美国国家科学院院刊。2003年2月18日；100(4): 1711–1716.
MEF2和HDAC5对过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）和线粒体功能的调节
,* ,* ,†和*‡
迈克尔·P·楚布里特
*德克萨斯大学西南医学中心分子生物学系，德克萨斯州达拉斯哈里·海恩斯大道6000号，邮编75390-9148；和†纽约大学医学院心脏科，纽约州纽约市第一大道550号，OBV-A615，邮编：10016
约翰·麦卡纳利
*德克萨斯大学西南医学中心分子生物学系，德克萨斯州达拉斯哈里·海恩斯大道6000号，邮编75390-9148；和†纽约大学医学院心脏科，纽约州纽约市第一大道550号，OBV-A615，邮编：10016
格伦·菲什曼
*德克萨斯大学西南医学中心分子生物学系，地址：6000 Harry Hines Boulevard，Dallas，TX 7590-9148；和†纽约大学医学院心脏病学系，550 First Avenue，OBV-A615，New York，NY 10016
埃里克·N·奥尔森
*德克萨斯大学西南医学中心分子生物学系，德克萨斯州达拉斯哈里·海恩斯大道6000号，邮编75390-9148；和†纽约大学医学院心脏科，纽约州纽约市第一大道550号，OBV-A615，邮编：10016
*德克萨斯大学西南医学中心分子生物学系，德克萨斯州达拉斯哈里·海恩斯大道6000号，邮编75390-9148；和†纽约大学医学院心脏科，纽约州纽约市第一大道550号，OBV-A615，邮编：10016
Eric N.Olson撰稿
摘要
肌细胞增强因子-2（MEF2）转录因子调节肌肉发育和钙依赖性基因表达。MEF2活性受到II类组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的抑制，当在两个丝氨酸残基上磷酸化以响应钙信号时，HDAC与MEF2分离。为了探讨心脏中MEF2/HDAC相互作用的潜在重要性，我们制作了在心脏特异性和强力霉素诱导调节下表达HDAC5信号抑制形式的转基因小鼠。转基因表达导致雄性小鼠猝死，伴随着心肌线粒体的丢失和形态学改变以及线粒体酶的下调。转录辅激活因子PGC-1α是线粒体生物生成和脂肪酸氧化的主要调节因子，在HDAC5表达的反应中也下调。检查前列腺素C-1α启动子揭示了两个MEF2结合位点，它们介导MEF2的转录激活和HDAC5的抑制。这些发现确定前列腺素C-1α是MEF2/HDAC调节通路的关键靶点，并证明了该通路在维持心肌线粒体功能中的重要性。
核小体组蛋白的乙酰化是基因表达调控的核心机制。组蛋白乙酰化放松染色质，允许转录机制进入DNA的特定区域。这个过程的控制受到严格的调控，可以以特定和定向的方式影响单个基因(1). 组蛋白乙酰转移酶对组蛋白的乙酰化作用与基因表达的激活有关。相反，基因抑制是通过组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）实现的(2).
哺乳动物细胞中的HDAC基于蛋白质结构和与酵母HDAC的同源性包括三个不同的类别。I类和III类HDAC广泛表达，而II类HDAC在横纹肌和大脑中高度富集(2). II类HDAC（HDAC4、5、7和9）抑制肌细胞增强因子-2（MEF2）转录因子的转录活性，这些转录因子也在肌肉和大脑中高度表达(三). 通过对两个保守的丝氨酸残基上的HDAC进行磷酸化，可以减轻这种抑制，从而为14-3-3伴侣蛋白创建对接位点，该蛋白介导II类HDAC从细胞核外的移位(4). HDAC5中这些丝氨酸残基突变为丙氨酸，阻止14-3-3结合并输出到胞质溶胶(4–6). 这种抗信号HDAC突变体，我们在这里称之为HDAC5S/A，是MEF2信号传导的主要负调控因子，因为它结合并抑制MEF2因子，但不能从细胞核输出。由于组蛋白乙酰转移酶（HAT）和HDAC竞争MEF2上的相同结合位点，II类HDAC也可能抑制HAT与MEF2的结合以及随后的组蛋白乙酰化(7). 新生大鼠心肌细胞中HDAC5S/A的表达防止激动剂诱导的肥大和胎儿心脏基因程序的激活(8). 最近的证明支持了II类HDAC可能抵消肥厚信号的观点，即HDAC9公司突变小鼠对肥厚刺激的反应过度(8).
为了进一步研究HDAC5在心脏功能中的重要性，我们构建了携带多西环素（DOX）诱导的心脏特异性转基因小鼠，该转基因小鼠编码HDAC5S/a信号耐受突变。因为这个突变体能够有效地抑制MEF2反式激活(4)，我们假设这将使我们能够更清楚地识别MEF2/HDAC靶点，而不存在可能改变内源性HDAC5活性的未知激酶和磷酸酶的并发症。成年心脏中HDAC5S/A的表达导致雄性小鼠猝死，伴有线粒体结构的严重异常和线粒体酶和转录辅激活物过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）γ辅激活物1α（PGC-1α）的下调。PGC-1α协同激活许多参与代谢的转录因子，包括MEF2，并且心脏特异性PGC-1β过度表达足以诱导线粒体生物发生(9–11). 我们表明前列腺素C-1α上游区域介导MEF2的转录反应性和HDAC5的阻遏，确定MEF2/HDAC通路是MEF2和HDAC的关键调节因子前列腺素C-1α基因与心脏线粒体生物发生。
方法
转基因动物的产生。
我们将含有氨基酸259和498处丝氨酸-丙氨酸突变的人类HDAC5的cDNA克隆到四环素（tet）反应性pUHG-10载体中，以生成tetHDAC5S/A载体(4). 将该载体注入B6C3F1小鼠卵母细胞并植入替代雌性ICR小鼠。将转基因后代培育成α-肌球蛋白重链（MHC）-tet反式激活剂转基因小鼠，同时在水中接受200μg/ml DOX(12). 根据需要给动物注射DOX。所有的动物实验方案都得到了德克萨斯大学西南医学中心动物护理和使用委员会（Institutional animal Care and Use Committee of Texas University of Southwestern Medical Center）的批准。
组织学和显微镜。
在光学显微镜下，心脏在10%福尔马林中固定过夜，然后嵌入石蜡，在5μm处切片，并用苏木精/伊红染色。或者，用抗FLAG一级抗体（20μg/ml；Sigma–Aldrich）和山羊抗鼠异硫氰酸荧光素结合二级抗体（1:1000；加利福尼亚州伯灵盖姆Vector Laboratories）对切片进行免疫染色。对于透射电子显微镜，心脏在4°C的PBS中的3%戊二醛中固定过夜，然后在1%OsO中固定4并在乙醇系列中脱水。然后将样品嵌入Spurr树脂中（Ted Pella，Redding，CA），用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色，并在80 nm处切片。
Western Blot分析。
通过在含有完整蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics）的裂解缓冲液（PBS，0.1%Triton X-100/1 mM EDTA，pH 7.4）中均质，从心脏中分离出蛋白质。在Sequi-blot聚二氟乙烯膜（Bio-Rad）上进行电泳和印迹后，用抗FLAG抗体和辣根过氧化物酶结合二级抗体（Amersham Pharmacia Biosciences）对印迹进行探测。使用Western blotting Luminol试剂（Santa Cruz Biotechnology）检测信号，然后将印迹暴露在BioMax胶片（Kodak）上。
细胞培养和荧光素酶测定。
COS细胞保存在DMEM中10%的FBS中。Fugene 6（Roche Diagnostics）用于所有转染。小鼠ATG翻译起始密码子上游的第一个3.1kb基因组序列前列腺素C-1α从BAC RPCI23–260A10（CHORI-BacPac，加利福尼亚州奥克兰；网址：www.chori.org)通过高保真度PCR和TA克隆到pCRII TOPO载体中（上游引物：5′-GGGGGTACCCCATTTGGGAATCCTCTATACAAAGTTG-3′；下游引物：5′-GAGATCTTCCCAGCTCGATGACG-3′），然后亚克隆到pGL3碱性萤光素酶报告载体（Promega）中。使用QuikChange试剂盒（Stratagene）通过引物对该报道者进行定点突变，在两个假定的MEF2结合位点（MEF2位点1末端：5′-AAGACAGAGAGAAATA）引入几个A/T到C/G突变科科斯群岛自动变速箱G公司GAAACTGCCTGGGGAG-3′；MEF2位点2-近端：5′-ATGGTCTTTATAATAATA对吨C类TAGATGCATAGGGACTT-3′；突变处有下划线）。使用试剂盒（Promega）对COS细胞裂解物进行荧光素酶分析。如前所述，从新生大鼠幼崽中分离出心肌细胞(8). 分离后，将细胞培养过夜，然后在无血清培养基中用编码巨细胞病毒（CMV）-GFP或CMV-HDAC5S/A的腺病毒以50/细胞的多重感染率感染，或者不感染(8). 感染后，细胞在无血清培养基中培养24小时，然后收获用于RNA分离。
电泳凝胶流动性转移分析。
双品牌低聚物被标记为[32P] 使用Klenow DNA聚合酶进行dCTP。将标记的低聚物与转染GFP或MEF2C表达质粒的COS细胞提取物孵育，并按照所述进行凝胶迁移率测定(13). DNA-蛋白质复合物在6%丙烯酰胺凝胶上溶解，并暴露在BioMax膜上。
RNA分析。
使用Trizol（Invitrogen）从小鼠中分离出心脏总RNA。然后在Affymetrix U74Av2微阵列上分析每个样本组三只动物的20μg等分样品。通过半定量RT-PCR进一步表征差异表达RNA的子集。简单地说，使用SuperScript First-Strand Synthesis试剂盒（Invitrogen）从每个样本中提取2μg RNA来生成cDNA。PCR是通过使用每个感兴趣基因的特异性引物进行的，产品标记为[32P] 数字CTP。确定每个产品的循环参数，以确保反应的线性，并将缺乏逆转录酶的反应作为阴性对照进行。PCR产物在6%丙烯酰胺天然凝胶上溶解，并暴露在BioMax膜上。大鼠新生心肌细胞的半定量RT-PCR和染色质免疫沉淀法（ChIP）分离的DNA也遵循类似的方案。
炸薯条。
腺病毒感染后，通过使用商业试剂盒和抗乙酰基孕酮H3抗体（纽约州普莱西德湖Upstate Biotechnology）制备新生大鼠心肌细胞以进行ChIP检测。ChIP后，通过苯酚/氯仿提取纯化DNA，并按照上述方法进行PCR。
结果
转基因HDAC5S/A小鼠的产生。
我们的最初目标是在心脏中表达抗信号HDAC5蛋白HDAC5S/A，并确定其对心脏基因表达的影响。在α-MHC启动子的控制下，试图生成HDAC5S/A转基因小鼠的尝试失败，这表明HDAC5突变体的组成性高表达导致了致命性（T.A.McKinsey和E.N.O.，未发表的结果）。因此，我们纳入了一个tet-off诱导系统，在该系统中，在tet类似物DOX存在时，转基因表达被抑制，但在停药后被诱导(12). 将FLAG标记的HDAC5S/A克隆到tet-responsive表达载体中，以生成tetHDAC5小鼠系。该系与含有tet反式激活子的转基因小鼠杂交(tTA公司)受α-MHC启动子控制的基因（α-MHC tTA小鼠）提供心脏特异性表达(12).
我们通过Western blot分析心脏提取物在DOX存在或不存在的情况下的总蛋白，确认HDAC5S/A的表达。DOX存在时未检测到转基因表达（图。一)或肝脏等非心脏组织（数据未显示）。DOX停药后5天内达到最大转基因表达。使用抗FLAG抗体对心脏切片进行免疫组织化学染色，发现DOX停药后心脏细胞核染色强烈（图。B类). DOX停药后小鼠总RNA的微阵列分析显示HDAC5表达增加了3.5倍，但HDAC1、2、3或6的表达水平没有变化（见下文）。
DOX诱导的HDAC5S/A小鼠中HDAC5S/A表达的特征。(一)停药前后α-MHC-tTA/tetHDAC5S/A双转基因小鼠等量心脏总蛋白的Western blotting。(B类)停药前后双转基因小鼠心脏切片FLAG-HDAC5S/A的免疫组织化学染色。
HDAC5S/A小鼠的心脏猝死和线粒体缺陷。
携带α-MHC tTA和tetHDAC5S/A转基因的小鼠在DOX上维持时是正常的。然而，DOX的退出导致7–10天内100%的雄性小鼠死亡（图。一). 相反，雌性转基因小鼠在DOX停药后存活≈30天，表明对HDAC5S/A的反应具有性别特异性。鉴于PPARα缺陷小鼠的表型，这种性别二分法特别有趣。通过治疗抑制线粒体脂肪酸输入PPAR（购电协议）α−/−服用依托莫西尔的小鼠导致100%的雄性小鼠死亡，而雌性小鼠的死亡率为25%，但雌激素治疗使雄性小鼠的死亡率恢复到雌性小鼠的水平(14). 在我们的研究中，女性寿命延长的机制目前正在研究中。死亡前两天，雄性老鼠变得极度昏昏欲睡，不再梳理自己或对处理作出反应。通过心电图记录测量，未麻醉动物的心率下降至每分钟约230次，而正常室友的心率大于600次。从DOX中取出的转基因雄性小鼠死亡时，其心身重量比没有变化。
HDAC5S/A小鼠的心脏和线粒体异常。(一)第0天停药前后雄性和雌性HDAC5S/A小鼠的生存曲线。转基因激活导致10天内100%表达HDAC5S/A的雄性小鼠死亡(n个=每组6名男性或女性）。方形，雄性；三角形，雌性；填充符号，+DOX；开放符号，−DOX。(B类)停药前后双转基因小鼠的心脏切片苏木精/伊红染色。箭头表示心肌细胞死亡或脱落的区域。箭头表示炎症细胞浸润。放大倍数为×40。(C类)停药前后双转基因小鼠线粒体的透射电镜照片。（巴=500 nm英寸上部和100 nm英寸下部.) (D类)对照小鼠心脏切片的透射电子显微照片(左侧)或在停用DOX 5天后从转基因小鼠中提取。（Bar=1μm）箭头表示脂质体。
心脏组织切片的组织学检查显示，去除DOX后，雄性小鼠的心脏出现了细胞坏死和炎症的迹象（图。B类). 雌性小鼠死亡时的心脏显示出高水平的胶原沉积，并表现出扩张型心肌病（数据未显示），这表明其发病过程与雄性不同。
通过透射电子显微镜对雄性小鼠心脏组织切片的进一步检查显示线粒体形态发生了显著变化（图。C类). 停药8天后，小鼠线粒体嵴高度紊乱，可见大面积起泡。这些变化导致线粒体失去电子致密染色，在低倍镜下很容易看到（图。C类). 这些小鼠的线粒体出现肿胀，比对照组大60%以上（平均线粒体面积：0.76±0.42μm2与0.47±0.24μm2分别为，P（P）< 0.0001;n个= 680–820). 来自不含DOX的动物的心脏也含有显著更少的线粒体（每场86±24个线粒体，而对照组为137±26个，P（P）< 0.01; 场尺寸=264μm2;n个=6个字段）。
透射电子显微照片还显示了DOX停药后转基因小鼠心脏中脂质体形成的异常模式。对照组动物心脏中的脂质体相对较少，但在停药后5天，脂质体数量急剧增加（图。D类). 在此阶段，线粒体形态正常。停药8天后，脂质体的增加被逆转（对照组每场2.8±1.5脂质体，而5天后为10.7±4.5脂质体，P（P）<0.05，8天时为1.7±1.0；场尺寸=264μm2;n个=6–12个字段）。
HDAC5S/A小鼠心脏基因表达异常。
从DOX中取出的小鼠的线粒体异常和行为与心脏能量储备的丧失和心力衰竭一致，这是可能的死亡原因。为了进一步研究这种表型的基础，我们从8天内从DOX中取出的小鼠和接受DOX的小鼠中分离出心脏总RNA，并使用Affymetrix U74Av2微阵列分析基因表达水平（图。). 用半定量RT-PCR检测基因子集的表达。特别令人感兴趣的是线粒体脂肪酸氧化途径中许多基因表达水平的变化。
DOX停药后PGC-1α和代谢酶表达的抑制。通过微阵列或半定量RT-PCR分析HDAC5S/A小鼠心脏的总RNA。图表中显示了参与心脏能量代谢途径的一组酶的基因表达的折叠变化（+DOX小鼠vs.−DOX），以及通过RT-PCR获得的每个转录物的条带图像。NS，无明显变化；BD，低于检测限；ND，未确定；M-CPTI，肌肉型肉碱棕榈酰转移酶I；CPTII，肉碱棕榈酰转移酶II；中链酰基辅酶A脱氢酶；ACS，酰基辅酶A合成酶；OH长链酰基辅酶A脱氢酶；FAT/CD36，脂肪酸转定位酶；酰基辅酶A氧化酶；糖原磷酸化酶。星号表示PPARα调节的直接靶点；交叉表示受PGC-1α调控的基因。
PGC-1α是线粒体生物发生和功能的关键调节因子，在停药后小鼠体内显著下调，与观察到的线粒体病理学一致。我们还检测了PPARα和PPARγ的表达，这两种核受体分别调节脂肪酸氧化和脂肪生成相关酶的表达。PPARα的表达没有变化，但PPARγ的表达在停药后上调，PPARγ通常在心脏中以非常低的水平表达。这可能是由于脂肪酸氧化途径受到抑制（见下文），导致心脏中存在过量的未氧化脂肪酸，因为脂肪酸水平的增加可能会上调PPARγ的表达(15–17). PPARγ的上调可能是转基因诱导5至8天期间观察到的脂质体丢失的原因（图。D类)，因为PPARγ激动剂曲格列酮在大鼠脂肪变性模型中引起了类似的脂质体丢失，尽管这个过程的机制尚不清楚(18).
肉碱棕榈酰转移酶M-CPT-I和CPT-II负责脂肪酸的线粒体输入，并代表线粒体脂肪酸氧化途径中的关键限速步骤(9). 编码这两种酶的转录物在去除DOX的小鼠中表达下调（图。). 该途径的其他关键酶也显著下调，包括中链酰基辅酶A脱氢酶（MCAD）、酰基辅酸合成酶和OH-长链酰基-辅酸脱氢酶。因此，这些动物的脂肪酸氧化能力可能会大大降低，这可能有助于在基因诱导5天后观察到的脂质体的积累（图。D类). 这些脂肪酸氧化基因的表达受PPARα调节(9). 然而，由于PPARα的表达水平在这些动物中没有改变，这些基因的下调可能是由于PGC-1α的协同激活受损所致。事实上，M-CPT-I和MCAD的表达是由PGC-1α共同激活的(19). 虽然我们不能排除PPARα翻译后修饰的可能性，但PPARα的一些转录靶点，包括脂肪酸转位酶/CD36和酰基辅酶A氧化酶基因，在表达水平上没有变化，这表明下调并不是由于PPARα活性的直接改变（图。).
DOX戒断后，参与能量生成的各种其他代谢酶下调，包括直接参与线粒体ATP合成的ATP合成酶-β、糖原磷酸化酶、构成糖原分解途径第一步的速率限制酶和己糖激酶II，糖酵解途径中的首批酶之一(20). 微阵列分析还显示MEF2转录靶点肌酸激酶（3.5倍）和GLUT4（3倍）下调，后者是心肌中的主要葡萄糖转运蛋白，也是PGC-1α协同激活的靶点(11,21). 总之，这些发现表明，抑制MEF2活性的突变HDAC的过度表达对心脏能量产生的主要途径产生了负面影响。因为PGC-1α是线粒体生物发生和基因表达的主调节器，所以它是HDAC5S/a对心脏影响的合理靶点。
MEF2对PGC-1α表达的调节。
II类HDAC抑制MEF2转录因子的活性。因此，我们检查了小鼠的5′侧翼区域前列腺素C-1α基因，并鉴定出两个假定的MEF2-结合位点，与公认的MEF2位点一致[CTA（A/T）4标签/标签]（图。一).
监管前列腺素C-1MEF2和HDAC5的α启动子。(一)小鼠3.1-kb近端启动子中MEF2转录因子结合位点的推测序列前列腺素C-1α基因，与一致性结合序列进行比较。括号中的数字是指碱基对中相对于ATG起始密码子的位置前列腺素C-1α. (B类)电泳迁移率转移测定法用于将MEF2C结合到3.1-kb近端的推定MEF2位点前列腺素C-1α启动子。野生型低聚物；具有A/T到C/G转换的突变低聚物。(C类)激活前列腺素C-1MEF2因子的α启动子-荧光素酶报告子和COS细胞中HDAC5S/A的衰减。星号表示P（P）<0.05与仅报告者相比；十字表示P（P）与没有HDAC5S/A的相同样品相比，<0.05。误差条表示三个实验的平均值的标准偏差。(D类)MEF2结合位点突变对前列腺素C-1MEF2C转录激活的α启动子。星号表示P（P）与野生型报告员加MEF2C相比，<0.01。误差条表示三个实验的平均值的标准偏差。(E类)与AdCMV-GFP或AdCMV-HDAC5S/A感染细胞相比，非感染新生大鼠心肌细胞中PGC-1α表达的半定量RT-PCR(F类)从未感染的新生大鼠心肌细胞或感染AdCMV-GFP或AdCMV-HDAC5S/A的细胞中免疫沉淀乙酰化组蛋白H3/DNA复合物32在非饱和条件下使用引物进行P-PCR前列腺素C-1α启动子MEF2-结合位点或GAPDH。使用一份非免疫沉淀DNA作为输入控制。
使用MEF2C转染COS细胞的提取物对这些位点进行凝胶位移分析，结果表明它们与MEF2C结合（图。B类). 具有A/T到C/G转换的突变MEF2位点没有复杂的形成，证明了结合的特异性。
然后我们检查了MEF2因子是否能够激活前列腺素C-1使用荧光素酶报告子融合到3.1-kb的α启动子前列腺素C-1α启动子区。测试的所有三个MEF2因子（MEF2C、-A和-D）均显著激活前列腺素C-1α启动子（图。C类). 两个MEF2位点中任一个的突变显著降低了MEF2C的反式激活（图。D类)两个位点的突变均无进一步抑制作用。总之，这些研究结果表明，两个MEF2结合位点都是必要的，但都不足以激活前列腺素C-1α启动子。
HDAC5S/A抑制PGC-1α表达。
基于MEF2激活前列腺素C-1α启动子，我们推测HDAC5会抑制该启动子，因为HDAC5被MEF2招募。的确，前列腺素C-1α启动子活化可以通过HDAC5S/A的表达而完全减弱，但不能通过I类HDAC、HDAC3（图。C类)，显示HDAC5的特定效果。HDAC5S/A也抑制了前列腺素C-1α报告基因缺乏外源MEF2，可能是由于COS细胞中存在的内源性MEF2因子受到抑制。报告者使用同源人类进行分析前列腺素C-1α启动子区分别表现出MEF2和HDAC5S/A对启动子的类似激活和抑制（数据未显示）。
确定HDAC5S/A是否能够抑制内源性前列腺素C-1α基因，我们感染了新生大鼠心肌细胞在体外用编码HDAC5S/A的腺病毒（AdHDAC5S/A），通过半定量RT-PCR检测PGC-1α的表达(8). 感染AdHDAC5S/A显著抑制PGC-1α的表达，而感染表达GFP的对照腺病毒（AdCMV-GFP）则没有影响（图。E类). 我们的结论是，内源性前列腺素C-1α基因表达受HDAC5调节。
重要MEF2位点的组蛋白去乙酰化与抑制PGC公司-1α.
我们检查了抑制第1页HDAC5的α基因表达是由于组蛋白在细胞内MEF2-结合位点的去乙酰化所致前列腺素C-1α启动子通过执行ChIP分析。与未感染或AdCMV-GFP感染的心肌细胞相比，感染AdHDAC5S/A的心肌细胞中远端MEF2-结合位点（−2901）组蛋白的乙酰化显著降低（图。F类). 另一组蛋白的乙酰化没有变化前列腺素C-1αMEF2站点或GAPDH公司发起人。非免疫沉淀输入DNA作为对照。
可以预期，因为−1539的近端MEF2位点是荧光素酶报告基因反式激活所必需的（图。D类)，在该区域可以观察到组蛋白的脱乙酰化。缺乏脱乙酰化的一个可能解释是，近端位点是组装转录复合物所必需的，但HDAC本身并没有被招募到这个区域。或者，主要作用组蛋白乙酰转移酶可能被招募到第二个位点，但不会招募到−2901的更远端位点。
讨论
这项研究的结果表明，MEF2和HDAC对PGC-1α表达的调节可以高水平控制线粒体能量产生（图。). 该模型提供了一种微调PGC-1α水平的方法，以响应能量需求的变化，并预测了MEF2在匹配心肌细胞肥大期间增加的能量需求和线粒体中增加的能量生产方面的作用。
MEF2/HDAC5和PGC-1α之间相互作用的模型。PGC-1α和PPARα协同激活编码心肌脂肪氧化相关酶的基因。已证明PGC-1α和MEF2C通过控制GLUT4葡萄糖转运蛋白的表达来调节肌肉中的葡萄糖摄取，GLUT4是肌肉中的主要葡萄糖摄取机制。MEF2还调节肌肉肥大期间的胎儿基因程序。CnA、钙调神经磷酸酶。
先前的研究表明，钙调神经磷酸酶和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMK）信号通路诱导快速糖酵解骨骼肌纤维转化为缓慢的氧化纤维，伴随着PGC-1α的上调(22,23). 骨骼肌中PGC-1α的过度表达还导致慢纤维数量增加以及慢纤维代谢和收缩基因的表达增加，这些基因依赖于MEF2(24). 鉴于钙调神经磷酸酶和CaMK信号刺激MEF2活性，本研究表明MEF2将这些信号通路与PGC-1α转录联系起来，为骨骼肌中观察到的线粒体数量和PGC-1β表达增加提供了一种潜在机制，以响应CaMK的信号(23). CaMK刺激II类HDAC的磷酸化，导致其从细胞核输出(4). 我们的数据表明，CaMK或相关激酶对HDAC的失活会降低PGC-1α的表达，导致线粒体生物发生增加。
心脏中PGC-1α的过度表达促进线粒体生物生成(10). 相反，如图所示，PGC-1α表达下调导致心肌线粒体丢失。我们解释了HDAC5S/a转基因小鼠的严重心脏异常，以反映这种突变HDAC在抑制MEF2活性方面的极端效力。虽然我们最初的兴趣是确定HDAC5的信号抑制突变是否可以阻止心肌肥厚体内就像它那样在体外(8)HDAC5S/A过度表达引起的心脏异常表明，可能存在心脏稳态所需的MEF2活性的基本水平，因此抑制这种活性会导致心脏死亡。与这个概念一致，老鼠缺乏MEF2A公司线粒体缺乏，产后死亡率高(25). 很容易推测HDAC5S/A小鼠的表型反映了成年心脏中所有MEF2因子功能的联合丧失，尽管我们不能排除其他转录因子的可能参与。
HDAC5S/A过表达动物中观察到的线粒体变化可能不是直接由于PGC-1α表达受到抑制，因为MEF2有许多靶基因。事实上，在DOX停药后，通过微阵列分析，编码多种MEF2靶基因的转录物下调，包括β-烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶和收缩蛋白，如骨骼肌α-肌动蛋白和α-MHC（结果未显示）。然而在体外报告者和ChIP分析，结合AdHDAC5S/A感染后分离心肌细胞中PGC-1α表达的快速抑制（24小时内），强烈表明HDAC5S/A对PGC-1β表达有直接影响。
HDAC对PGC-1α表达的抑制是否在人类疾病进展中的心脏失代偿和衰竭中发挥作用还有待观察。心力衰竭通常以线粒体功能障碍为特征，遗传性线粒体疾病的儿童通常存在心血管缺陷，这表明线粒体能量生产和心脏能量需求之间需要精确平衡(26,27). HDAC5S/A小鼠心力衰竭的快速进展表明线粒体能量储存的耗竭可能在这一过程中发挥关键作用。潜在的模型可能涉及适应性肥大期间MEF2因子的激活，导致胎儿基因程序的激活，PGC-1α依赖性脂肪酸代谢和线粒体生长的激活，以及工作能力的增加。然而，如果这种激活被延长，或者如果其他应激作用于心脏，其他机制可能会激活HDAC，抑制PGC-1α表达的MEF2激活，并对脂肪酸代谢和心脏能量生成产生负面影响。这将有助于解释心力衰竭时脂肪酸氧化向葡萄糖利用转变的观察结果，以及衰竭心脏中脂肪酸氧化酶下调的观察结果(28,29). 如果HDAC被证明在这些途径中发挥作用，HDAC抑制剂可能通过抑制PGC-1α的表达而有效治疗心力衰竭，从而增加脂肪酸氧化和能量生成。
致谢
我们感谢A.Tizenor提供的图形；T.McKinsey和C.Zhang为向量和有价值的讨论；J.Shelton和D.Bellotto的组织学研究；以及B.Conklin（加利福尼亚大学旧金山分校）和H.Bujard（海德堡大学）的pUHG-10载体。我们还感谢R.Bassel-Duby、O.Nakagawa和D.Garry对手稿的批判性阅读。该组织得到了美国国立卫生研究院、唐纳德·雷诺兹基金会和德克萨斯州先进技术计划的资助。M.P.C.获得了加拿大卫生研究院的博士后研究金。
缩写
| HDAC公司 | 组蛋白脱乙酰酶 |
| MEF2型 | 肌细胞增强因子-2 |
| HDAC5S/A型 | HDAC5双丝氨酸-丙氨酸突变体 |
| PPAR（购电协议） | 过氧化物酶体增殖物激活受体 |
| 前列腺素C-1α | PPARγ共激活因子1α |
| DOX公司 | 强力霉素、ChIP、染色质免疫沉淀 |
| MHC公司 | 肌球蛋白重链 |
| 泰特 | 四环素 |
工具书类
2麦肯锡T A、Zhang C L、Olson E N。当前操作基因开发。2001;11:497–504.[公共医学][谷歌学者] 三。黑色B L，奥尔森E N。年收入细胞开发生物。1998;14:167–196.[公共医学][谷歌学者] 4麦肯锡T A、Zhang C L、Lu J、Olson E N。自然。2000;408:106–111. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Grozinger C M，Schreiber S L。美国国家科学院程序。2000;97:7835–7840. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6麦肯锡T A、Zhang C L、Olson E N。分子细胞生物学。2001;21:6312–6321. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7麦肯锡T A、Zhang C L、Olson E N。生物化学科学趋势。2002;27:40–47.[公共医学][谷歌学者] 8Zhang C L、McKinsey T A、Chang S、Antos C L、Hill J A、Olson E N。单元格。2002;110:479–488. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Lehman J J，Kelly D P。临床实验药理学。2002;29:339–345.[公共医学][谷歌学者] 10Lehman J J、Barger P M、Kovacs A、Saffitz J E、Medeiros D M、Kelly D P。临床投资杂志。2000;106:847–856. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Michael L F、Wu Z、Cheatham R B、Puigserver P、Adelmant G、Lehman J J、Kelly D P、Spiegelman B M。美国国家科学院程序。2001;98:3820–3825. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Yu Z、Redfern C S、Fishman G I。Circ研究。1996;79:691–697.[公共医学][谷歌学者] 13.McFadden D G、Charite J、Richardson J A、Srivastava D、Firulli A B、Olson E N。开发（英国剑桥）2000;127:5331–5341.[公共医学][谷歌学者] 14Djoadi F、Weinheimer C J、Saffitz J E、Pitchford C、Bastin J、Gonzalez F J、Kelly D P。临床投资杂志。1998;102:1083–1091. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Patane G、Anello M、Piro S、Vigneri R、Purrello F、Rabuazo A M。糖尿病。2002;51:2749–2756.[公共医学][谷歌学者] 16Meadus W J、MacInnis R、Dugan M E。分子内分泌学杂志。2002;28:79–86.[公共医学][谷歌学者] 17Fabris R、Nisoli E、Lombardi A M、Tonello C、Serra R、Granzotto M、Cusin I、Rohner-Jeanrenaud F、Federspil G、Carruba M O等。糖尿病。2001;50:601–608.[公共医学][谷歌学者] 18Zhou Y T、Grayburn P、Karim A、Shimabukuro M、Higa M、Baetens D、Orci L、Unger R H。美国国家科学院程序。2000;97:1784–1789. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Vega R B、Huss J M、Kelly D P。分子细胞生物学。2000;20:1868–1876. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20折旧C，附加条款M H，色调L。欧洲生物化学杂志。1998;258:277–290.[公共医学][谷歌学者] 21莫拉·S、佩森·J·E。生物化学杂志。2000;275:16323–16328.[公共医学][谷歌学者] 22Chin E R、Olson E N、Richardson J A、Yang Q、Humphries C、Shelton J M、Wu H、Zhu W、Bassel-Duby R、Williams R S。基因发育。1998;12:2499–2509. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Wu H、Kanatous S B、Thurmond F A、Gallardo T、Istani E、Bassel-Duby R、Williams R S。科学。2002;296:349–352.[公共医学][谷歌学者] 24Lin J、Wu H、Tarr P T、Zhang C Y、Wu Z、Boss O、Michael L F、Puigserver P、Isoani E、Olson E N等。自然。2002;418:797–801.[公共医学][谷歌学者] 25Naya F J、Black B L、Wu H、Bassel-Duby R、Richardson J A、Hill J A、Olson E N。自然医学。2002;8:1303–1309.[公共医学][谷歌学者] 26.Guertl B、Noehammer C、Hoefler G。国际实验病理学杂志。2000;81:349–372. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27斯坦利·W·C、钱德勒·M·P。心脏衰竭版本。2002;7:115–130.[公共医学][谷歌学者] 28Recchia F A、McConnell P I、Bernstein R D、Vogel T R、Xu X、Hintze T H。Circ研究。1998;83:969–979.[公共医学][谷歌学者] 29Sack M N、Rader T A、Park S、Bastin J、McCune S A、Kelly D P。流通（英国剑桥）1996;94:2837–2842.[公共医学][谷歌学者] 
