p27的数量是决定G中细胞数量的关键决定因素1退出或提交细胞周期并进入S期。p27抑制细胞周期蛋白E-cdk2(56). 这种激酶对S期的进入既是必要的，也是速率限制的(42,43,50)并以G的形式增加三倍1细胞致力于DNA复制(11,28). 在G中段激活后1，它会触发一个正反馈回路，两者都会使Rb失活(22,26)促进p27降解(41,55,61)最终过渡到S阶段。
p27蛋白数量的微小变化可能会产生显著的表型后果：p27杂合子小鼠的蛋白数量是野生型的一半，并表现出中等的生长表型(27). 此外，在p27杂合小鼠和完全缺乏p27的动物中，致癌物诱导的肿瘤发展相似(16). 这些后果可归因于p27作为抗有丝分裂信号的媒介的作用(7,9,12,45,59). 在p27缺失的情况下，细胞暴露于诱导生长停滞的信号后，无法及时退出细胞周期，经历更多有丝分裂，直到其他途径介导其退出细胞周期(7,12,59). 这些协作或冗余路径的性质并不总是明确的；然而，其他cdk抑制剂和Rb样蛋白p130与成纤维细胞有关，至少与细胞周期蛋白E-cdk2的失活有关(9).
不管冗余的可能性如何，p27的失败−/−细胞对生长停滞信号作出适当反应会导致疾病。在黄体细胞中，p27的缺乏导致受孕后雌二醇信号的干扰并阻止胚胎着床(59). 耳朵的组织，特别是听觉能力，也受到损害(8,31)p27缺乏的动物会发生肿瘤(10,17,27,40,45). 因此，了解p27的可用性是如何控制的将影响我们对组织组织如何发生以及细胞如何相互通信的理解。
p27蛋白在G中最丰富1随着细胞进入S期，细胞数量急剧减少，在细胞周期的剩余时间内保持较低水平(35). p27的表达可以在基因转录水平上控制(29)，翻译(1,23,35)，扣押(57)，核定位(58)，和蛋白水解(41,44). p27的蛋白水解依赖于cdk2(41,55,61)可能还有skp2(6,50,60)，合谋调节p27的泛素依赖性蛋白水解降解，这一现象可能确保承诺决定的不可逆性，因为这些蛋白质在G之前或与G同时被激活或产生1/S过渡。许多研究小组认为，促进生长停滞的信号可能通过直接干扰p27蛋白水解而起作用；然而，因果关系尚不完全清楚，因为p27蛋白水解依赖于细胞进入S期后发生的蛋白质和活动。
另一方面，生长停滞伴随着在异步细胞中观察到的高于基础状态的p27 mRNA的翻译增加。在静止的磷酸十四酯（TPA）处理的HL-60细胞中，p27蛋白的合成增加，与多聚体相关的p27 mRNA数量增加相关(35). 同样，在G中期阻滞的细胞中，p27的合成速率增加1洛伐他汀(23). 此外，p27 mRNA的翻译继续进入S期（大概G2阶段），但蛋白质的蛋白水解阻止其积累(35). 因此，p27 mRNA的翻译速率可以以信号依赖的方式变化：生长细胞中的基本速率和生长抑制细胞中的升高速率（诱导）。
以下观察提示我们将p27 mRNA的翻译调控作为促进G细胞生长停滞的机制1细胞。首先，p27的稳态量对承诺过程至关重要，这是合成速率和降解速率的总和。第二，由于蛋白水解依赖于cdk2活性和skp2，这两种蛋白都是在细胞周期发生之后出现的，因此它们似乎无法有效控制p27在早期G细胞中的积累1细胞，它决定着增殖和生长停滞。然而，如果翻译可以以细胞周期相依赖的方式诱导，人们会认为合成速率的变化可能会克服蛋白水解障碍，p27会积累。在本报告中，我们证明p27 mRNA在基础（增殖）和诱导（非增殖）状态下的翻译需要p27 mRNA的5′非翻译区（5′UTR）中的富U序列。该序列促进了mRNA的多聚体关联。两种蛋白质，命名为p33和p40/41，来自异步细胞的胞浆提取物可以交联到5′UTR。这些因子在诺卡唑处理的细胞（G2/M停滞）和洛伐他汀处理的细胞（G1与羟基脲处理的细胞（G1/S相制动）。我们确定p33为HuR，它独立于其他蛋白质与富铀元素结合，p40/41为hnRNP C1/C2。我们根据p27的翻译调控在抗有丝分裂信号反应中的作用来讨论这些RNP的细胞周期调控形成。
材料和方法
细胞培养和药物治疗。
HeLa S3细胞在无Ca的最小Eagle's培养基（MEM）中悬浮培养2+并补充10%浓缩小牛血清（双子座）。293T细胞保存在添加了4.5g/L葡萄糖（DME HG）、2mM谷氨酰胺和10%胎牛血清（FBS；Gemini）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DME）中。MDA468细胞生长在DME HG和F12的1:1混合液中，再加上补充有10%FBS和2 mM谷氨酰胺的非必需氨基酸。在所有细胞系中，诺卡唑（西格玛）和羟基脲（西格马）分别在2μM下使用12小时和2 mM下使用24小时。洛伐他汀（默克）在30μM下使用48小时。放线菌素D（西格玛）在5μg/ml下使用。
寡核苷酸。
使用的寡核苷酸为SSM16（5′GCTGTCCTTAAGAGCTATAGTGGAAGTTTTTT3′）、SSM17（5′CATTCAGCGCCCAGCTCGAATTAGAATTAAGAT3′），SSM23（5′GC TGTCGAATTCTAGCTCGAGCGCCGT3′）、T7SSM23 AAAAC3′），SSM32（5′CATTCAGTATGCGCCTTACAATAATTGGACTTTCCGCC3′）、SSM40（5′GCGGTCCACTCTCTAGAGGAT3′），SSM45（5′GGACTCAGATCTCGAGAT3’）、SSM 46（5′CATCAGTAGCCCGAACAAAAGC3′）、SS M47（5′CatTCAGCTTGCAGACCGAGAAAG3′）ATACAAACC3′），SSM52（5′GGTTTGTGATTCGAGCATCGGCATTCACTTCGCTG3′）、SSM53（5′GCTGTCGGATCACAAACGTGCGAGTG3’）和SSM55（5′CATTCTATGGCGCTCAGTGGTGGTGGTGTGGTG）。
来自Curachem的42核苷酸转录物和RNA的序列包括核苷酸77至118，如图所示。.
5′UTR积极影响所需的富铀元素。（A） 小鼠、大鼠和人类p27 5′UTR序列之间的同源性。序列与编码起始蛋氨酸的ATG序列在末尾对齐。三个序列中的两个序列中相同的核苷酸用黑框表示。ΔU突变删除的序列下划线。（B） 5′UTR的结构褶皱模型。使用mFOLD程序(34)预测了5′UTR的结构。（C） 富U序列是5′UTR功能所必需的。如图图例所示，转染HeLa细胞。使用每个栏下面列出的构造。积累被归一化为缺乏p27 UTR序列的亲本荧光素酶结构的积累（设置为100%）。指出了三个独立实验的平均值和标准偏差。
无关的加扰寡核苷酸为5′UGAUCUGACAAUGGCGUAAUCCAGAGCGCAGUUGUAUUCAUUUUUGAA3′。
图中使用的165-核苷酸γ-珠蛋白转录本。C是由pSP65Hγ（亨利·富尔诺的礼物）线性化得到的绍3AI。它包含80个编码序列的核苷酸和85个3′UTR的核苷酸。
p33是ELAV蛋白HuR。（A） HuR在G的胞浆中富集2/M细胞与S期或指数生长细胞相比较。从异步指数生长的293T细胞（Expo）、用羟基脲（G1/S） 和用诺卡唑处理的细胞（G2/M） ，80μg每种提取物通过SDS-PAGE溶解，转移到聚偏氟乙烯膜上，并用每个面板右侧所示的抗α-管蛋白或HuR抗体进行印迹。分子大小标记显示在左侧。面板上方显示了每种提取物的来源。（B） G细胞溶质中的HuR2/M细胞与5′UTR结合。对于免疫沉淀，交联如图图例所示。但数量增加了五倍。一个样品没有与抗体一起孵育；另一组用19F12抗HuR单克隆抗体或抗细菌TrpE蛋白的单克隆抗体孵育，如上每条泳道所示。（C） 纯化的HuR与p27 mRNA的5′UTR结合。从细菌培养物中纯化出越来越多的重组GST-HuR，并用均匀标记的5′UTR RNA或来自γ-珠蛋白mRNA的165个核苷酸的大小匹配序列进行培养。每个结合反应中GST或GST-HuR的量显示在每个通道下面。自由和束缚探针的迁移（箭头）显示在放射自显影的右侧。（D） 富铀元素是HuR绑定所必需的。通过标准PCR克隆程序产生5′UTR中的突变体，并用作生产转录物的模板，以评估纯化GST-HuR和p33的结合。图中显示了5′缺失序列的示意图，每个突变体的编号如图所示。A.突变转录物结合重组蛋白并与G中p33交联的能力2/显示M提取物。仅用GST-HuR或GST进行结合反应。结合活性分为阳性或阴性。ND，未完成。在这些条件下，我们无法检测到GST与转录本的结合。上标a表示本研究中通常用作ΔU的转录本，b表示面板E中使用的42-核苷酸（nt）竞争对手的序列。（E）富铀元素足以与5′UTR探针的HuR结合竞争。如图图例所示。C、 均匀标记的5′UTR转录物与50 nM GST-HuR在含有或不含越来越多的含富铀元素的42-核苷酸RNA或扰乱的寡核苷酸（Curachem；文本中显示的序列）的情况下孵育。结合反应的产物用EMSA进行了解析。使用的参赛者和相对于标记成绩单的折叠显示在每条车道的上方。GST HuR的存在或不存在显示在每条车道下方。自由探针和束缚探针的迁移（箭头）显示在放射自显影的右侧。
人p27 5′UTR的分离。
引物SSM23和SSM30用于扩增从EMBL3 SP6/T7基因组文库（Clontech）分离的基因组克隆中包含5′UTR的序列。然后将该PCR产物克隆到绿色荧光蛋白（GFP）和荧光素酶表达载体中，如下所述，并使用引物SSM40、SSM45、SSM48和GL引物2（Promega）进行测序。
抗体。
按说明进行蛋白质印迹(57). 亲合力纯化的抗p27抗体已被描述(57). 已描述19F12抗HuR单克隆抗体（H.Furneaux，提交出版）。抗cdk2（M2；Santa Cruz Biotechnology）、α-微管蛋白（T9026；Sigma）和β-半乳糖苷酶（Z378A；Promega）的抗体可在市场上买到。
核和细胞质RNA和蛋白质的分离。
如前所述获得核和细胞质RNA(53). 核蛋白和细胞质蛋白提取物的制备如下所述(62).
构建p27ck报告器。
人类p27 PV→KK的细胞周期蛋白结合域突变(32)通过使用SSM51和SSM52以及Quickchange系统（Stratagene）进行定点突变进一步突变。这在cdk结合域中产生了FDF→ADA突变。然后使用引物SSM53和SSM55通过PCR扩增p27ck−突变体，并定向克隆到巴姆高-和不是I消化pSVL载体。所有克隆均经直接测序证实。
荧光素酶报告子的构建。
通过将猴病毒40（SV40）启动子（核苷酸22至239）从pGL-2启动子（Promega）直接亚克隆到Xho公司我和Hin公司dIII位点的pEGFP-1（Clontech）产生pSVG。利用引物SSM23和SSM30从人类基因组克隆中扩增出p27 5′UTR。利用引物SSM16和SSM17从pBΔ5′p27中扩增出p27 3′UTR。这些产物被定向克隆到pSVG中。使用引物SSM31和SSM32以及pGL2启动子载体将pSVG序列中的GFP序列替换为荧光素酶PCR产物。这创建了pSVL系列构造。要生成带有SV40多聚腺苷化信号的克隆Xho公司我-不是将I消化的pEGFP-1载体连接到和Xho公司我-Afl公司II-缩小pSVL嵌件。
使用p5′SVL和引物SSM45、SSM46、SSM47和SSM48对5′UTR的富U元素进行PCR，以取代富U元素Nhe公司我的网站。
转染试验。
为了转染HeLa细胞，我们将8×106用10μg pSVL构建体、5μg pCMV-β和5μg pCDNA3（Invitrogen）在0.4-cm比色皿中的最终体积为800μl的细胞。使用Bio-Rad电穿孔器在0.28 kV和960μF下对细胞进行电穿孔，然后在收获前电镀24 h。使用CaPO转染293T和MDA468细胞4（Gibco-BRL）根据制造商的说明。在CaPO作用24小时后收获293T细胞4冲洗沉淀，48小时后使用MDA468。
核糖核酸酶保护试验。
为了生成用于RNase保护分析的荧光素酶探针，我们亚克隆了一个巴姆HI（高）-不是I PCR产物从pGL-2启动子进入pBluescript II（Clontech）。该克隆（pB-LUC）被消化派克靴I并用T7 RNA聚合酶（Gibco-BRL）转录，产生375-核苷酸反义探针。对于β-半乳糖苷酶，我们亚克隆了一个Acc公司我-Nde公司pCMV-β（Clontech）的I（钝）片段至Acc公司I-和Sma公司我消化了pBluescriptⅡ。该克隆（pB-βAcc-Nde）用Acc公司I并用T7 RNA聚合酶转录，产生249-核苷酸反义转录物。转染细胞RNA中检测到的受保护荧光素酶和β-半乳糖苷酶转录物的大小分别为325和193个核苷酸。RNase保护按说明执行(51).
内源性c-myc公司使用小鼠pTri c-myc/外显子3（Ambion）检测转录物。人类和小鼠外显子3序列在两个核苷酸处发生分歧，从而产生三个受保护的片段。
多聚体梯度。
如前所述制备并运行连续蔗糖梯度（10 ml，15-40%）(35)，以下修改除外。将每1ml部分直接收集到120μl 8.3%十二烷基硫酸钠（SDS）和83 mM EDTA中。然后添加200μg蛋白酶K，样品在37°C下培养15分钟，并用酚-氯仿萃取。
EMSA和UV交联分析。
对于电泳迁移率转移分析（EMSA），使用T7SSM23和SSM30对合适的pSVL模板进行PCR扩增，制备5′UTR RNA转录物，并使用T7 RNA聚合酶进行转录。按照说明制备放射性标记探针和谷胱甘肽S-转移酶（GST）-HuR(24). 每个探针的比活性为1×104至5×104cpm/pmol。
使用提取物作为蛋白质来源进行结合反应，体积为20μl，包含20 fmol转录物、15μg蛋白质提取物、50μg tRNA、50 mM Tris（pH 7.0）和5μg牛血清白蛋白。反应基本上按照描述进行(24).
对于UV交联实验，在孵育后，以1200μJ/cm的剂量照射结合反应2在地层链接器（Stratagene）中。RNase A（Sigma）和RNase T1然后将（Calbiotech）分别添加至500μg/ml和250 U/ml，并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）之前在30°C下培养15分钟。
hnRNP C1/C2的纯化。
将HeLa核提取物（60 mg）加载到5 ml HiTrap Q-Sepharose柱上，并用0.25至0.5 M线性KCl梯度洗脱。p40/41活性在0.4 M KCl的主要蛋白峰后洗脱。将来自Q柱的混合组分加载到1 ml甲基-脑葡萄糖柱上，并以1到0 M（NH）的线性梯度洗脱4)2所以4在0.45 M（NH）下洗脱的.p40/41活性4)2所以4将这些组分汇集在一起，装入1ml HiTra SP-Sepharose柱中，并用0.05-1M KCl梯度洗脱；峰值活性在0.45 M KCl下洗脱。切除考马斯染色的p40和p41条带，以进行质谱指纹分析(13).
结果
p27 mRNA的5′UTR中的富铀元素促进多聚体结合。
为了更好地理解p27的翻译调控及其在细胞周期和生长停滞中的作用，我们需要首先分离人类p27的5′和3′UTR。我们通过在GenBank数据库中定义contig获得了3′UTR序列，并对两条链上的重叠克隆进行了测序（图。A） ●●●●。我们通过对编码p27位点的基因组克隆进行测序获得了5′UTR序列（未公开数据）。这个序列基本上与南弥及其同事发表的序列一致(36); 唯一的例外情况（如图所示。A） 分别是T到C的变化和位置37和66/67处G核苷酸的缺失。这些差异可能是由于多态性或测序错误造成的。我们推断顺式-作用调控序列可能位于5′UTR、3′UTR或开放阅读框（ORF）或这些元素的任何组合中。
p27 mRNA的5′UTR包含增强异源报告基因表达的序列。（A） p27 mRNA编码序列。通过鉴定和测序与p27 ORF同源的表达序列标签，获得3′UTR序列(AA206936型,18972兰特、和AA180937型). 为了确定5′UTR序列，我们将HL-60 mRNA作为模板的5′RACE分析与从人类基因组克隆获得的序列相结合。5′UTR序列与Minami及其同事报道的核苷酸差异(36)顺序如下所示。起始密码子和终止密码子下划线。（B） 需要5′UTR来克服3′UTR对p27积累的抑制作用。用10μg的表达载体转染293T细胞，该表达载体编码p27（p27ck−）的非环素/cdk结合形式，具有上述每个通道定义的p27 UTR的不同组合。然后共转染5μg表达巨细胞病毒启动子β-半乳糖苷酶基因（β-gal）的质粒。本文描述了转染条件和蛋白质提取。提取后，将裂解产物归一化为β-半乳糖苷酶活性，并通过SDS-PAGE解析等效单位，并用抗β-半乳糖苷酶抗体（βgal）或抗p27抗体进行Western印迹，如右图所示。（C） UTR的作用与ORF内的序列无关。实验上与B组相似，但荧光素酶替代了表达载体中的p27ck−ORF，我们使用HeLa细胞。所使用的UTR显示在每一条的下方，β-半乳糖苷酶标准化荧光素酶的积累显示在年轴。该实验重复了五次以上，结果相似，并显示了一个具有代表性的实验。（D） p27 UTR序列的存在并不影响mRNA的产量。该面板中的数据与面板C中显示的转染相匹配。我们通过RNase保护试验测定了10μg细胞溶质HeLa mRNA中荧光素酶（luc）和β-半乳糖苷酶（β-gal）mRNA的量β-半乳糖苷酶（193个核苷酸）转录本用箭头表示。最右边的车道显示了无保护探针的活动性。我们使用10μg tRNA作为阴性对照。
为了研究这些元素中哪些控制翻译，我们将整个p27 cDNA或缺失5′或3′UTR的版本亚克隆到包含SV40早期启动子和多聚腺苷化信号的载体中。为了防止p27的表达改变细胞周期中细胞的分布，但保持全长mRNA的假定二级结构，我们突变了10个核苷酸，编码cyclin-cdk结合和抑制所需的四个氨基酸（p27ck−）(61). 用这些结构体转染293T细胞并没有导致细胞周期分布的改变（数据未显示）。用β-半乳糖苷酶表达载体共同转染细胞，使p27表达正常化，我们通过免疫印迹法检测p27的积累（图。B） ●●●●。含有5′和3′UTR的构建物的蛋白表达几乎与在没有任何额外UTR序列的对照构建物中观察到的蛋白表达相同。从这一点出发，我们使用短语no UTR来表示基本结构，其中包含由表达载体提供的UTR序列，但不包含额外的p27 mRNA序列。然而，当单独存在3′UTR时，p27ck−的表达显著减少，而单独存在5′UTR可以促进表达。因此，5′UTR可以抑制或克服3′UTR对p27ck−积累的负面影响。这表明在5′UTR中有一个积极的调节因素。为了确定UTR依赖性效应是否需要ORF中的序列，我们将p27编码序列替换为荧光素酶并重复分析。当β-半乳糖苷酶标准化时，检测到荧光素酶表达的类似UTR依赖性变化。5′UTR能够将荧光素酶的表达增加2到3倍，而3′UTR抑制荧光素酶的表达超过10倍。当荧光素酶报告子上同时存在两种UTR时，5′UTR能够抑制3′UTR的许多负面影响（图。C） ●●●●。通过RNase保护测定的每个转录产物的产量在所有样本中都是相等的，这表明活性测定并不能反映稳态mRNA水平的差异（图。C） ●●●●。这消除了p27 ORF中的序列导致UTR依赖性效应的可能性。
蛋白质的稳态量可能受到许多因素的影响：细胞核中mRNA合成和输出的速率、细胞溶质中mRNA的稳定性以及mRNA并入多聚体。为了确定5′UTR序列如何影响荧光素酶mRNA的积累和利用，我们使用5′-plus-3′UTR结构和单独使用3′UTR构造检查了胞液中mRNA的数量、胞液mRNA的半衰期以及多聚体中mRNA之间的关联（图。). 当对共转染β-半乳糖苷酶mRNA的量进行标准化时，转染细胞胞浆中mRNA的数量对于两种构建物来说是相等的（图。A） 这表明细胞溶质中mRNA的积累没有受到UTR依赖性方式的影响。在放线菌素D存在下，我们也没有观察到这些信息的半衰期有任何明显的UTR依赖性变化。内源性c-myc公司mRNA在相同样品中的半衰期约为40分钟，证实药物治疗有效（图。B） ●●●●。还进行了长达12小时的放线菌素D培养，发现mRNA半衰期没有UTR特异性差异（数据未显示）。因此，由5′和3′UTR控制的萤光素酶的积累可能是由于翻译影响。
p27 mRNA的5′UTR包含一个序列，可以增强编码它的mRNA的翻译。（a）RNA定位。用β-半乳糖苷酶表达载体将5′和3′UTR侧翼的荧光素酶表达载体或仅3′UTRs共同转染到HeLa细胞中，如图图例所示。如文中所述分离细胞溶胶（C）和核（N）RNA，并通过RNase保护试验测定10μg中荧光素酶和β-半乳糖苷酶mRNA的数量。在每个样本下方，我们指出RNA的来源和所用探针：胞浆（C）或核（N），5′和3′UTR（5′+3′）或3′UTRs单独（3′）。使用MacBas软件在荧光成像仪上进行定量。显示了代表性数据；实验在两种不同的提取条件下重复两次。（B） RNA半衰期。在提取细胞溶质mRNA之前，将HeLa细胞转染为A组，并用放线菌素D（5μg/ml）处理各通道上方指定的时间（分钟）。所使用的含UTR的构建物显示在每组样品上方。作为放线菌素处理的对照，对内源性c-myc公司显示了5′和3′表达结构转染细胞的mRNA水平。（C） 多聚体联合。与A组一样，293T或HeLa细胞与荧光素酶表达载体共转染，该表达载体两侧为5′和3′UTR或仅3′UTRs与另一个表达β-半乳糖苷酶的质粒。随后，将细胞分为两个群体，其中一个群体再接受嘌呤霉素（150μg/ml）30分钟。按所述制备细胞溶胶RNA(35)并在连续蔗糖梯度上进行分级。收集级分（1ml）（在每次记录下方编号），并在收集过程中测定其在254nm处的吸光度。实线表示模拟处理的样品，虚线表示嘌呤霉素（puro）处理的样品。显示了游离mRNA、40S和60S的迁移。随后，每一部分的一半被用作RNase保护试验的RNA来源，如图图例所示。每个面板包含使用5′和3′UTR或仅使用3′UTRs的单个实验的数据。在表中，我们指出了多体（嘌呤霉素敏感）、单体或相关亚单位以及游离RNA中的mRNA数量占总RNA的百分比。显示了两种不同细胞系中的两种典型转染。
为了进一步证实这一点，我们在连续蔗糖梯度上分离转染细胞的细胞溶质提取物，并监测254nm处的吸光度，以跟踪RNP复合物（图。C） ●●●●。为了明确识别含有多聚体的梯度区域，我们用嘌呤霉素处理平行培养物并分离RNA。嘌呤菌素使mRNA在梯度的单体和亚单位部分积累（图。C） ●●●●。简单地比较每个组分中嘌呤霉素敏感物质的数量，很明显，与仅含有3′UTR的荧光素酶mRNA相比，含有5′和3′UTRs的荧光素酶mRNA富集在梯度的较重区域。然而，共转染的β-半乳糖苷酶mRNA在这两个细胞群体中的分布没有显著差异（图。C） ●●●●。这坚定地证明了5′UTR含有促进循环细胞中多聚体结合的序列。
接下来，我们想确定5′UTR中负责这种积极作用的序列，并确定它们是否以细胞周期相特异的方式与蛋白质相互作用。小鼠、人和大鼠5′UTR的序列比较（图。A） 显示存在高度保守的富铀元素。还发现了其他保守区域，尤其是该元素和起始蛋氨酸之间的保守区域。5′UTR二次结构检查（图。B） 发现富铀元素可以形成一个由稳定的茎结构包围的环。类似的干环结构与铁蛋白和其他信使核糖核酸翻译起始的调控有关(37,38,52). 为了测试富铀环的重要性，我们删除了组成环的核苷酸和3′端的一些附加核苷酸（图中下划线）。A） ●●●●。去除3′茎核苷酸以确保茎环结构完全破坏。在含有或缺乏3′UTR的构建物中，5′UTR富U元素的缺失降低了荧光素酶的表达，甚至低于在亲本载体中观察到的表达（图。C） ●●●●。在所有情况下，mRNA的数量和mRNA的半衰期均未受到显著影响（数据未显示）。这表明富铀元素是有效翻译该信息所必需的，如果没有富铀元素，5′UTR序列或由其形成的结构都能够抑制翻译。从这些研究中我们得出结论，5′UTR含有一种富铀元素，参与将p27 mRNA并入循环细胞中的多聚体。
5′UTR以细胞周期相依赖的方式结合复合物。
在定义了5′UTR在p27 mRNA翻译中的作用并注意到富铀元素参与后，我们接下来想确定是否可以识别以富铀元素依赖性方式与5′UTRs相互作用的蛋白质。我们使用RNA EMSA来确定是否可以在5′UTR上形成蛋白质复合物。我们从293T细胞的异步培养物中提取细胞溶质提取物，并将其与均匀标记的5′UTR转录物孵育，其中存在10万倍摩尔过量的非特异性tRNA。A） ●●●●。在使用的条件下，约50%的RNA保持游离（当结合最大时，即与G2-M提取物），由EMSA测定（图。A） ●●●●。正如预期的那样，增加蛋白质的量会增加结合RNA的量，但在蛋白质与转录物的比例较高时，相互作用的特异性会受到损害（数据未显示）。
RNP复合物在5′UTR上以细胞周期相特异的方式形成，依赖于富铀元素。（A） p27 mRNA的5′UTR上形成RNP复合物。细胞溶胶提取物是从异步指数生长的293T细胞（Expo）中制备的，细胞经2 mM羟基脲（G1/S） 和用2μM诺卡唑（G2/M） 15μg提取物与20 fmol均匀标记的5′UTR转录物结合，在放射自显影前通过天然1%琼脂糖凝胶电泳分离游离和结合探针。细胞溶质G2/M提取物的结合活性最高。（B） 5′UTR结合物种的有效竞争需要富铀元素。与A组相似，但在G组孵化期间2/我们添加了5′UTR或缺乏富铀元素（ΔU）的5′UTR-作为未标记竞争物。参赛者对成绩单的摩尔超额显示在每条车道的上方。左侧的第一条通道显示了探针的迁移，没有添加任何提取。第二条通道显示带有G的探针2/M细胞溶质提取物，无竞争对手。（C） p33和p40/41可以与5′UTR进行紫外线交联，并富含从G2/M期细胞。在A组处理后，分离细胞核和胞浆，并制备提取物以与均匀标记的5′UTR转录物结合。随后，如文中所述，反应产物通过UV交联，RNA降解，所得产物通过SDS-PAGE解析并通过放射自显影检测。只有标有星号的产品才能通过紫外线进行特殊交联。其他谱带是提取物依赖性的，但不是UV依赖性的（例如，见图。D和B） ●●●●。很明显，核蛋白和细胞溶质蛋白都可以交联；然而，从G制备的提取物中蛋白质的数量增加2/富含M的细胞。（D） p33和p40/41结合需要富铀元素。与面板C中一样，G2/M提取物与均匀标记探针孵育；然而，中间的两条车道包括500倍的摩尔过剩量，要么是未标记的竞争对手5′UTR，要么是缺乏富铀元素（ΔU）的5′UTR。此外，使用缺乏富铀元素的均匀标记的5′UTR，我们无法检测到任何特定的结合蛋白（右侧最后两个通道）。探针显示在自动射线照片下方。紫外线处理显示在每条车道下方。竞争对手显示在相应的车道上方。分子大小标记如左图所示。
接下来，我们询问这种结合活性是否在细胞周期的特定阶段得到增强。为了实现这一点，我们从羟脲处理或诺卡达唑处理的细胞中制备了细胞溶质提取物。这些处理导致G细胞的积累1/S阶段和后期G2/M相。将这些提取物与5′UTR转录物孵育，并通过琼脂糖凝胶电泳解析结合和游离RNA，证明诺卡达唑处理细胞的提取物中富含复合物（图。A） ●●●●。这种复合物可以被未标记的5′UTR RNA的100倍摩尔过量竞争，但不能被缺乏富铀元素的类似竞争对手的1000倍摩尔过量（图。B） ●●●●。
为了确定直接接触5′UTR的蛋白质的分子量，我们进行了UV交联实验。我们从羟基脲和诺卡达唑处理的细胞中制备细胞核和细胞溶质提取物，使其与紫外线发生结合反应，并在SDS-PAGE上解析标记蛋白之前消化RNA。三种交联物种，一种以40/41 kDa迁移的双链物种和一种33kDa蛋白，在晚期G2/M细胞与S期细胞的比较。核提取物中类似蛋白质的含量至少相同或更高（图。C） ●●●●。在S期细胞的提取物中，p40/41和p33主要是细胞核，细胞溶质蛋白很少。在异步细胞的胞质提取物中，可以检测到所有三种物种（数据未显示）。重要的是，这些蛋白质与5′UTR的交联依赖于富铀元素（图。D） ●●●●。这些相互作用可以通过含有富铀元素的未标记竞争对手的500倍摩尔过剩量来竞争，但不能通过缺乏该元素的未标签转录本来竞争（图。D） ●●●●。因此，从这些数据中我们得出结论，在G的胞浆中可以检测到5′UTR富U元素依赖性结合活性2/M细胞。这些研究尚不清楚这些蛋白质是否与相同或不同的RNA结合。
p33蛋白是HuR。
接下来，我们想确定与富铀元素相互作用的蛋白质。ELAV RNA结合蛋白家族的成员因多种原因成为候选成员。交联物种的大小与报道的HuR的36-kDa大小相似。有证据表明，HuR的定位在细胞周期中发生变化，在G2电池（图。A）(三)HuR可以在细胞核和细胞溶质之间穿梭(14,15,46). 此外，HuR还参与调节mRNA的稳定性和转运(18,25,30,33,39,46)以及翻译(2).
为了确定HuR是否与5′UTR结合，我们尝试在晚期G2/M细胞溶质提取物。使用针对HuR（Furneaux，提交）的单克隆抗体，我们能够免疫沉淀p33物种，而不是用针对TrpE的无关同型匹配抗体沉淀（图。B） ●●●●。
接下来我们询问HuR与p27 5′UTR的结合是否依赖于G中的其他因素2/M提取物，即p40/41。将纯化的重组HuR与标记的转录物一起孵育，并测定复合物的形成。GST-HuR与p27 5′UTR结合，而不是对照γ-珠蛋白转录物，而GST没有（图。C） ●●●●。通过缺失分析和结合分析，我们确定了一个与HuR结合所需的富铀元素重叠的42-核苷酸区域（图。D、 和未发布的数据）。编码该42-核苷酸区域的RNA有效地竞争HuR结合，而碱基组成相似的无关寡核苷酸则没有（图。E） ●●●●。这表明HuR可以与p27的5′UTR中的富U序列结合。这些数据共同表明，33-kDa物种与G2/M相特定方式为HuR。此外，HuR与5′UTR位点的结合并不依赖于细胞提取物中存在的其他因素。据我们所知，这是首次在mRNA的5′UTR中定义哺乳动物ELAV蛋白的结合位点。
p40/41是hnRNP C1/C2。
为了鉴定p40/41结合活性，我们使用上述离子交换色谱和UV交联分析来纯化这些蛋白质。在确定分析的线性范围后，我们将1个单位定义为磷光成像仪屏幕上200个交联活性计数。
我们能够检测到诺卡唑处理细胞细胞质中的p40/41结合活性，但使用EMSA和交联，我们发现HeLa细胞核的1 M NaCl提取液具有最高的比活性（数据未显示）。因此，我们将其作为纯化的起始材料。初步结合研究表明，p40/41可以被Q、甲基和SP基质吸收和洗脱；因此，我们使用这三个柱从60 mg HeLa核提取物中纯化p40/41结合活性（图。A） ●●●●。该净化方案使p40/41的净化率提高了141倍（图。B） ●●●●。SP级分在SDS-PAGE凝胶上运行，并用银染色（图。A） 和考马斯。40kDa的双链迁移与p40/41 5′UTR结合活性共分馏。切除考马斯染色的p40和p41条带，以进行质谱指纹分析(13).
p40/41是hnRNP C1/C2。（A和B）纯化p40/41结合活性。显示了纯化程序和银染凝胶监测纯化。如图图例所示，通过洗脱组分的UV交联测量5′UTR结合活性。C.为了获得p40/41物种的序列，用制备性SDS-PAGE解析SP柱的最后部分；切除该区域并进行胰蛋白酶消化，并用质谱分析产物。净化表如图所示。尺寸以千道尔顿为单位。（C） hnRNP C1/C2与5′UTR结合。如图图例所述进行交联和免疫沉淀。B使用C1/C2（4F4）单克隆抗体代替HuR。沉淀物和上清液中的产物通过SDS-PAGE进行解析。用4F4免疫沉淀后，p40/41在免疫沉淀中富集，在上清液中适当减少。其迁移显示在放射自显影的右侧。免疫沉淀的颗粒和上清液显示在每条车道的上方。
p40和p41的肽质量指纹图谱确定它们为hnRNP C1和C2，这是一对先前描述的RNA结合蛋白。hnRNP C1和C2是同一基因的交替剪接产物，在蛋白质中部附近有13个氨基酸的差异(5). 这两种蛋白质在SDS-PAGE凝胶上以双重形式迁移，C2迁移速度比C1慢(47). 抗hnRNP C1/C2的单克隆抗体(47)能够免疫沉淀HeLa核提取物中的p27 5′UTR p40/41结合活性，而抗细菌TrpE的单克隆抗体不能（图。C） ●●●●。我们得出结论，p40/41结合活性由hnRNP C1/C2蛋白组成。
hnRNP C1和C2是可能参与mRNA加工的核蛋白(48). 它们以高亲和力结合mRNA上的富U序列(21). 最近的研究表明，在与翻译诱导血小板衍生生长因子（PDGF）mRNA结合的分化细胞的细胞质中，这些蛋白可能在细胞质中发挥作用(54). 因此，当C蛋白位于细胞质中时，它们可能会调节翻译。
生长抑制细胞中RNP复合物的翻译和形成。
在确定了上述含有HuR和/或hnRNP C1/C2的RNP复合物将在5′UTR上形成后，我们接下来想确定这些蛋白是否是细胞溶质的，是否可在p27 mRNA翻译增强的细胞中接触到p27 mRNA。我们和其他人之前已经表明，与异步群体或S期细胞相比，生长停滞细胞中p27的合成速率增加(1,23,35). 使用MDA468细胞，我们观察到洛伐他汀诱导的G1细胞和S期细胞的减少，与p27的积累相关（图。A和B）。这种增加可能是由于蛋白质水解受到抑制(49)和增加翻译(23). 为了关注翻译控制机制，我们首先检查了UTR依赖性报告者荧光素酶的表达。洛伐他汀以依赖富铀元素的方式增强5′UTR的表达，表明该元素是生长抑制细胞中表达所必需的（图。C） ●●●●。
洛伐他汀治疗导致p27的积累和hnRNP C1/C2的迁移发生变化。（A） 流式细胞术。如文中所述，用洛伐他汀、羟基脲或诺卡唑处理MDA468细胞，并通过碘化丙啶染色和流式细胞术测定细胞周期位置(57). 在每个DNA直方图下面，我们标记了G1和G2峰值分别为1C和2C。每种处理方法都在DNA含量剖面的左侧显示。（B） 洛伐他汀治疗诱导p27蛋白的积累。在用洛伐他汀（+LOV）或溶剂对照物（−LOV）处理MDA468细胞后，制备蛋白质提取物，并通过SDS-PAGE将越来越多的蛋白质提取物溶解并转移到聚偏氟乙烯中，用增强化学发光的免疫印迹作为检测试剂测定p27的量。装载的提取物量显示在每个泳道上方（单位为微克）。（C） 洛伐他汀治疗以富铀元素依赖的方式增加含有p27 mRNA 5′和3′UTR的模板的翻译。在MDA468细胞与10μg荧光素酶报告基因构建体（两侧有指示的UTR和5μg CMV-β-半乳糖苷酶）共转染24小时后，将细胞暴露于30μM洛伐他汀或溶剂载体（分别为+LOV和−LOV）中，并在48小时后测量活性，如图图例所示。C.为了说明洛伐他汀对一般细胞代谢的任何影响，所有数据均归一化为仅包含载体UTR的结构体的表达。（D） 在洛伐他汀处理的细胞的胞浆中可以检测到p40/41结合活性。从A组中的处理细胞和对照细胞制备细胞溶胶提取物，在与均匀标记的5′UTR转录物发生结合反应后，通过UV交联检测相关蛋白，如图图例所示。C.（E）洛伐他汀处理细胞中的p40/41结合蛋白是hnRNP C1/C2。在将结合反应放大五倍后，在交联和RNA消化后，按照图的图例进行免疫沉淀。B、 使用针对C1/C2（4F4）或TrpE的单克隆抗体，如上每条车道所示。沉淀物和上清液中的产物通过SDS-PAGE溶解，p40/41在免疫沉淀物中富集，在上清中适当减少。其迁移显示在放射自显影的右侧。沉淀产生的颗粒和上清液（SN）显示在每条车道的上方。
洛伐他汀治疗不会影响mRNA的稳态水平（数据未显示）。在洛伐他汀处理细胞的提取物中，p40/41的快速迁移形式可以与5′UTR交联（图。D） ●●●●。我们能够用hnRNP C1/C2特异性抗体免疫沉淀这个复合物（图。E） ，表明这种移动性转移是由于hnRNP C1/C2的修改引起的。我们怀疑，诺卡唑和洛伐他汀处理的细胞中hnRNP C1/C2流动性的差异可能是由于磷酸化(47). 在较长时间的暴露中，也检测到HuR（数据未显示）。
讨论
自1996年末和1997年初三个独立团体首次对p27进行描述以来，人们对p27的翻译调控几乎没有关注。这令人惊讶，因为这种调控模式与p27在生长停滞中的作用最为吻合。在洛伐他汀处理的细胞中(23)，汇流抑制BALB/c 3T3细胞(1)和TPA处理的HL-60细胞(35)p27的积累归因于合成速率的变化，而不是降解速率的变化。从PDGF诱导BALB/c 3T3细胞重新进入细胞周期的研究来看，当细胞获得进入细胞周期能力时，翻译受到抑制，但当细胞进入S期时，p27的进一步减少是由于蛋白质水解。这与HL-60细胞的发现一致：与G中多聚体相关的p27 mRNA数量增加0与G相比的单元格1细胞。在G组中，p27蛋白水解率相同0和G1但随着细胞进入S期而增加。
从这项工作中可以得出三个主要结论：首先，位于p27 mRNA 5′UTR的富铀元素对于循环和非循环细胞的高效翻译都是必要的。其次，该元素以细胞周期阶段特异性的方式与HuR和hnRNP C1/C2相互作用。第三，在5′UTR上诱导修饰的hnRNP C1/C2复合物与诱导p27翻译相关。
p27的5′UTR中的富铀元素为HuR提供了一个高亲和力的结合位点(K（K）d日，～10纳米；数据未显示）。这是首次报道哺乳动物ELAV蛋白与mRNA的5′UTR结合；然而，在低等后生动物中也观察到了类似的相互作用。在黑腹果蝇，性致死(sxl公司)是ELAV家族的另一成员，与雄性特异性致死的5′UTR结合(msl2级)雌性苍蝇的转录本(4). 在这个系统中，sxl公司消极调节翻译msl2级成绩单(4,19). 在哺乳动物细胞中，HuR通过3′UTR AU-rich序列参与调节mRNA稳定性(46). Antic及其同事还表明，Hel-N1是神经元特异性ELAV家族成员，可能通过3′UTR结合位点调节神经丝M mRNA的翻译(2). 这些数据共同表明，细胞质HuR可能调节特定mRNA的翻译。调节HuR表达并将其与p27表达关联的尝试尚未成功。然而，我们从未能够完全消除细胞中HuR的表达（未发表的数据）。这表明HuR可能不是复合物的限制成分。一个有吸引力的可能性是，HuR结合可能促进UTR结构的改变，从而允许其他蛋白质的招募。
我们还鉴定了hnRNP C1/C2为p27 5′UTR结合蛋白。这些蛋白质是丰富的核因子，被认为与信使核糖核酸加工有关(21). C蛋白也参与了C的翻译调控-姐妹信使核糖核酸，它包含一个在分化细胞中诱导的内部核糖体进入位点(54). 因此，这些蛋白质可能具有信号依赖性细胞质作用，调节特定mRNA的翻译。我们检测G中的C蛋白结合活性2/M-阻滞细胞和诱导p27翻译的细胞中这种活性的修饰形式。这些因素与5′UTR的结合依赖于富铀元素，在结合和翻译之间提供了强有力的联系。然而，在我们开发出一种不依赖于兔网织红细胞裂解物的无细胞细胞周期相特异性翻译提取物之前，我们无法直接检测hnRNP C1/C2或HuR在p27 mRNA翻译中的作用。
此外，值得注意的是，我们观察到的与5′UTR交联的蛋白质可能只是更大RNP复合体中蛋白质的一个子集，其中大多数甚至可能不会以允许放射性标记转移的方式接触RNA。在细胞周期中，这些结合活性变成细胞质的确切阶段尚不清楚。我们可以在异步细胞提取物和G提取物中检测到这些活性2/通过离心淘析分离的M细胞（数据未显示）。然而，与诺卡唑处理的细胞相比，这些提取物中5′UTR结合活性的大小降低。这表明可能存在一个非常特定的时间窗口，在该窗口中可能发生这些交互作用。我们认为这些5′UTR结合活性可能持续存在，可能是由于G2/M至早期G1这将是p27 mRNA接受诱导其翻译的信号的理想时间框架。
最后，除了铁蛋白mRNA(52)关于UTR结合蛋白如何影响诱导翻译的信息很少。对p27 mRNA的进一步研究将为该实验系统提供一个对照。相反，人们对基本翻译机制中涉及的蛋白质以及这些蛋白质如何相互作用来调节翻译有着广泛的了解。我们以前的工作和本文的结果确定了p27翻译中细胞周期调节的变化，将涉及此的序列映射到5′UTR，并开始鉴定与这些序列相互作用的一些蛋白质。这将为开发合适的体外系统奠定基础，该系统将允许对诱导翻译和这些蛋白质在该过程中的作用进行进一步的机械分析，重要的是，作为细胞周期状态的功能。
