×克在Beckman Optima MAX-E超离心机的TLS55转子中放置7 h。收集13个100μl馏分，用10%TCA沉淀样品，用冷丙酮洗涤两次，然后在SDS-PAGE样品缓冲液中重新悬浮。通过定量蛋白质印迹，使用化学发光检测和美国伯乐Fluor-S Max成像仪和软件。峰值分数的沉降常数是根据公布的表格得出的(麦克尤恩，1967年). 分子质量标记物（Pharmacia，Piscataway，NJ）在相同条件下以平行梯度运行：醛缩酶（158kDa）、铁蛋白（440kDa）和甲状腺球蛋白（669kDa）。
体内磷酸标记和免疫沉淀
酵母细胞在SD中培养至中对数，清洗，并在SD-phosphate中重新悬浮。将细胞在SD-phosphate和5A中再培养6小时600用150μCi标记等效物32加入雷帕霉素或药物载体P（无载体，ICN）1小时，再继续培养20分钟，然后收获细胞，用10%TCA处理，并用丙酮洗涤三次。将细胞颗粒干燥，并在TOMY混合器中用200μl玻璃珠和100μl磷酸盐裂解缓冲液（100 mM磷酸钾，pH 7.4，6 M尿素，1%十二烷基硫酸钠，5 mM EDTA）研磨5分钟制备提取物。将提取物在磷酸盐-IP缓冲液（50 mM磷酸氢钾，pH 74150 mM KCl，5 mM-EDTA，0.5%吐温-20）中稀释用抗Apg1抗体和蛋白A sepharose免疫沉淀等量的TCA沉淀计数。用尿素洗涤缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，2 M尿素，200 mM NaCl，0.5%吐温-20）洗涤免疫沉淀物三次，用TB（50 mM-Tris，PH7.5，1%β-巯基乙醇）洗涤两次，用50 mM Tris，pH 7.5洗涤一次。用SDS负载缓冲液洗脱珠，洗脱液在凝胶上电泳，干燥，并暴露于磷光成像板。
用于Western Blot分析的全细胞提取物的制备
电池（10 A600单位）增长到A600SMD或YPD中0.5–0.8，用10%TCA处理，并用丙酮洗涤两次。然后将干细胞颗粒重新悬浮在100 ml裂解缓冲液（50 mM Tris，pH 6.8，3.6 M尿素，1 mM EDTA，1%SDS）中，并在TOMY MT-360搅拌器（加州帕洛阿尔托）中以最大速度旋转，使用等量的酸洗玻璃珠，持续15分钟。通过离心法去除未分解的细胞，添加等量的2×SDS加载缓冲液，样品在70°C下培养10分钟。
碱性磷酸酶测定
约4 A600采集等量的酵母细胞，在含有2 mM PMSF的冰镇蒸馏水中清洗，并在100μl裂解缓冲液（20 mM PIPES，pH 7.0，0.5%Triton X-100，50 mM KCl，100 mM醋酸钾，10 mM MgSO）中重新悬浮4，10μM硫酸锌4和1 mM PMSF）。添加等体积的酸洗玻璃微珠，通过涡流将细胞溶解4 min，并通过添加200μl溶解缓冲液将溶解液稀释。为了开始分析，将20μl提取物添加到480μl反应缓冲液中（250 mM Tris-HCl，pH 8.5，0.4%Triton X-100，10 mM MgSO4，1.25 mM硝基苯磷酸盐），样品在37°C下培养15分钟，然后通过添加500μl停止缓冲液（2 M甘氨酸，pH 11）终止反应。通过使用Beckman DU-640B分光光度计测量405nM的吸光度来监测硝基苯酚的演变，并从每个样品中减去空白时间0。硝基苯酚浓度采用比尔定律计算，ε405=18000万−1厘米−1提取物中的蛋白质浓度用Pierce BCA测定法测量(皮尔斯化学公司。，Rockford，IL），一个活性单位被定义为nmol硝基苯酚/min/mg蛋白质。
酵母双杂交检测
按照以下说明进行了两次杂交分析詹姆斯等。(1996)简而言之，全长PCR产品APG1公司和激酶结构域截断变体（氨基酸326–897），携带5′巴姆HI和3′萨尔将其各自引物中的I位点克隆到pGAD-C2和pGBDU-C2中。将质粒转化为菌株PJ69-4A，并通过在缺乏组氨酸或腺嘌呤的SD平板上的条纹菌落分析相互作用，并进行生长测试。
显微镜
细胞在缺乏适当选择性营养素的SD培养基中生长至中对数期，并用0.8μM FM 4–64（分子探针，尤金，OR）染色20分钟。然后在SD中清洗细胞，并在SD中再悬浮1小时，然后观察或转移到缺氮培养基中3小时。使用装有DIC光学器件的Nikon E-800显微镜（纽约花园城）和装有Open的Hamamatsu Orca 2数码相机（新泽西州布里奇沃特）观察细胞实验室3软件。电子显微镜如前所述(阿贝利奥维奇等。, 2000).
结果
抑制Apg1蛋白激酶活性可消除前体Ape1在富培养基中的贩运，但对氮饥饿无反应
为了解决诱导自噬和Cvt途径中对Apg1蛋白激酶活性的要求，我们决定产生一个条件抑制敏感等位基因APG1。因此，我们在Apg1开放阅读框的102位引入了一个突变，用丙氨酸（Apg1）取代蛋氨酸残基M102A型). 该点突变是根据之前对Src和Cdc28的研究设计的，这表明ATP结合囊中这个保守位置的突变可以结合普通Src家族激酶抑制剂PP1的大量类似物（结构如图所示A） ，不能与野生型激酶结合(线路接口单元等。, 1998;主教等。, 2000). 表达Apg1的细胞M102A型而不是野生型蛋白能够在接近正常水平的情况下成熟prApe1（图B） ●●●●。相反，这些细胞中prApe1的成熟被20μM 1-NA-PP1完全阻断，该抑制剂不能取代野生型激酶活性部位的ATP（图B） ；这种浓度的1-NA-PP1对野生型细胞中prApe1的成熟没有影响。正如预期的那样，蛋白激酶分析显示，1-NA-PP1直接抑制由表达apg1型M102A型突变基因（图C） ●●●●。
前体Ape1在apg1型M102A型突变体被1-NA-PP1选择性地抑制。（A） 1-NA-PP1的结构。（B）apg1型Δ（HAY395）酵母细胞携带野生型APG1公司或者是变种人apg1型M102A型pRS415上的基因生长为A6000.5，用或不用20μM 1-NA-PP1处理。将细胞再培养3小时，然后按照材料和方法中的描述进行采集和处理，以进行蛋白质印迹。（C） Apg1激酶活性M102A型被20μM 1-NA-PP1抑制。用抗Apg1抗血清免疫沉淀细胞提取物（每次反应2 mg），并按照材料和方法中的描述，在存在或不存在20μM 1-NA-PP1的情况下检测自身磷酸化活性。
利用该系统，我们能够在体内测定选择性抑制Apg1激酶活性的效果。抑制剂量-反应曲线显示，在标准合成培养基中生长的细胞中，prApe1成熟的半最大抑制发生在～5μM处（SD；图A） ●●●●。然而，如果用1-NA-PP1攻击细胞1小时，然后在相同浓度的1-NA-PP2存在下转移到氮饥饿培养基中，则在100μM以下未观察到抑制作用（图、A和B）。
1-NA-PP1对Apg1激酶的抑制阻断了Cvt通路，但允许prApe1的自噬成熟。（A） 标准生长条件和饥饿条件下1-NA-PP1的剂量反应。apg1型表达Apg1的Δ（HAY395）酵母细胞M102A型从质粒生长到midlog（a6000.5），收集并重新悬浮在指示浓度为1-NA-PP1的SD培养基中。培养1小时后，收集一半细胞培养物，用蒸馏水清洗，并在相同浓度的1-NA-PP1存在下，在氮气饥饿培养基（SD-N）中重新悬浮。在进一步培养3小时后，收集细胞并制备细胞提取物。0.5安600每种提取物的等效物通过SDS-PAGE进行解析，Ape1通过Western blotting进行鉴定。prApe1和mApe1的相对量使用美国伯乐材料和方法中所述的Fluor-S MAX。（B） a.（C）中描述的样本子集的蛋白质印迹。激酶不活跃apg1型K54A公司该突变体在富培养基中的prApe1成熟受阻，但在饥饿条件下不会受阻。apg1型Δ（HAY395）细胞或这些含有质粒携带野生型的细胞APG1公司基因或apg1型K54A公司等位基因生长到midlog，在提取物制备前立即收获或转移到缺氮培养基中3h。用SDS-PAGE和Western blotting检测Ape1。
为了排除氮饥饿导致ATP结合间隙改变导致1-NA-PP1无法抑制酶活性的可能性，我们测试了一个先前表征的激酶死亡突变体的能力(卡马达等。, 2000)是位于54位（K54A）的赖氨酸-丙氨酸替代物，在氮饥饿条件下成熟prApe1。尽管表达Apg1的细胞K54A公司在富含氮的培养基中培养3小时，导致大部分成熟的Ape1（图C） ●●●●。因此，使用两种独立的方法，我们证明了在诱导自噬的条件下，抑制Apg1激酶活性不会显著影响prApe1的成熟。
抑制Apg1激酶活性可实现正常水平的自噬
prApe1在氮饥饿或雷帕霉素存在下的成熟是一种很好的检测方法，可用于诱导Cvt通路中特异性阻断的突变体的自噬贩运。然而，prApe1通过自噬模式成熟并不意味着正常的自噬体正在形成。例如，我们以前已经证明，当自噬在体内被诱导时，会形成异常的自噬体aut7年Δ电池(阿贝利奥维奇等。, 2000). 尽管这些细胞能够在SD-N中部分成熟prApe1，但它们的自噬并不正常。换言之，prApe1在饥饿条件下的成熟并不是完全功能自噬的可靠指标，因为小的异常自噬体和可能减少的正常自噬小体可能能够导入prApe1，但不能维持足够的自噬量以实现生理功能。这是可能的，因为prApe1是自噬体和Cvt小泡的一种特殊载体，并且prApe1具有多余的运输能力，因此尽管自噬反应有部分缺陷，但仍可能发生成熟。
为了更直接地分析这些可能性，我们首先利用体内显微镜检测自噬。Aut7是Cvt囊泡和自噬体的一种成分，由这些运输中间体携带到液泡的管腔中(基里萨科等。, 1999;黄等。, 2000). 表达GFP标记Aut7的细胞在富含氮的培养基中的胞浆中积累了大部分蛋白质。当这些细胞进行自噬时，GFP荧光的大部分被输送到空泡腔(基里萨科等。, 1999;黄等。, 2000). 这使我们能够分析apg1型M102A型在存在或不存在1-NA-PP1的情况下，细胞在氮饥饿时积累空泡GFP。当表达GFP-Aut7的野生型细胞在SD培养基中生长时，GFP荧光主要是细胞溶质的，而在氮饥饿培养基中4小时的转移导致了主要的空泡染色（图A） ●●●●。这种进入空泡腔的转运依赖于Apg1，因为它在apg1型Δ单元。当表达Apg1的细胞M102A型突变体缺乏氮，无论是否用30μM 1-NA-PP1处理，GFP-Aut7都被转运到液泡中（图A） ●●●●。通过检测蛋白酶缺乏菌株中自噬体的外观，得出了相同的结论（未公布的数据；武繁等。, 1992). 为了分析在1-NA-PP1存在下诱导的自噬体的形态，我们使用了一种先前建立的形态学分析，该分析依赖于细胞溶质自噬小体在细胞内的积累蒸汽m3ts秒雷帕霉素在非允许温度下激发细胞(阿贝利奥维奇等。, 1999,2000). 我们发现了蒸汽m3ts秒apg1型Δ承载apg1型M102A型着丝粒质粒上的突变基因在非允许温度下诱导雷帕霉素引起的自噬体，当存在30μM 1-NA-PP1时，这些自噬小体的形态没有改变（图B） ●●●●。因此，抑制激酶活性并不影响自噬体的形态。
细胞内Apg1激酶活性的抑制apg1型M102A型突变体不阻断自噬。（A） 野生型（HAY75、WT），apg1型Δ（HAY395）和apg1型Δ细胞窝藏apg1型M102A型在pRS415上用表达Aut7-GFP的着丝粒质粒（pRS414）在AUT7（自动变速器7）发起人。细胞生长至中对数，用FM 4–64（0.8μM）染色20 min，清洗并在SD培养基中与30μM 1-NA-PP1孵育1 h。然后直接观察细胞或用蒸馏水清洗细胞，并转移到缺氮培养基中4小时，然后通过光学显微镜和荧光显微镜观察。顶部面板：GFP荧光。中间面板：FM 4–64荧光。底部面板：DIC，差分干涉对比。（B） 蒸汽m3ts秒 apg1型Δ菌株（HAY571）apg1型M102A型在pRS415上在26°C下生长到midlog，转移到含有30μM 1-NA-PP1或模拟处理的培养基中1小时，然后转移20分钟到37.5°C。将雷帕霉素添加到0.2μg/ml的最终浓度，并在高锰酸盐固定和电子显微镜检查之前将细胞再培养90分钟，如材料和方法所述。AP，自噬体；M、 线粒体；N、 细胞核；五、 液泡。（C） 第13页Δ第8页Δ60页apg1Δ应变（HAY572）或HAY571细胞apg1型M102A型对质粒进行与（a）中相同的处理，并按照材料和方法中的描述测量提取物中的碱性磷酸酶活性。结果表示来自两个独立实验的重复测量。
一种更定量的自噬检测方法测量细胞溶质蛋白Pho8Δ60进入液泡腔的非特异性摄取(野田佳彦等。, 1995). Pho8Δ60是酵母液泡碱性磷酸酶（由电话8基因）缺乏作为内部未分离信号序列起作用的N末端跨膜结构域。因此，Pho8Δ60不能进入内质网，只能通过自噬传递到液泡。在液泡输送中，C末端前肽被蛋白质水解去除。酶原的活化结果可以通过简单的比色法测定。由于这种蛋白质不是由自噬体或Cvt小泡特异性摄取的，而且只有一小部分Pho8Δ60被输送到液泡，因此成熟的量与输送到液膜腔的“自噬体积”成正比，从而产生定量输出。这使我们能够区分激酶活性是完全多余的诱导自噬，还是在自噬小体的扩大或确定自噬体的数量方面发挥一些促进作用。我们构建了一株表达Apg1的Pho8Δ60菌株M102A型而不是野生型蛋白，并测量了在存在和不存在1-NA-PP1的饥饿条件下碱性磷酸酶活性的诱导。如图所示C、 细胞提取物中碱性磷酸酶活性的诱导apg1型M102A型浓度为30μM的1-NA-PP1未减少细胞数量。相反，它在两个独立的实验中略有增加。因此，根据三个不同的标准，诱导自噬体似乎不需要Apg1激酶活性。
Apg1的C末端受可逆序列影响
Apg1被认为是多蛋白复合物的组成部分(卡马达等。, 2000;斯科特等。, 2000;基姆等。, 2001)尽管这个假定的复合物的确切性质尚未确定。为了更好地理解Apg1在各种生理条件下的物理相互作用，我们用IgG结合域的串联重复序列对Apg1的C末端进行染色体标记金黄色葡萄球菌私人助理。该标签不会干扰Apg1的正常功能，因为prApe1正常成熟，细胞对氮饥饿不敏感（图). 我们推断，从其内源性启动子表达的染色体标签可以更准确地分析蛋白质复合物及其在不同生理条件下的动力学。Apg1蛋白与蛋白质相互作用的分析以前是用过表达的蛋白质对进行的(卡马达等。, 2000;斯科特等。, 2000;基姆等。, 2001). 尽管这种方法可以敏感地检测成对相互作用，但它可能不会产生关于高阶复合物（因为竞争效应）或调节机制（因为饱和）的信息。与蛋白质成对过度表达的研究不同，无论是在检测银染凝胶时，还是在免疫印迹检测过度表达时或在酵母双杂交系统中与Apg1相互作用的特定蛋白质时，我们都无法确定与Apgl共纯化的特定化学计量相关蛋白质。这一结果与全基因组蛋白质相互作用调查中的结果相似酿酒酵母包括Apg1；也就是说，没有发现prA-tagged Apg1的交互伙伴(霍等。, 2002).
Apg1的C末端参与Cvt路径特定的相互作用。（A） 第四人民党ΔApg1-prA菌株（HAY437）表达全长Apg1-prA融合，或第四人民党Δapg1型表达Apg1Δ880截短片段的Δ880-prA菌株（HAY478）在YPD培养基中生长到midlog并转化为球形体。在细胞裂解之前，用0.2μg/ml雷帕霉素或不使用雷帕霉素处理球状体15分钟，并使用IgG sepharose从提取物中纯化Apg1-prA融合物，如材料和方法中所述。通过SDS-PAGE和抗prA抗体免疫检测对提取物中的Apg1-prA进行鉴定和定量。（B） 截短Apg1的最后18个氨基酸会导致Cvt路径特异性表型。这个apg1型Δ850-prA（HAY454），apg1型Δ880-prA（HAY455），apg1型Δ886-prA（HAY518）和全长（FL）Apg1-prA（HAY370）菌株生长至中对数。在提取液制备之前，将每种培养物的一部分转移到缺氮培养基中3小时，另一半直接收获。通过Western blotting（0.5 A）评估前体Ape1成熟度和融合蛋白水平600每车道等效值）。酵母在氮饥饿条件下的存活率是通过在夹竹桃素B板上修补细胞来确定的(Tsukada和Ohsumi，1993年); nd，未确定。（C） 886位的亮氨酸到甘氨酸突变导致Cvt通路特异性表型。重量（HAY75），apg1型N884A号、和apg1型L886G型酵母细胞在SD中培养至中对数，直接收获或首先转移至缺氮培养基中3小时，然后制备提取物。通过Western blotting检测前体Ape1成熟度。（D）apg1型L886G型细胞在氮饥饿时不会丧失生存能力。这个apg1型L886G型（HAY602）和apg1型Δ（HAY395）细胞生长至midlog并转移至缺氮培养基。在指定的时间点，通过去除等分样品并在YPD上镀上适当的稀释液来进行活细胞计数。
令人惊讶的是，我们发现在IgG琼脂糖上纯化Apg1 prA的效率取决于裂解前细胞的生理条件。如果在洗涤剂溶解前用雷帕霉素处理球状细胞15分钟，我们通过免疫印迹观察到纯化的融合蛋白的产量要高得多（图A） 以及银染色（未公布的数据）。这种增加并不反映提取物中Apg1-prA的数量增加，因为提取物中蛋白质的总量是恒定的，与之前的数据一致(松浦等。, 1997). 因此，在没有雷帕霉素的情况下，蛋白A标签被排除在与IgG sepharose的相互作用之外，这表明发生了蛋白修饰，这使得Apg1-prA和IgG sepharose在雷帕霉素治疗后可以相互作用。“线圈”计划(卢帕斯等。, 1991)预测氨基酸序列形成线圈的倾向，给出了Apg1的最后20个氨基酸参与线圈相互作用的合理概率（未公布的数据）。
如果Cvt路径特异性相互作用定位于蛋白的C末端，则可以解释Apg1-prA融合蛋白对雷帕霉素治疗的脱敏反应。如果是这种情况，人们会认为，截断包含最终线圈结构域的C末端氨基酸将导致Cvt路径特异性缺陷表型。事实上，缺失C末端18氨基酸的截短融合蛋白Apg1Δ880-prA在标准培养基中完全被阻断用于prApe1成熟，但显示在饥饿条件下prApe1~50%的成熟（图B） ●●●●。相比之下，截短12个氨基酸Apg1Δ886-prA对prApe1的Cvt运输几乎没有影响，而进一步截短蛋白质到氨基酸850则降低了氮饥饿时的旁路程度，也降低了SD-N板上的存活率（图B） ●●●●。因此，氨基酸880和886之间的残基可能在Apg1的Cvt途径功能中具有特定作用。与此一致，我们发现氨基酸886（L886G）的亮氨酸到甘氨酸突变导致了Cvt路径特异性阻滞（图C） ●●●●。此外apg1型L886G型该突变体在氮饥饿条件下的存活率没有缺陷，证实了该突变体中的自噬功能（图D） ●●●●。虽然880位的截断突变似乎对自噬旁路有一定影响，但L886G突变体在饥饿时基本上表现为完全旁路和prApe1成熟。与甘氨酸替代相比，Apg1 880-886区域的丙氨酸替代对prApe1成熟几乎没有影响（图C、 未发布的数据）。这与该区域的α螺旋构象要求一致，并符合Coils程序的预测，即Apg1的极端C末端形成一个线圈结构。
Apg13具有自噬特异性功能，是1-NA-PP1介导的Apg1抑制的自噬旁路所必需的M102A型
因为apg1型Δ880突变体在Cvt途径中被阻断，饥饿在很大程度上绕过了这种阻断，我们使用这种表型来测试与Apg13的遗传相互作用，Apg13是一种在自噬条件下优先与Apg1结合的蛋白质(富名腰等。, 1997;卡马达等。, 2000)被认为是Apg1功能所必需的。Apg13在apg1型Δ880截断突变菌株对prApe1在SD培养基中的成熟没有影响，但在氮饥饿条件下显著提高了旁路效率（图A） ●●●●。这强烈表明，Apg13对Apg1功能的影响是在自噬条件下发挥的，而不是在富氮培养基中发挥的，这支持了先前的研究结果，即在诱导自噬时，这两种蛋白质之间的相互作用增加了(卡马达等。, 2000). 证实这一点apg1型Δ2013年4月880日Δ双突变体在所有情况下都不能使Ape1成熟。这个apg13型在SD培养基中，Δ单个突变体在prApe1成熟过程中仅轻微受损，表明apg1型Δ2013年4月880日绕过prApe1阻滞的Δ双突变是由于自噬缺陷，而不是Cvt途径。
Apg13具有自噬特异性功能。（A） 对数增长apg1型Δ880（HAY455），apg13型Δ（ResGen）或apg13型Δapg1型Δ880（HAY487）包含或不包含亚太13国集团多拷贝质粒上的基因要么直接收获，要么先转移到缺氮培养基中，然后收获。制备蛋白质提取物，并通过Western blotting检测Ape1。（B） 在20μM 1-NA-PP1存在下，prApe1的饥饿依赖性成熟需要Apg13。apg1型Δ（HAY395）或apg1型Δapg13型Δ（HAY603）电池携带apg1型M102A型pRS415上的基因生长到midlog，用或不用20μM 1-NA-PP1处理1h，在制备蛋白提取物和SDS-PAGE之前，或者在1-NA-PP存在下饥饿氮气，或者允许在SD培养基中再停留3h。用Western blotting检测Ape1。
为了进一步测试Apg13是否通过改变Apg1激酶活性发挥作用，我们构建了一个apg1型M102A型 apg13Δ突变株。如果没有1-NA-PP1apg1型M102A型 apg13Δ应变的行为与apg1型M102A型该菌株能够在饥饿条件下成熟prApe1。然而，在双突变菌株中，这种成熟被1-NA-PP1处理完全阻断（图B） ●●●●。因为我们之前的实验表明，Cvt途径的诱导，而不是自噬，取决于Apg1激酶的活性，这一结果表明apg13型饥饿条件下的Δ背景由（Apg13非依赖性）Cvt途径进行。换句话说，Apg13似乎是自噬所必需的，但对Cvt途径不是必需的，类似于Apg17(卡马达等。, 2000). 此外apg1型M102A型 apg13Δ当在饥饿条件下用1-NA-PP1处理细胞以克服prApe1缺陷时，证实了饥饿诱导的旁路apg1型M102A型单元格（图)是Apg13依赖性的，是由自噬引起的。最后，因为Apg13依赖的旁路apg1型M102A型细胞在1-NA-PP1存在下发生，Apg13在诱导自噬期间对Apg1功能的影响在很大程度上独立于激酶活性。因此，Apg1在自噬中的激酶依赖性功能需要完整的Apg13。
Apg1沉积物是一种33S复合物，在雷帕霉素处理后转变为25S
Apg1是诱导自噬所必需的(松浦等。, 1997;卡马达等。, 2000). 然而，我们的数据表明，Apg1在这一过程中具有非催化（或非激酶）作用。一种可能的解释是，从Cvt到自噬性贩运的转变涉及Apg1的结构改变，不需要激酶活性。为了确定是否发生这种结构变化，我们分析了用雷帕霉素预处理或模拟处理的提取物中Apg1-prA融合的流体力学特性。表达全长染色体标记的Apg1-prA融合蛋白的酵母细胞转化为球形体，并在洗涤剂溶解前用或不用雷帕霉素激发15分钟。以100000×克15分钟以避免聚集，然后通过5–20%蔗糖梯度离心分离（见材料和方法）。未经处理的细胞沉积物中的Apg1-prA为33S颗粒。相反，在雷帕霉素处理的细胞提取物中，蛋白质可重复地转移到沉淀曲线上，在25S处出现峰值，这意味着发生了结构变化（图).
自噬诱导后，Apg1发生结构变化，并依赖于Cvt9和Apg1的C末端。Apg1蛋白A第四人民党Δ（HAY437），Apg1Δ880-蛋白A第四人民党Δ（HAY478）和Apg1-蛋白Acvt9型Δ第四人民党Δ（HAY591）菌株在YPD中生长到midlog并转化为球形体。球状体在裂解前用或不用雷帕霉素（0.2μg/ml）处理15分钟。通过差速离心在100000×克持续15分钟，并加载到5-20%蔗糖梯度上。梯度在259000×克在7小时内，用10%TCA沉淀级分，并用抗prA抗血清通过蛋白质印迹鉴定Apg1 prA，并使用美国伯乐Fluor-S MAX。在野生型细胞中观察到的两个峰值的迁移由垂直虚线表示（对于慢速和快速移动的成分，分别计算为25S和33S）。
与图中显示的取消请求数据一致，截短的融合蛋白Apg1Δ880-prA在未经处理的提取物中沉淀在～25S处，并且在雷帕霉素处理后沉淀曲线没有发生变化（图)，证实C末端18个氨基酸对Cvt路径特异性相互作用很重要，这种相互作用在诱导自噬后被消除。我们还测试了Apg1-prA在cvt9型Δ电池（图). Cvt9是一种在Cvt途径中特异需要的蛋白质，并且已经证明当这两种蛋白质都过表达时，它会与Apg1共沉淀(基姆等。, 2001). 我们发现Apg1 prA的沉积剖面在cvt9型Δ单元。因此，Cvt9似乎参与了有助于Apg1功能的结构变化，并且该蛋白似乎在Apg1上游发挥作用。因为Cvt9似乎不是Apg1复合物的化学计量成员，它很可能通过催化作用或短暂结合发挥这种作用。
尽管Apg1与Cvt9成对相互作用(基姆等。, 2001)Apg1和Apg13(卡马达等。, 2000)有报道称，当这些蛋白从多拷贝质粒中过度表达时，我们和其他人都无法确定在没有过度表达的情况下用Apg1纯化的化学计量相关蛋白(霍等。, 2002; 未发布的数据）。因此，我们测试了Apg1是否自我交互。我们发现，Apg1的C末端非催化结构域在双杂交分析中自我相互作用（未发表的数据）。然而，由于全长Apg1构建了自动激活转录，我们无法利用全长蛋白进一步推断这种自我作用的结构-功能关系。因为除了Apg1本身之外，似乎没有其他蛋白质在化学计量学上被包括在复合物中，我们推测沉降行为的变化要么是Apg1分子本身构象变化的结果，要么是每个复合物分子数量的变化，要么是这两种效应的结果。
Apg1Δ880蛋白低磷酸化
Apg1在体内是一种磷酸蛋白，在体外是自身磷酸化物。自噬诱导后，Apg1的磷酸化水平下降，这反映在自噬降低(松浦等。, 1997). 对我们的数据的一种解释是，自磷酸化控制着Apg1中依赖于C末端的结构变化。因此，缺乏C-末端线圈结构域的突变体将停留在“自噬模式”中，并且在没有饥饿或雷帕霉素治疗的情况下无法成熟prApe1。因此，我们测试了在雷帕霉素存在和不存在的情况下Apg1Δ880的磷酸化状态。尽管全长Apg1-prA被磷酸化，并且在雷帕霉素的作用下经历去磷酸化（约50%），如之前报道的那样(松浦等。, 1997)，Apg1Δ880突变体在所有条件下都强烈地低磷酸化（图). 因为该突变株也在蔗糖梯度中沉淀为25S物种（图)，这再次与自磷酸化对Apg1的Cvt通路竞争模式而非自噬模式的重要性相一致。尽管氨基酸880和886之间的区域含有丝氨酸残基，但丙氨酸突变并不影响prApe1的成熟（未发表的数据），这意味着apg1型Δ880突变并非直接由于该氨基酸缺乏磷酸化。
Apg1Δ880突变体被低磷酸化。表达全长prA-tagged Apg1（HAY370）或Δ880截断融合到prA（HAY455）的细胞生长到中对数，并用150μCi标记32在用0.2 ng/ml雷帕霉素或模拟溶液治疗前，P治疗1小时。在雷帕霉素暴露20分钟后，制备蛋白质提取物，并按照材料和方法免疫沉淀Apg1。用SDS-PAGE分离一半免疫沉淀物（IP）并进行磷光成像，同时分离另一半，转移到硝酸纤维素中，并对Apg1进行免疫印迹。
讨论
Apg1在Cvt途径中起催化作用，在自噬中起非激酶作用
自噬是一种依赖于信号转导事件的分解代谢膜转运现象。Apg1蛋白激酶在诱导自噬中起核心作用，也是细胞质-空泡靶向（Cvt）这一相关的构成性转运途径的关键。根据目前的模型，自噬的诱导破坏了Cvt通路的机制，从而形成自噬体。在本文中，我们描述了在诱导自噬时发生的Apg1分子变化的实验证据，证实了这些假设。我们发现，尽管Apg1的激酶活性在Cvt途径中是必需的，但在诱导自噬体时，它并不是必需的，或者说没有明显的必要。另一方面，沉积速度研究表明，自噬体的诱导伴随着Apg1的结构变化，这些变化与去磷酸化有关。
蛋白激酶可以被认为具有不同类型的细胞功能。经典地，如胰高血糖素受体/cAMP依赖性磷酸化级联反应所示，激酶通过改变其活性以响应上游刺激和磷酸化不同底物蛋白来传递“信号”。因此，底物执行调节过程，而激酶充当能够放大信号的中介。然而，最近出现了一些不同的例子。当将模拟敏感方法应用于酵母中的Cdc28蛋白激酶（一种细胞周期依赖性激酶）时，发现G需要激酶活性2/与温度敏感等位基因的研究相比，M转换显示G1(主教等。, 2000). 类似地，Cla4的类似物敏感等位基因在肌动蛋白极化中没有表现出对激酶抑制的反应异常，而Cla4缺失的突变体确实表现出这种异常(韦斯等。, 2000). 有人认为，这些差异源于这些蛋白的激酶依赖性功能，很可能是作为结构支架(主教等。, 2001).
Apg1是一种蛋白激酶，对两种相关的膜转运现象、自噬和Cvt途径至关重要(哈丁等。, 1996;松浦等。, 1997). 为了更好地了解这种蛋白激酶的作用，我们创建了一个类似物敏感等位基因APG1公司对1-NA-PP1特别敏感。引人注目的是，1-NA-PP1抑制了prApe1的Cvt通路依赖性成熟，但在浓度超过表面IC的20倍时，没有抑制prApel的自噬或自噬贩运50用于抑制Cvt途径。在这些浓度下，我们可以预测激酶的ATP结合位点的饱和度。因此，如果激酶活性在自噬反应中至关重要，我们应该观察到自噬贩运的抑制作用。为了进一步测试这一点，我们构建了一种激酶死亡突变形式的Apg1，其想法是它将模拟激酶抑制的“滴定终点”。尽管激酶死亡突变可能对Apg1的功能有其他影响，但在检测prApe1成熟时，它大体上用类似物敏感抑制重述了这些发现。这使我们认为Apg1具有激酶依赖性和依赖性功能。Apg1激酶活性在Cvt途径中是必需的，但在诱导自噬中并非绝对必要。
激酶死亡的Apg1K54A公司之前通过诱导ph8Δ60碱性磷酸酶活性测定，突变体的自噬反应降低(卡马达等。, 2000)，尽管它在磷酸化测定中是完全无活性的。我们可以将这种明显的差异与我们的抑制研究合理化（这些研究没有显示出这种影响；图)因为Apg1K54A公司激酶突变体是构成性非活性的，允许次级间接效应影响其维持自噬的能力。因此，在我们的分析中，这取决于prApe1的成熟度（图C） ，我们在Apg1中没有看到这种下降K54A公司这是因为prApe1的贩运对自噬反应幅度的定量变化不太敏感，因为自噬体具有多余的运输prApe1的能力(阿贝利奥维奇等。, 2000). 此外，蛋白激酶A的类似突变显示增加了K米至少增加五倍，因此会对蛋白质结合的核苷酸数量产生影响。如果结合的ATP/ADP的量本身影响Apg1功能（与激酶活性相反），那么我们也可以解释在添加饱和量的1-NA-PP1（一种核苷酸类似物）后，在抑制剂敏感突变体中观察到的自噬贩运的轻微增加。
以前对Apg1及其功能的研究没有就激酶活性的作用达成共识。松浦等。(1997)据报道Apg1是自磷酸化的，并且自磷酸化被自噬的诱导强烈抑制。这与报告相比卡马达等。(2000)这表明，诱导自噬需要增加Apg13与Apg1的亲和力，并与体外测定的针对外源底物髓磷脂碱性蛋白的激酶活性增加相关。因此，一份报告暗示激酶活性降低（朝向内源性底物Apg1），而另一份报告则表明在自噬条件下激酶活性增加（朝向髓磷脂碱性蛋白）。我们的数据与之前的报告更为一致，因为抑制激酶活性对自噬没有影响，但完全阻断了Cvt通路。因为我们的结果还证明了Apg1的三级/四级结构发生了变化，所以外源性底物（髓鞘碱性蛋白）的进入可能在富质培养基中的细胞提取物中受到限制，而饥饿细胞提取物中的进入可能增加，很像Apg1上的C末端prA标签，在营养细胞的提取物中无法完全获得。有趣的是，绕过Cvt途径1-NA-PP1阻断的饥饿依赖性prApe1成熟依赖于Apg13。这意味着旁路依赖性成熟反映了自噬性贩运，因为它需要一个自噬特异性因子。此外，它还表明，Apg13在自噬中的部分功能不涉及Apg1的激酶活性。
Apg1的构象变化通过C末端介导
我们在这里提出的第二组数据表明，Apg1在饥饿刺激下发生构象变化，蛋白质的C末端在介导这些变化中很重要。因此，这些结构变化很可能在诱导自噬中很重要。为了进一步描述这些变化，我们试图通过IgG sepharose色谱法来纯化Apg1相关因子，但这些努力都没有成功，最近一项从酵母中纯化prA标记蛋白的全基因组研究也得出了类似的结论(霍等。, 2002). 因此，正如自磷酸化数据所表明的那样，Apg1可能主要与自身相互作用，并且与酵母双杂交系统和过表达蛋白观察到的其他蛋白质的相互作用反映了瞬时或非化学计量相互作用。事实上，双杂交分析表明，Apg1的非催化区与自身相互作用（未公布的数据）。然而，当融合到DNA结合域时，全长蛋白会自动激活转录，这就排除了C末端特定亚区作用的简单结构-功能相关性。
Apg1中氨基酸880–886区域对Cvt途径至关重要，似乎是自我结合所需的潜在卷曲-卷曲结构域的一部分。Apg1Δ880截断突变沉淀物在25S的事实表明，Cvt途径模式和Apg1自噬功能之间的转换涉及Apg1自组装程度的变化。向自噬的转化伴随着自噬减少，这将解释自噬诱导后Apg1磷酸化减少的原因，如图所示事实上，Apg1Δ880突变体是低磷酸化的，这强烈表明是自组装决定了自磷酸化活性，而这反过来又有助于确定蛋白质的功能状态。
我们的数据与之前的研究结果一致，符合以下模型：在饥饿或雷帕霉素刺激下，诱导了一种信号转导机制，通过上游因子（如Apg13）状态的改变介导Apg1的结构变化。这些变化使自噬体成核，而不是Cvt小泡成核（图). 这些结构变化如何与磷酸化联系起来？我们提出，可能需要自身磷酸化活性才能将Apg1“冻结”在Cvt途径的能力状态。作为对自噬刺激的反应，激酶活性被抑制（或磷酸酶活性被刺激），Apg1被去磷酸化。这导致转化为第二种结构状态，这种状态与自噬贩运兼容，但与Cvt贩运不兼容。Cvt9是一种在Cvt途径中特别需要的蛋白质，但不用于自噬，我们发现在缺乏Cvt8的细胞中，Apg1不进行这种结构转换。综上所述，这些结果暗示了Cvt9在Apg1功能上游的作用，尽管Cvt8似乎并不需要用于Apg1的磷酸化（未发表的数据）。
激酶活性和自噬体成核之间的机械耦合模型。在正常生长条件下，Tor激酶活性通过调节Apg13磷酸化或直接作用于Apg1，诱导Apg1激酶自动磷酸化。Tor的抑制导致Apg13的部分去磷酸化，Apg1激酶的自磷酸化减少，导致去磷酸化和Apg1的结构改变。这种结构变化与Apg13的相互作用增加有关，涉及Cvt9。当与Apg13结合时，Apg1的去磷酸化形式指导自噬体的形成，而磷酸化形式则指导Cvt小泡的成核。
根据Pho8Δ60分析和在无液泡蛋白酶活性的情况下测量自噬体的积累，Apg13绝对是自噬所必需的(富名腰等。, 1997以及我们未发表的观察结果）。在这项研究中，我们表明，Apg13不是通过Cvt途径贩运prApe1的绝对必要条件，而是将Apg1从激酶依赖模式转换为激酶依赖自噬模式所必需的（图). 对这些结果的一种解释是，Apg13是在（激酶依赖性）Cvt模式和（激酶非依赖性）自噬模式之间切换系统的切换机制的一部分。在没有Apg13的情况下，系统不能被分流到自噬模式，因此对Apg1激酶抑制剂仍然敏感。
酵母自噬的一个基本问题与Cvt途径的关系有关。已经提出了几种可能性。一种假设表明，这两种途径之间的差异仅在于Cvt小泡的大小与自噬体的大小。这种观点与Cvt路径特异性基因的存在不一致，而Cvt是不需要自噬的无级变速器形成自噬体而非Cvt小泡的突变体。此外，还有一些基因，如亚太17国集团和第12节是自噬所必需的，但不是Cvt途径所必需的亚太13国集团在我们手中，prApe1在SD培养基中成熟只需要少量的。因此，这些途径之间存在基本的遗传差异，这些差异与prApe1在Cvt囊泡和自噬体中隔离之前的早期事件有关。沿着这些路线，SNARE机制的一些元素仅在Cvt途径中需要，而在自噬中不需要(阿贝利奥维奇等。, 1999)这意味着两种途径的膜贩运要求存在一些基本差异。这些途径是同时激活的吗？我们的结果表明，在诱导自噬后，参与这两种途径的单一蛋白Apg1发生结构变化。这些数据表明，自噬体和Cvt小泡的成核之间存在着质的差异，并支持一种触发机制，即两种途径共有的机制被Apg特异性因子（如Apg13）激活，并分流到自噬体形成中。
