The pre-autophagosomal structure organized by concerted functions of APG genes is essential for autophagosome formation

Kuninori Suzuki; Takayoshi Kirisako; Yoshiaki Kamada; Noboru Mizushima; Takeshi Noda; Yoshinori Ohsumi

doi:10.1093/emboj/20.21.5971

EMBO J。2001年11月1日；20(21): 5971–5981.

数字对象标识：10.1093/emboj/202.15971

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PMID：11689437

由协同功能组织的自噬前体结构自动发电机组基因对自噬体的形成至关重要

铃木库尼诺里,^1,² 高叶纪彦（Takayoshi Kirisako）,^1,² 神田佳彦（Yoshiaki Kamada）,^1,² Noboru水岛,^1,^三野田毅,^1,²和Ohsumi吉诺里^1,^2,⁴

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摘要

大自噬是真核细胞中由饥饿诱导的一个整体降解过程。在酵母中，15种Apg蛋白协调自噬体的形成。已经描述了这些蛋白质执行的几个关键反应，但仍然缺乏对整个网络的全面理解。基于Apg蛋白定位，我们确定了一种在自噬体形成中起作用的新结构。这种前自噬体结构位于液泡附近，包含至少五种Apg蛋白，即Apg1p、Apg2p、Apg 5p、Aut7p/Apg8p和Apg16p。分析自动发电机组突变体显示，磷脂酰乙醇胺结合Aut7p和Apg12p–Apg5p结合物的形成对Aut7p定位到自噬前结构至关重要。Vps30p/Apg6p和Apg14p是自噬特异性磷脂酰肌醇3-激酶复合物的组成成分，Apg9p和Apg 16p都是Apg5p和Aut7p定位到结构所必需的。Apg1p蛋白激酶复合物在自噬体形成的后期发挥作用。在这里，我们将Apg蛋白分为三类，反映了自噬体形成的每个步骤。

关键词：APG/自噬体/自噬/GFP/膜动力学

介绍

在酵母的大自噬过程中，一部分细胞质被非选择性地隔离在双层膜结构（自噬体）中，并传递到液泡中进行降解。电镜分析显示，自噬体与液泡膜融合，将内膜结构释放到内腔中(Baba等人，1994年). 当杯状膜囊（隔离膜）延伸以包裹和密封细胞质材料时，会产生自噬体。这种延伸过程伴随着膜结构的组装(Kirisako等人，1999年)目前还没有很好地描述。在哺乳动物细胞中，自噬体以类似的方式产生。在大鼠肝细胞中，在电子显微镜下观察到被指定为吞噬细胞的嗜锇膜(Seglen，1987年;Fengsrud等人，1995年,2000). 在小鼠胚胎干细胞中，类似的分离膜被电子显微镜鉴定为自噬体的前体(水岛等人，2001年). 为了了解控制自噬的分子机制，我们分离了15个自噬缺陷突变体(自动发电机组)在酵母中(Tsukada和Ohsumi，1993年)伴有体蛋白降解、产孢和饥饿条件下生存能力维持障碍(Klinsky和Ohsumi，1999年). 液泡水解酶氨肽酶I（API）通过小的双膜小泡组成性地运输到液泡(Scott等人，1997年). 这种细胞质到液泡靶向（Cvt）途径在生长条件下运行。已经发现在与自动发电机组,AUT（自动变速器）（自噬）和无级变速器路径(Harding等人，1996年). 全部自动发电机组突变体除外apg17号机组已知Cvt途径有缺陷。

最近对Apg蛋白的鉴定表明，两个泛素样系统利用了大约一半的Apg蛋白。Apg12p是一种泛素样蛋白，与Apg5p共价连接，形成由Apg7p和Apg10p串联作用控制的Apg12p-Apg5p偶联物(水岛等., 1998). Apg7p是E1类激活酶的成员，与Apg12p形成硫酯键(基姆等., 1999;谷多等., 1999;元等., 1999). Apg12p随后与E2结合酶Apg10p形成硫酯中间体(真谷等., 1999). 然后，Apg12p通过与C端甘氨酸的异肽键与Apg5p的Lys149相连。然后，在与Apg12p–Apg5p共轭物直接相互作用后，Apg16p通过其C末端线圈区域相互作用形成同聚体(水岛等., 1999). 在哺乳动物细胞中，Apg12p–Apg5p缀合物的同源物与前体自噬体的膜短暂结合(水岛等., 2001).

Aut7p/Apg8p是参与自噬的第二种泛素样蛋白，通过三种Apg蛋白Aut2p/Apg4p、Apg7p和Aut1p/Apg3p的系列作用与磷脂酰乙醇胺（PE；Aut7p–PE）结合(市村真一等., 2000;基里萨科等., 2000). Aut7p的C末端Arg117通过半胱氨酸蛋白酶Aut2p的作用被去除(基里萨科等., 2000)，露出Gly116。在Apg7p（E1）激活后，处理的Aut7p被传输到Aut1p（E2）。Aut7p随后与PE共价连接。Aut2p进一步裂解Aut7p-PE，释放Aut7p，这是自噬正常进程中的一个重要步骤(基里萨科等., 2000). Aut7p是第一个定位于自噬体和中间结构的蛋白质(基里萨科等., 1999;Huang（黄）等., 2000); Aut7p的这种特性使我们可以使用Aut7p来监测自噬体的形成。LC3是Aut7p的哺乳动物同源物，也定位于自噬体和前体膜的膜上(卡贝亚等., 2000;水岛等., 2001).

自噬还需要额外的Apg蛋白，这些蛋白不参与泛素样系统。Vps30p/Apg6p除了在自噬中起作用外，还在空泡蛋白分选中起作用(Kametaka等人，1998年). Vps30p形成自噬所需的特异性磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-激酶）复合物，由Vps30p、Apg14p、Vps34p和Vps15p组成。这些数据表明，PI3激酶复合物介导的动态膜事件对于自噬是必要的(Kihara等人，2001a). 一类PI3-激酶和beclin，Vps30p的人类同源物，对人类细胞的自噬也至关重要(Liang等人，1999年;Petiot等人，2000年). Beclin与PI3-激酶复合物在反式-高尔基网络(Kihara等人，2001b).

Tor激酶负调控自噬的诱导；这种激酶活性被雷帕霉素抑制(Noda和Ohsumi，1998年). 由于Tor活性的失活诱导自噬，雷帕霉素治疗模拟饥饿反应。Tor活性失活导致Apg13p快速去磷酸化(阿贝利奥维奇等., 2000;卡马达等., 2000). Apg13p和Apg17p与Apg1p蛋白激酶相关(松浦等., 1997)形成Apg1p蛋白激酶复合物，这是自噬的重要组成部分。去磷酸化的Apg13p与该复合物的结合增强了Apg1p的激酶活性(Kamada公司等., 2000).

每个Apg蛋白的特性正在逐渐被揭示；然而，人们对它们的功能相互关系知之甚少。这是由于缺乏能够识别自噬体形成之前或期间发生的中间步骤的标记。为了进一步了解Apg蛋白之间的功能关系，我们利用灵敏的成像系统观察了Apg蛋白与荧光蛋白融合的行为。我们检测了涉及两个泛素样系统Apg5p和Aut7p的Apg蛋白的动力学。基于他们在自动发电机组突变体，我们定义了一个包含Apg1p、Apg2p、Apg 5p、Aut7p和Apg16p的自噬前结构。这种结构参与自噬体的产生，为研究自噬小体的形成步骤提供了线索。

结果

Apg1p、Apg5p、Aut7p和Apg16p共定位的点状结构

Apg蛋白参与自噬中的一些基本反应，如泛素样系统或磷酸化反应。然而，自噬体形成过程中这些反应之间的相互关系尚不清楚。了解细胞内定位至关重要。几种Apg蛋白，例如Apg5p(George等人，2000年)，Aut7p/Apg8p(Kim等人，2001年)和Apg9p(Noda等人，2000年)局限于空泡周围点状结构。为了分析Apg蛋白在这些点状结构中的定位，我们使用灵敏的显微镜系统观察了绿色荧光蛋白（GFP）融合的Apg蛋白。GFP融合在自然启动子控制下从着丝粒质粒表达。在Δaut7年表达GFP–Aut7p融合蛋白生理水平的细胞（图1A），GFP–Aut7p补充了自噬的缺陷（图1C–E）。这些分子定位于点状结构，靠近液泡（图1H和I）。Apg5p–GFP保留了与Apg12p偶联的能力（图1B）；当引入缺陷细胞时，Apg5p–GFP恢复了正常的自噬功能（图1C、 F和G）。本研究中使用的其他嵌合蛋白也在自噬过程中起作用（数据未显示）。

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图1。功能性GFP–Aut7p和Apg5p–GFP在生理水平上由天然启动子表达。(A类)生长条件下GFP–Aut7p的表达水平。按照材料和方法中所述制备细胞裂解物。（1）野生型（KA311A），（2）Δaut7年（YYK218）和（3）Δaut7年（YYK218）表达GFP–Aut7p。(B类)Apg12p–Apg5p共轭物在Δ中正常产生apg5（apg5）表达Apg5p–GFP的细胞。按照材料和方法中的描述制备细胞裂解物。（1）野生型（KA311A），（2）Δapg5（apg5）（GYS59）和（3）Δapg5（apg5）（GYS59）表达Apg5p–GFP。(C类–G公司)在光学显微镜下检查自噬体的堆积。将细胞在0.17%酵母氮基w/o氨基酸和含有1mM PMSF的硫酸铵中孵育6小时。（C）野生型（KA311A）、（D）Δ的Nomarski图像aut7年（YYK218），（E）Δaut7年（YYK218）表达GFP–Aut7p，（F）Δapg5（apg5）（GYS59）和（G）Δapg5型（GYS59）表达Apg5p–GFP。（H–I）GFP–Aut7p以Δ显示aut7年细胞（KVY5）在生长条件下。在液泡附近检测到含有GFP–Aut7p的点状结构，通过FM4-64标记识别。(H（H）)GFP–Aut7p（绿色）和FM4-64标记液泡（红色）的荧光。(我)Nomarski图像上覆盖了GFP–Aut7p和FM4-64荧光。206个细胞中有43个（21%）发现了靠近液泡的点状结构。棒材：5µm。

接下来，我们将青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）融合到几个不同的Apg蛋白上，并检测它们的共定位。荧光Aut7p是点状结构的标记。Apg1p、Apg5p和Apg16p与Aut7p共同定位在靠近液泡的单点状结构上（图2). 添加雷帕霉素后，CFP–Aut7p以时间依赖性的方式传递到液泡（图2A、 D和G）。用雷帕霉素长期治疗后，YFP–Apg1p被输送至液泡（数据未显示），而Apg5p–YFP和Apg16p–YFP从未被输送至空泡（图2B和H）。Apg2p与Aut7p在空泡周围点状结构上共定位(真谷等., 2001). 因此，点状结构显示包含Apg1p、Apg2p、Apg5p、Aut7p和Apg16p。Apg12p可能与Apg5p和Apg16p共定位，作为AApg12p–Apg5p-Apg16p复合物的一个成分。由于Apg13p和Apg17p与Apg1p进行物理交互(卡马达等., 2000)，很可能这些分子也位于点状结构上。这是第一份证明多种Apg蛋白共定位的报告。

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图2。在靠近液泡的点状结构上，Apg1p、Apg5p、Apg 16p和Aut7p的Colocalization。(A类–C类) Δapg5型表达Apg5p–YFP和CFP–Aut7p的细胞（YNM119）用雷帕霉素处理3小时：（A）Apg5p-YFP，（B）CFP–Aut7p，（C）Apg5-YFP（绿色）和CFP-Aut7p（红色）的合并图像。(D类–F类) Δapg1型表达CFP–Aut7p和YFP–Apg1p的细胞（NNY20）用雷帕霉素处理30分钟：（D）CFP–Aut7p。(G公司–我) Δapg16号机组表达CFP–Aut7p和YFP–Apg16p的细胞（KVY117）用雷帕霉素处理6小时：（G）CFP–Aut7p。棒：5µm。

Apg9p是一种假定的膜蛋白，不与典型的内膜标记蛋白、自噬体或Cvt小泡共分(Noda等人，2000年). Apg9p–GFP除了定位于几个点状结构外，还表现出不均匀的细胞溶质分布(Noda等人，2000年; 图三A和B）。此模式在其他中没有改变自动发电机组突变体（图三C和D；数据未显示）。为了检测该蛋白作为点状结构标记的使用，我们通过免疫荧光显微镜比较了Apg9p–GFP和Aut7p的定位。Aut7p标记的点状结构很少与Apg9p–GFP标记的结构共存（图三E–L），尽管这两个结构偶尔非常接近（图中的箭头三K） ●●●●。Apg9p的这种模式表明它不是点状结构的合适标记。

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图3。Aut7p和Apg9p–GFP的定位。(A类和B类)Apg9p–GFP显示为Δ第9页生长条件下的细胞（CTD1）：（A）Apg9p–GFP，（B）Nomarski图像上覆盖了Apg9p-GFP的荧光。(C类和D类)Apg9p–GFP（Δ）第9页Δapg14号机组细胞（GYS29）在生长条件下鉴定：（C）Apg9p–GFP，（D）Nomarski图像上覆盖了Apg9p-GFP的荧光。(E类–L（左）) Δ第9页用雷帕霉素处理表达Apg9p–GFP的细胞（CTD1）2 h。按照材料和方法中的描述进行免疫荧光显微镜检查。（E和I）Apg9p–GFP，（F和J）Aut7p，（G和K）合并了Apg9p-GFP（绿色）和Aut7p（红色）以及（H和L）Nomarski图像的图像。偶尔在附近发现Apg9p和Aut7p（K中的箭头）。棒材：2µm。

电镜分析证实自噬体在Δ密码7突变体(Kirisako等人，1999年). 因此，我们检查了Δ中Apg5p–YFP和CFP–Aut7p的定位密码7细胞。在雷帕霉素处理这些细胞后，用CFP–Aut7p标记的自噬体在胞浆中出现暗点（图4A），而Apg5p–YFP被检测为点状模式（图中的箭头4B） ●●●●。每个标有Apg5p–YFP的点状结构都与CFP–Aut7p相关（图中箭头4C） ●●●●。结构的CFP–Aut7p染色强度大于其他CFP–Aut7p点（图中箭头4A） ●●●●。这些观察结果表明，这种含有几种共定位Apg蛋白的点状结构不是自噬体。

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图4。Aut7p和Apg5p在Δ中的定位密码7细胞。Δ密码7Δapg5（apg5）用雷帕霉素处理表达CFP–Aut7p和Apg5p–YFP的细胞（YAK3）5h(A类)自噬体CFP–Aut7p染色；(B类)Apg5p–YFP；(C类)CFP–Aut7p（红色）和Apg5p–YFP（绿色）的合并图像；(D类)Nomarski图像：CFP–Aut7p和Apg5p–YFP在点状结构上共同定位（箭头）。棒材：5µm。

为了研究内吞途径在点状结构形成中的作用，我们检测了E类腔室，这是E类空泡蛋白分选中的一个过度普遍的腔室(虚拟专用交换机)突变体(Raymond等人，1992年). E类隔室标记有FM4-64，这是一种亲脂性苯乙烯染料，是一种染色强烈的膜封闭结构(Vida和Emr，1995年)形态与Aut7p标记的点状结构相似。我们观察到GFP–Aut7p在E类中的定位虚拟专用交换机突变，Δ第4版(Raymond等人，1992年). GFP–Aut7p点状结构与该突变中的E类隔室没有共定位（图5). 这些数据表明，点状结构不是通过内吞途径组织的。因此，这种点状结构是一种位于液泡附近的新结构。

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图5。Aut7p和E级隔间的本地化。Δ的E级隔间虚拟产品4表达GFP–Aut7p的细胞（MBY3）用FM4-64标记，如材料和方法中所述，然后用雷帕霉素处理2小时(A类和E类)GFP–Aut7页。(B类和F类)E类舱室被FM4-64染色（箭头）。(C类和G公司)GFP–Aut7p（绿色）和FM4-64（红色）的合并图像。(D类和H（H）)Nomarski图片。棒材：2µm。

点状结构组织所需APG基因的遗传分析

我们发现了一种新的点状结构，其中至少有五种Apg蛋白被浓缩。我们通过研究Apg5p–GFP和GFP–Aut7p在自动发电机组突变体（图6; 汇总在表中我). 我们还评估了PE结合Aut7p的数量(Ichimura等人，2000年;Kirisako等人，2000年)在每个自动发电机组在6 M尿素存在下通过SDS-PAGE进行突变（图7). 根据这些观察结果，我们将自动发电机组突变体分为三类。这些类别很好地对应于定义的功能单元，包括Apg1p蛋白激酶复合物、两个泛素样系统和自噬所需的PI3激酶复合物。这一分类为这些类之间的交互提供了一些新的见解，将在以下部分中详细介绍。

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图6。GFP–Aut7p和Apg5p–GFP在自动发电机组在SD+CA培养基中生长的突变体。(A类) Δapg1型单元格（NNY20）。在161个细胞中的30个（18%）中，在靠近液泡的点状结构上检测到GFP–Aut7p。Δ第13页(C类; TFD13W2），Δapg17号机组（YYK111），apg2型（MT2-4-4）细胞表现出相同的表型。(B类) Δapg1型表达Apg5p–GFP的细胞（YYK36）。91个细胞中有11个（12%）检测到点状结构。Δ第13页(D类; TFD13W2），Δapg17号机组（YYK111）和apg2型（MT2-4-4）细胞表现出相同的表型。(E类)Δ的图像自动驾驶2表达GFP–Aut7p的细胞（GYS6）是Aut7系统的代表。78个细胞中有1个（1%）检测到点状结构。Δapg7号机组（GYS9）和Δ自动1（GYS5）细胞表现出相同的表型。(F类) Δ自动驾驶2表达Apg5p–GFP的细胞（GYS6）。52个细胞中有11个（21%）检测到单点结构。Δ自动驾驶仪1（GYS5）和Δaut7年（YYK218）细胞表现出类似的表型。(G公司)这个Δapg12号机组表达GFP–Aut7p的细胞（GYS13）是Apg12系统突变体的代表。84个细胞中有一个（1%）检测到点状结构。Δapg10（TFD10-L1）和Δapg5（apg5）（SKD5-1D）细胞具有相同的表型。(H（H）)AΔapg5（apg5）Δapg12号机组表达Apg5p–GFP的细胞（YNM117）。在104个细胞中有16个（15%）检测到单个点状结构。Δapg7号机组（GYS9），Δapg10（TFD10-L1）和Δapg5（apg5）（SKD5-1D）细胞均表现出相同的表型。(我)AΔapg14型表达GFP–Aut7p的细胞（SKD14–1C）。51个细胞均未显示点状结构。Δ虚拟专用交换机30电池（SKD6-1D）和Δ第9页细胞（CTD1）具有相同的表型。(J型)AΔapg14号机组生长条件下表达Apg5p–GFP的细胞（AKY12）。248个细胞中有一个观察到点状结构（<1%）。Δ虚拟专用交换机30细胞（AKY74）和Δ第9页细胞（CTD1）表现出相同的表型。(K（K）)AΔapg16号机组表达GFP–Aut7p的细胞（KVY117）。77个细胞中没有观察到点状结构。(L（左）)AΔapg5（apg5）Δapg16号机组生长条件下表达Apg5p–GFP的细胞（YNM126）。在检查的184个细胞中未观察到点状结构。棒材：5µm。

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图7。Aut7p水平–每个中存在PE自动发电机组突变体。如材料和方法中所述，在SDS-PAGE之前通过玻璃珠破碎制备裂解物。(A类)营养生长中的细胞。(B类)在SD（-N）培养基中饥饿4.5小时后的细胞。我们检测了野生型（SEY6210）的表型，Δapg1型（GYS102），apg2型（MT2-4-4），Δ自动1（KVY113），Δaut2型（KVY13），Δapg5（apg5）（KVY142），Δ虚拟专用交换机30（KVY135），Δapg7号机组（KVY118），Δaut7年（KVY5），Δ第9页（KVY114），Δapg10（KVY136），Δapg12型（KVY115），ΔΔ第13页（KVY116），Δapg14号机组（GYS115），Δapg16号机组（KVY117）和Δapg17号机组（YYK111）单元格。

表一。

GFP–Aut7p和Apg5p–GFP在点状结构上的定位自动发电机组突变体

基因型	GFP–Aut7p	Apg5p–绿色荧光蛋白
Δapg1型	+	+
apg2型	+	+
Δ自动驾驶仪1/Δapg3（apg3）	–	+
Δ自动驾驶2/Δapg4（apg4）	–	+
Δapg5（apg5）	–	+（重量）
Δ第30页/Δapg6	–	–
Δapg7号机组	–	+
Δaut7年/Δapg8号机组	+（重量）	+
Δ第9页	–	–
Δapg10	–	+
Δapg12号机组	–	+
Δapg13型	+	+
Δapg14号机组	–	–
Δapg16号机组	–	–
Δapg17型	+	+
Δapg1型Δapg7号机组	–	未检查
Δapg1型Δ虚拟专用交换机30	–	未检查
Δapg1型Δ第9页	–	未检查
Δ自动驾驶2Δapg10
表达GFP–Aut7FGp	–	未检查
Δ自动驾驶2Δapg12号机组
表达GFP–Aut7FGp	–	未检查
Δ虚拟专用软件38	+	未检查

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+：GFP–Aut7p或Apg5p–GFP局限于点状结构。

–：GFP–Aut7p或Apg5p–GFP显示弥漫细胞质染色模式。

WT：野生型。

对A类apg突变体的分析提供了点状结构参与自噬体形成的证据

与野生型细胞一样，A类突变体具有定位于点状结构的Apg5p–GFP和GFP–Aut7p（表我). A类基因包括APG1公司,APG2（APG2）,亚太13国集团和亚太17国集团Apg13p和Apg17p是Apg1p蛋白激酶的调节因子。由于A类突变体表现出正常的点状结构，Apg1p蛋白激酶复合体不太可能参与点状结构的形成。A类突变体都具有正常水平的Aut7p–PE（图7).

为了检查点状结构是否具有生理功能，我们生成了一个apg1型^ts秒聚合酶链反应（PCR）诱变等位基因。通过监测表达ALP（Pho8Δ60p）胞浆形式的细胞中碱性磷酸酶（ALP）的活性来测量自身吞噬活性，ALP被转运到液泡并成熟(Noda等人，1995年). 我们根据API的成熟度评估了该等位基因的温度敏感性（图8A）和ALP测定（图8B）使用Δapg1型携带apg1的细胞^ts秒质粒(apg1型^ts秒单元格）。在23°C时apg1型^ts秒细胞中含有正常水平的成熟API（图8A）并具有显著的自噬活性（图8B） ●●●●。然而，在37°C时，API的成熟和自噬活性都被完全阻断（图8A和B）。自噬apg1型^ts秒细胞在30°C时的水平与在23°C时相同。在23°C无氮培养基中培养6 h后，ALP活性随时间线性增加（图8C） ●●●●。将细胞转移到37°C时，自噬立即被阻断（图8C） ●●●●。当细胞从37°C转移到23°C时，自噬活性在没有滞后期的情况下恢复（图8C） ●●●●。Apg1号机组^ts秒即使在37°C下隔夜培养后，免疫印迹也能检测到p（图8A），证明了这一点apg1型^ts秒是一个可逆的温度敏感等位基因，在自噬中有缺陷。

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图8。 apg1型^ts秒具有温度敏感性功能的突变体。(A类)虽然可以检测到对温度敏感的Apg1p，但在37°C时，API的成熟被完全阻断apg1型^ts秒细胞。API proform（proAPI）以依赖于Apg1p活动的方式处理为成熟API（mAPI）。野生型细胞（TN125），Δapg1型单元格（YYK126）和Δapg1型携带apg1的细胞（YYK126）^ts秒质粒在23℃或37℃的YEPD培养基中培养过夜。按照材料和方法中的描述检测Apg1p和API。(B类) Δapg1型携带（1）APG1质粒、（2）载体或（3）APG1的细胞（YYK126）^ts秒质粒在23℃的YEPD培养基中生长。然后将其转移到23°C或37°C的SD（–N）培养基中并培养6 h，然后测量ALP活性。(C类) Δapg1型携带apg1的细胞（YYK126）^ts秒质粒在23℃的YEPD培养基中生长。然后将细胞转移到SD（–N）培养基中，并在23°C或37°C下培养。闭合方块，细胞在23°C下持续饥饿。开放方块，细胞在23°C下培养2小时，然后转移到37°C。打开锭剂，细胞在37°C下持续饥饿。封闭锭剂，细胞在37°C下培养2小时，然后转移至23°C。

在将温度从37°C切换到30°C时，我们跟踪了GFP–Aut7p在apg1型^ts秒细胞。在30°C下，雷帕霉素处理后，在点状结构和液泡中可见GFP–Aut7p，如野生型细胞中所示（图9A） ●●●●。37°C时，点状结构的染色强度增加，同时雷帕霉素治疗后缺乏液泡染色（图9B、 4分钟）。接下来，我们使用延时显微镜实时检测了降温后GFP–Aut7p染色的进展情况。在10分钟内，用GFP–Aut7p标记的几个点从点状结构中分离出来（图9B） ●●●●。在30°C下孵育30分钟期间，随着这些点的消失，液泡的荧光强度变得更亮，表明它们是自噬体。我们的结论是，点状结构实际上参与了自噬体的形成。

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图9。时间推移显微镜apg1型^ts秒表达GFP–Aut7p的细胞。Δapg1型携带apg1的细胞（NNY20）^ts秒使用GFP–Aut7p质粒。(A类)在30°C下用雷帕霉素处理细胞3小时。(B类)温度下降后的时间推移图像。在37°C下用雷帕霉素处理细胞4小时，然后将温度降至30°C。(C类)温度下降后，在30°C下培养细胞2小时。棒材：5µm。

我们接下来治疗apg1型^ts秒细胞与环己酰亚胺培养20分钟，然后在37°C和雷帕霉素存在下培养4小时。降低温度时，出现类似的圆点，导致液泡荧光染色（数据未显示）。本实验表明，自噬体从点状结构中的出现依赖于Apg1p的活性；从头开始的然而，蛋白质合成是不必要的。由于Apg1p定位于点状结构（图2D–F），Apg1p蛋白激酶复合物在自噬体形成中的作用晚于结构的组织。因此，我们将这种点状结构称为“自噬前结构”。

B类apg突变体Aut7p在自噬前结构上的定位存在缺陷

B类突变体Δ自动1, Δ自动驾驶2, Δapg5（apg5）, Δapg7号机组, Δapg10和Δapg12号机组，在自噬体前结构上检测到Apg5p–GFP；GFP–Aut7p不是。有趣的是，这些基因参与了两个泛素样结合系统：Aut7系统（Δ自动驾驶2, Δapg7号机组和Δ自动1)和Apg12p–Apg5p共轭体系（Δapg12型, Δapg7号机组, Δapg10和Δapg5（apg5）). 在Δ中apg1型Δapg7号机组双突变体GFP–Aut7p没有定位于自噬前结构（表我). 该结果表明APG7公司（B类）上位于APG1公司（A类）用于Aut7p的定位，表明B类自动发电机组基因控制Aut7p在A类基因功能之前定位到自噬前结构。如前所述，Aut7系统的突变体缺乏可检测的Aut7p–PE（图7;Ichimura等人，2000年). 这些研究表明，GFP–Aut7p在自噬前结构中的定位与Aut7p脂质氧化紧密耦合。Aut7p与自噬前体结构的结合以PE结合形式出现自动1或Δ自动驾驶2突变体，Apg12p–Apg5p共轭物正常形成(水岛等人，1998年); Apg5p–GFP定位于自噬前结构，如野生型细胞中所示（表我). 因此，Aut7p的脂化对于Aut7p的定位至关重要，但对于（Apg12p–）Apg5p定位到自噬前结构则不是必需的。

有趣的是，在Apg12系统突变体的自噬前结构上检测到了Apg5p–GFP（Δapg12号机组和Δapg10; 表我)，表明Apg12p的缀合对于Apg5p的定位不是必需的。在Apg12系统突变体中（Δapg12号机组, Δapg10和Δapg5（apg5）)，我们无法在自噬前结构上检测到GFP–Aut7p（表我). 此外，这些突变体显示Aut7p–PE水平严重降低（图7). Apg12p偶联突变体中Aut7p膜结合的缺陷(Kim等人，2001年)可以通过在没有共轭物的情况下Aut7p–PE总水平的降低来解释。

为了研究Apg12p–Apg5p共轭物的破坏对Aut7p定位的影响，我们估计了Δ自动驾驶2表达羧基末端加工形式Aut7p（Aut7FGp；Ichimura等人，2000年;Kirisako等人，2000年). Aut2p/Apg4p是一种半胱氨酸蛋白酶，对Aut7p加工和Aut7p-PE解偶联至关重要。Aut7p–PE累计Δ自动驾驶2表达Aut7FGp的细胞，因为这些细胞不能去结合Aut7p–PE(Kirisako等人，2000年). Δ中Aut7p–PE的水平aut2型Δapg10和Δ自动驾驶2Δapg12号机组细胞从Δ的水平减少自动驾驶2细胞，但Aut7p–PE实际上是在Δ中生成的自动驾驶2Δapg10和Δ自动驾驶2Δapg12号机组单元格（图10). 这一结果表明，Apg12p–Apg5p共轭物对Aut7p–PE的形成不是必需的。然后我们构建了GFP–Aut7FG质粒，并在Δ自动驾驶2Δapg10和Δaut2型Δapg12号机组细胞。尽管这些突变体中产生了大量Aut7p–PE（图10)，GFP–Aut7FGp未定位于自噬前结构（表我). 这一结果表明，Aut7p的正确定位绝对需要Apg12p–Apg5p共轭物。然而，共轭物的作用并不局限于Aut7p的局部化，如Δapg5（apg5）细胞在API成熟过程中比Δ有更严重的缺陷秋季7单元格(Abeliovich等人，1999年,2000).

在单独的窗口中打开

图10。Aut7p–PE金额（Δ）自动驾驶2营养生长期间表达Aut7FGp的细胞。按照材料和方法中的描述，通过玻璃珠破碎制备裂解液并进行SDS-PAGE。本实验使用的菌株如下：野生型（SEY6210），Δ自动驾驶2（KVY13），Δ自动驾驶2Δapg10（KVY150）和Δaut2型Δapg12号机组（KVY148）。

C类apg突变体不向自噬前结构传递Apg5p或Aut7p

在C类突变体中，Δ虚拟专用交换机30, Δ第9页, Δapg14号机组和Δapg16号机组Apg5p–GFP和GFP–Aut7p均未定位于自噬前结构。虚拟专用交换机30和亚太14国集团是参与自噬特异性PI3-激酶复合物的基因。双中断Δapg1型Δ虚拟专用交换机30或Δapg1型Δ第9页，表达GFP–Aut7p显示出弥漫细胞质染色模式（表我). 该结果表明虚拟专用交换机30和APG9公司（C类）是上位的APG1公司（A类）在自噬前结构的组织中。因此，C类自动发电机组基因以a类基因依赖的方式在自噬前体结构的Apg5p和Aut7p的组织中发挥作用。我们进一步分析了这些突变体中Aut7p–PE的水平。Δapg16号机组在营养生长期间，细胞含有显著水平的Aut7p–PE（图7A） ●●●●。然而，在氮饥饿后，Aut7p–PE与未修饰Aut7p的比率下降（图7B） ●●●●。生长细胞和饥饿细胞中Aut7p–PE的水平相似（数据未显示），表明饥饿期间Aut7p的合成导致Δapg16号机组细胞。相反，Δ虚拟专用交换机30, Δapg9型, Δapg14号机组无论营养状况如何，细胞都具有正常水平的Aut7p–PE（图7).

Apg16p是一种连接Apg12p–Apg5p结合物的线圈蛋白(Mizushima等人，1999年). 虽然形成了Apg12p–Apg5p共轭物，但我们在Δ中没有观察到Apg5p-GFP的点结构apg16号机组单元格（表我). 这一观察结果表明，Apg5p和Apg16p的相互作用对于Apg5p在自噬前结构中的正确定位是必要的。尽管Aut7p–PE形成于Δapg16号机组营养生长期间的突变（图7A），我们无法观察到Aut7p在自噬前结构中的定位（表我). 该表型与Δ相似自动驾驶2Δapg10型或Δ自动驾驶2Δapg12号机组表达GFP–Aut7FGp的细胞（表我)，其中包含显著水平的Aut7p–PE（图10). 这一结果表明，Aut7p的定位需要形成Apg12p–Apg5p–Apg 16p复合物。作为Δapg16型突变株在饥饿期间未能维持Aut7p–PE水平，因此必须有Apg12p–Apg5p–Apg 16p复合物才能维持Aut7–PE水平。

两种类型的PI3-激酶复合物包含Vps34p、Vps15p和Vps30p/Apg6p作为常见成分(Kihara等人，2001a). 在这些复合物中，Apg14p和Vps38p分别是指定自噬或羧肽酶Y（CPY）的成分，CPY是一种空泡驻留酶，是分选途径。单位Δapg14号机组Aut7p和Apg5p细胞广泛分布于细胞质中，而Δ虚拟专用软件38细胞，可检测到自噬前体结构（表我). 单位Δ虚拟专用交换机30和Δapg14号机组正常产生菌株Aut7p–PE和Apg12p–Apg5p共轭物（图7;Mizushima等人，1998年). 这些结果表明，自噬特异性PI3-激酶复合物对于招募Aut7p–PE和Apg12p–Apg5p偶联物到自噬前结构至关重要。Δ第9页突变体也表现出C类表型。然而，Apg9p与其他Apg蛋白的物理相互作用尚未确定。我们的结果表明，Apg9p与自噬特异性PI3-激酶复合物有一定关系。

讨论

我们和其他小组已经报道了几个Apg蛋白在细胞内的定位，它们在液泡附近形成点状结构。然而，这种点状结构的生理意义尚未得到详细研究。在这里，我们系统地研究了GFP标记的Apg蛋白在生理水平表达时的定位。这些分析确定了一种新的“自噬前结构”，其中组装了Apg1p、Apg2p、Apg 5p、Aut7p和Apg16p。通过Apg16p和自噬特异性PI3-激酶复合物的作用，Apg5p和Aut7p被招募到结构中。Apg1p蛋白激酶复合物也定位于该结构。该激酶与Apg12p–Apg5p–Apg 16p复合物和Aut7p协同作用，在生成自噬体中发挥关键作用。我们对此结构的表征发现，Apg蛋白存在于三个功能基团中，即Apg1p蛋白激酶复合物、泛素样系统（Apg12系统和Aut7系统）和自噬特异性PI3-激酶复合物。对自动发电机组突变表型清楚地揭示了这三组细胞在自噬前结构上的相互关系。尽管APG2（APG2）和APG9公司基因仍然未知，我们的结果表明，这些基因编码的蛋白质分别与Apg1p蛋白激酶复合体和自噬特异性PI3-激酶复合体作用密切。

自噬前体结构

雷帕霉素治疗后，GFP–Aut7p和其他GFP融合的Apg蛋白的荧光强度迅速增加，显示出自噬前体结构（数据未显示）。Aut7p的数量在自噬过程中增加，而Apg1p、Apg2p、Apg5p或Apg16p没有显著增加。这些结果表明，Apg蛋白通过未知机制进一步招募到自噬前结构。这种前自噬体结构组成的变化可能启动自噬体的形成。

Apg蛋白的重复细胞分馏分析尚未发现自噬前体部分的生化鉴定。很可能每个Apg蛋白的低水平被招募到结构上；此外，细胞裂解液中的结构可能不稳定，导致其生化表征困难。免疫电子显微镜检测发现，Aut7p集中在早熟的自噬体、隔离膜和液泡附近Aut7p-富集区(基里萨科等., 1999). 这个Aut7p富集区是前自噬体结构的候选区域之一。然而，我们对Aut7p富集结构的深入研究未能成功确定与自噬前结构相对应的明确膜结构。在电子显微镜下，该结构可能无法作为定义的膜室观察到。目前，我们基于荧光显微镜的分析是解剖自噬体形成过程的最有希望的研究。

我们证明了前自噬体结构是一种功能结构，而不是一种死态结构。使用apg1型^ts秒菌株表明，在允许的温度下，几个点与自噬前体结构分离（图9B）随后染色液泡（图9C） ●●●●。这一结果表明，自噬前结构是自噬体的组织中心。每个点对应于自噬前结构或自噬体；后期（图中12分钟和13.5分钟）可见的弱染色点9B）可能是自噬体。

A类突变体中自噬前结构的组织不受影响，Δapg1型,apg2型, Δ第13页或Δapg17号机组此外，我们证明了Apg1p是自噬前体结构的一个组成部分（图2D–F）。Apg13p和Apg17p也可能是结构的组成部分，因为Apg1p直接与Apg13p和Apg17相互作用(Kamada等人，2000年). 作为对营养素耗竭的反应，Apg1p激酶复合物活性的增强控制着从Cvt囊泡形成到自噬体形成的转变。Aut7p通常以Δ表示apg1型雷帕霉素或饥饿引起的细胞(Kirisako等人，1999年). 因此，Apg1p激酶复合物在诱导自噬和启动自噬体形成中发挥作用。雷帕霉素治疗期间GFP–Apg1p向空泡腔的传递（数据未显示）也支持Apg1p参与自噬体形成的后期。

自噬体前结构的组织

Aut7p–PE是自噬前体结构的重要组成部分（表我和图7). 我们证明，Apg12p–Apg5p共轭物的缺失导致Aut7p–PE水平的严重下降（图7). GFP–在Δ的自噬前结构中未检测到Aut7FGp自动驾驶2Δapg10, Δaut2型Δapg12号机组单元格（表我)尽管Aut7p–PE水平显著（图10). 这些数据表明，Apg12p–Apg5p共轭物必须在Aut7p–PE的定位中发挥作用。然而，在雷帕霉素治疗中，Δaut7年细胞表现出一定程度的API成熟，而Δapg5（apg5）细胞没有成熟的API(Abeliovich等人，1999年,2000;Kirisako等人，2000年). 这表明该结合物对自噬体的形成和Aut7p–PE定位于自噬前结构的维持至关重要。

Apg16p与Apg12p–Apg5p共轭物形成络合物(水岛等人，1999年). GFP–Aut7p在Δ中呈现弥散染色模式apg16号机组细胞，无论营养生长期间Aut7p–PE的正常水平如何（图7A） ●●●●。Δapg16号机组在饥饿期间，突变体未能增加Aut7p–PE的水平（图7B） ●●●●。Apg16p可能参与维持饥饿期间Aut7p–PE水平。Apg5p–GFP在Δapg16号机组单元格（图6五十） ●●●●。Apg16p在结构上的定位（图2G–I）表明，Apg16p在将AApg12p–Apg5p结合物靶向自噬前结构方面发挥作用。单位Δapg16号机组由于缺乏AApg12p–Apg5p-Apg16p复合物，Aut7p–PE细胞可能无法定位于自噬前结构。

我们无法识别生长Δ中的GFP–Aut7p点状结构第9页单元格（表我); 点状结构以Δ表示第9页氮保存条件下的细胞(Kim等人，2001年). 为了研究GFP–Aut7p在自噬过程中的定位，我们检测了雷帕霉素处理的Δ第9页细胞。我们观察到类似于以下描述的点状染色模式Kim等人（2001年）; 数据未显示）。然而，这些点状结构与Δ中的结构相比不太明显，强度也较低apg1型单元格（未显示数据）。这一结果表明，Apg9p在Aut7p向自噬前结构的募集中起着重要作用。

自噬特异性PI3-激酶复合物控制自噬前结构的组织，但CPY通路特异性PI3-激酶复合物不控制。在自噬特异性PI3激酶复合物突变体中，Aut7p–PE和Apg12p–Apg5p缀合物都正常产生，这表明这些缀合反应在没有复合物的情况下发生。自噬特异性PI3-激酶复合物的一个可能功能是在囊泡萌发期间选择货物(木原等2001年). 复合物可将Aut7p–PE和/或Apg12p–Apg5p结合物加载到囊泡中，以促进其运输到自噬前结构。第二种可能性是，该复合物在囊泡分选中发挥作用，允许含有Aut7p–PE和/或Apg12p–Apg5p结合物的复合物传递到自噬前结构。还有第三种可能性，PI3-激酶复合物为自噬前结构提供了磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）；然后，PI3P介导Apg12p–Apg5p共轭物和Aut7p–PE在结构中的定位。在自噬前体结构的组织过程中对自噬特异性PI3-激酶的分析将进一步了解PI3-激酶介导的一般膜动力学。

在这里，我们定义了一种前自噬体结构，它直接参与自噬小体的形成。我们还提出了许多自动发电机组基因。该报告提供了对Apg蛋白精确功能的见解。

材料和方法

酵母菌株和培养基

表中列出了本研究中使用的酵母菌株二.我们使用标准方法操作酵母(凯撒等., 1994). 细胞在YEPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%葡萄糖）或SD+CA培养基（0.17%酵母氮基，不含氨基酸和硫酸铵，0.5%硫酸铵，0.5%酪蛋白氨基酸和2%葡萄糖）中生长，如有必要，补充0.002%腺嘌呤硫酸盐、0.002%色氨酸和0.002%尿嘧啶。在含有0.5或1µg/ml雷帕霉素（Sigma）的生长培养基中诱导自噬。为了诱导氮饥饿，将细胞培养在SD（–N）培养基（0.17%酵母氮碱，不含氨基酸或硫酸铵，含2%葡萄糖）中。从Difco中提取酵母抽提物、不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱和casamino acid。蛋白胨、葡萄糖、硫酸铵、硫酸腺嘌呤、色氨酸和尿嘧啶购自Wako Pure Chemical Industries Ltd。

表二：。

本研究中使用的菌株

应变	基因型	来源
6210瑞典克朗	材料αura3 leu2 his3 trp1 lys2 suc2	达尔索等. (1997)
YW5-1B型	材料一 ura3亮氨酸trp1	Tsukada和Ohsumi（1993）
KA311A公司	材料一 ura3 leu2 his3 trp1	K.Irie（日本大阪大学）
KA311B公司	材料α Δura3 leu2 his3 trp1	K.Irie（日本大阪大学）
BJ2168型	材料一 ura3 leu2 trp1 pep4-3 prb1-1122 prc1-407	酵母遗传资源中心
TN125吨	材料一 ade2 ura3 leu2 his3 trp1 lys2 pho8：：pho8Δ60	Noda和Ohsumi（1998）
GYS102型	6210瑞典克朗Δapg1:：LEU2	本研究
MT2-4-4型	材料α Δleu2 ura3 apg2	Tsukada和Ohsumi（1993）
千伏113	6210瑞典克朗Δaut1:：LEU2	本研究
千伏13	6210瑞典克朗Δaut2:：LEU2	基里萨科等. (2000)
千伏142	6210瑞典克朗Δapg5:：LEU2	本研究
135千伏	6210瑞典克朗Δvps30:：LEU2	基里萨科等. (2000)
千伏118	6210瑞典克朗Δapg7:：HIS3	基里萨科等. (2000)
千伏安5	6210瑞典克朗Δaut7:：HIS3	基里萨科等. (1999)
千伏114	6210瑞典克朗Δapg9:：TRP1	本研究
136千伏	6210瑞典克朗Δapg10:：HIS3	本研究
千伏115	6210瑞典克朗Δapg12:：HIS3	本研究
千伏116	6210瑞典克朗Δapg13:：TRP1	本研究
GYS115型	6210瑞典克朗Δapg14:：LEU2	本研究
117千伏	6210瑞典克朗Δapg16:：LEU2	本研究
NNY20年	YW5-1BΔapg1:：LEU2	松浦等. (1997)
灰色5	YW5-1BΔaut1:：TRP1	市村真一等. (2000)
GYS6型	YW5-1BΔaut2:：LEU2	市村真一等. (2000)
SKD5-1D系列	YW5-1BΔapg5:：LEU2	卡梅塔卡等. (1996)
SKD6-1D系列	YW5-1BΔvps30:：LEU2	卡梅塔卡等. (1998)
GYS9公司	YW5-1BΔapg7:：LEU2	市村真一等. (2000)
CTD1号机组	YW5-1BΔapg9:：TRP1	野田佳彦等. (2000)
TFD10-L1型	YW5-1BΔapg10:：LEU2	真谷等. (1999)
GYS13型	YW5-1BΔapg12:：TRP1	本研究
TFD13W2型	YW5-1BΔapg13:：TRP1	富名腰等. (1997)
SKD14–1C系列	YW5-1BΔapg14:：LEU2	卡梅塔卡等. (1998)
YYK36年	KA311AΔapg1:：LEU2	卡马达等. (2000)
GYS59型	KA311AΔapg5:：HIS3	本研究
炔119	KA311BΔapg5:：HIS3	水岛等. (1998)
74瑞典克朗	KA311AΔvps30:：LEU2	本研究
YYK218年	KA311AΔaut7:：TRP1	本研究
12瑞典克朗	KA311AΔapg14:：LEU2	本研究
2011年	KA311AΔ图17:：HIS3	卡马达等. (2000)
YYK190年	BJ2168Δapg1:：LEU2	本研究
YYK126年	TN125Δapg1:：LEU2	卡马达等. (2000)
YAK3号机组	6210瑞典克朗Δ密码7:：HIS3Δapg5:：LEU2	本研究
MBY3型	6210瑞典克朗Δvps4:：TRP1	巴斯特等. (1997)
YNM117型	材料一 ura3亮氨酸trp1Δapg5:：LEU2Δapg12:：HIS3	水岛等. (1999)
YNM126型	KA311BΔapg5:：HIS3Δapg16:：LEU2	水岛等. (1998)
GYS22型	YW5-1BΔapg1:：LEU2Δapg7:：HIS3	本研究
GYS23型	YW5-1BΔapg1:：URA3Δvps30:：LEU2	本研究
GYS24型	YW5-1BΔapg1:：LEU2Δapg9:：TRP1	本研究
GYS29型	YW5-1BΔapg9:：TRP1Δapg14:：LEU2	本研究
150千伏	6210瑞典克朗Δapg4:：LEU2Δapg10:：HIS3	本研究
千伏148	6210瑞典克朗Δapg4:：LEU2Δapg12:：HIS3	本研究

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质粒

在本研究中，着丝粒质粒用于产生生理水平的表达。pRS316 GFP–AUT7质粒是通过替换pTK108中AUT7开放阅读框（ORF）起始密码子后的3×血凝素序列创建的(Kirisako等人，1999年)经改良的GFP序列（S65T）消化后巴姆你好。pRS316 GFP–AUT7FG质粒是通过在pRS316 AUT7FG起始密码子后立即替换3×myc序列而产生的(Kirisako等人，2000年). pRS314 ECFP–AUT7质粒是通过将从pECFP（Clontech）扩增的增强型CFP（ECFP）片段克隆到用巴姆你好。从得到的pRS316 ECFP–AUT7中，我们亚克隆了一个囊I–Xho公司I片段进入pRS314。pRS314 APG5–GFP和pRS416 APG9–GFP质粒是D.J.Klonsky博士（密歇根大学）慷慨赠送的礼物。使用QuikChange（Stratagene）进行定点突变，以插入巴姆HI位点进入pYAPG507，紧邻的终止密码子APG5（APG5）ORF公司(Kametaka等人，1998年)创建pRS316 APG5-EYFP质粒。从pEYFP（Clontech）中扩增出一个增强的YFP片段，用巴姆HI并克隆到巴姆pYAPG507的HI位点。

pRS316 YFP–APG1质粒是通过插入巴姆EYFP的HI盒紧跟在APG1公司ORF公司。定点突变，然后插入Bgl公司使用QuikChange的II位点通过插入不是在EYFP的停止密码之前亚太16国集团无线电频率(水岛等人，1999年).

免疫印迹分析

为了检测GFP–Aut7p或Apg12p–Apg5p–GFP结合物，将生长在SD+CA培养基中的细胞制备成密度为～OD的裂解物₆₀₀=1，通过NaOH/2-巯基乙醇萃取，稍加修改(Horvath和Reizman，1994年). 简言之，抗Aut7p抗血清(基里萨科等., 2000)分别使用抗Apg12抗血清（A.Kuma、N.Mizushima、N.Ishihara和Y.Ohsumi，正在制备中）作为主要抗体。为了检测Apg1p和API，我们使用了抗Apg1p抗血清(松浦等., 1997)和抗氨肽酶I抗血清（由D.J.Klinsky博士赠送）分别作为主要抗体。如前所述，在存在6 M尿素的情况下，通过SDS-PAGE检测到Aut7p–PE(基里萨科等., 2000). 我们收集了在YEPD培养基中培养至～OD密度的细胞₆₀₀=1或随后在SD（–N）培养基中饥饿。然后用蒸馏水清洗收集的细胞，并在含有50 mM Tris–HCl pH 7.5、150 mM NaCl、5 mM EDTA、5 mM-EGTA、1 mM苯甲烷磺酰氟（PMSF；Sigma）和蛋白酶抑制剂混合物（Complete；Roche）的缓冲液中用玻璃珠（Sigma。将细胞裂解物在SDS样品缓冲液中煮沸5 min。对等量的蛋白质（20µg蛋白质）进行电泳，转移到PVDF膜（Millipore），并通过ECL系统（Amersham Pharmacia Biotech）检测抗Aut7p抗体和过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG抗体（Seikagaku Kogyo）。使用BCA试剂盒（Pierce）测量蛋白质浓度。

显微镜

使用DeltaVision显微镜（Applied Precision）进行荧光显微镜检查。使用FM4-64（分子探针）在荧光显微镜下鉴定液泡膜。生长细胞与1µg/ml FM4-64孵育15分钟，然后在30°C下追逐30分钟。用德克萨斯红滤光片通过荧光显微镜观察标记细胞。为了在荧光显微镜下观察GFP标记的蛋白质，我们使用了FITC过滤器。CFP和YFP（86002；Chroma Technology Corp.）的双频带滤光片组用于检测CFP-和YFP-标记蛋白的定位。在延时视频显微镜中，用ΔTC3培养皿系统（Bioptechs）控制培养温度。

如前所述进行免疫荧光显微镜检查(西川等., 1994). 携带APG9–GFP质粒的细胞在SD+CA培养基中生长，密度为～OD₆₀₀= 1.5. 然后用0.5µg/ml雷帕霉素处理培养物2小时，然后固定在5%甲醛中。然后将细胞转化为球形体，并在室温下用含有0.5%Triton X-100的PBS渗透10分钟。接下来，将细胞滴到预先涂有聚赖氨酸（Sigma）的多孔玻片上（Celline Associates）。使用亲和纯化的抗Aut7p抗体作为一级抗体，然后与Cy5-共轭二级抗体（Amersham）孵育。对于GFP标记蛋白的双重标记，我们使用Cy5，一种荧光染料（Ex:649 nm和Em:670 nm），以尽量减少荧光渗入GFP通道（Ex:489 nm和Em:511 nm）。分别用FITC和Cy5过滤器组观察GFP和Cy5。

碱性磷酸酶测定

通过测量表达胞浆型磷酸酶（Pho8Δ60p；野田佳彦等., 1995). 以α-磷酸萘（Sigma）为底物。Pho8Δ60p通过自噬被转运至液泡，并在液泡腔中被处理而激活。

apg1ts等位基因的产生

APG1公司通过前面描述的PCR程序进行诱变(卡德维尔和乔伊斯，1995年). 将突变基因与带有缺口pRS316质粒的YYK190细胞共转化，该质粒含有与PCR产物两端同源的部分。采集了240个菌落，并将其贴在YEPD平板上，然后在30和37°C下培养过夜。然后在每个温度下用0.4µg/ml雷帕霉素处理细胞。我们在相控显微镜下观察了自噬体的生成。从通过初始筛选的22个集落中回收的质粒用于重新转化YYK190细胞，以确认温度敏感表型。

通过初步筛选的八株菌株接受ALP分析，以量化自噬活性。用每个候选质粒转化YYK126细胞。细胞在23°C的YEPD培养基中培养；在23或37°C条件下，在氮气饥饿6小时后测量ALP活性。五株菌株最终被确认为温度敏感突变体。五个表现出明显温度敏感性的菌株中的两个用于进一步分析。从这两个菌株中回收的质粒具有相同的序列。该等位基因被用作apg1型^ts秒温度敏感性由以下氨基酸取代引起：L88H、F112L和S158P。

致谢

我们感谢Daniel J.Klonsky博士慷慨提供质粒。我们还要感谢内本隆吉先生、原口德子博士和平冈康树博士在荧光显微镜方面的技术建议。我们要感谢Scott D.Emr博士、Akiko Kuma女士、Yoshinobu Ichimura先生、Akio Kihara博士和Takahiro Shintani博士捐赠细胞株，以及他们的有益讨论。我们还要感谢NIBB分析仪器中心的技术援助。这项工作得到了日本教育、科学、体育和文化部科学研究补助金的部分支持。K.S.得到了日本青年科学家科学促进会研究奖学金的支持。

工具书类

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