内皮素介导整合素α5、EGFR和CD4多泛素化货物模型对溶酶体降解的有效分选
（A） Endofin-和HD-PTP-depleted HeLa细胞中总受体水平的整合素α5（左面板）和EGFR（右面板）环己酰亚胺追踪（10μg/mL CHX）。细胞需要血清（2 h），用CHX预处理（1 h），然后用纤维连接蛋白（10μg/mL FN，37°C）或EGF（50 ng/mL，37°C）激活受体。整合素α5被追踪0、3和6小时，而EGFR在CHX存在下追踪0、2和4小时。对照细胞也用Bafilomycin A1（200 nM Baf+CHX，1 h）预处理，以抑制溶酶体酸化，从而抑制溶酶体降解（6 h FN+Baf或4 h EGF+Baf）。对细胞提取物进行蛋白质印迹，以通过使用ImageJ软件的密度计分析来测量降解动力学。整合素α5和EGFR水平归一化为eEF2。
（B） 用细胞表面ELISA（cs-ELISA）测定HeLa细胞中整合素α5（左侧）和EGFR（右侧）质膜（PM）的稳定性。血清饥饿后，受体被纤连蛋白（10μg/mL FN，4小时，37°C）或EGF（50 ng/mL，20分钟，37°C）激活。α5β1整合素阻断抗体（10μg/mL）和吉非替尼（2μM）作为阴性对照，阻断Endofin-depleted细胞的受体内化。对于每个细胞系，整合素α5和EGFR的水平绘制为细胞表面与未刺激细胞相比剩余的百分比。
（C） 在缺乏血清的HeLa细胞上进行cs-ELISA，以量化稳定状态下整合素α5（左侧面板）和EGFR（右侧面板）PM受体密度。将内皮素和HD-PTP-depleted细胞与对照NT细胞进行比较。
（D） （上面板）受体转运期间囊泡pH值变化的示意图（EE：早期内体，RE：再循环内体，LE：晚期内体，Lys：溶酶体）。（下图）血清饥饿的HeLa细胞中EGFR和整合素α5内吞动力学的FRIA分析。用FRIA测定内皮素、HD-PTP-和Hrs-depleted HeLa细胞与NT细胞中FITC-标记的EGFR-或整合素α5的内吞小泡的平均pH值。血清饥饿后，用EGF（50 ng/mL，30或60 min，37°C）或FN（10μg/mL，4 h，37°C）刺激细胞。
（E） 用CD4Tl（溶酶体降解受体分选阴性对照）或CD4Tl-泛素嵌合体（CD4T1-Ub，作为多泛素化货物的模型）瞬时转染内皮素和HD-PTP-depleted 293T细胞。用CHX（100μg/mL）预处理血清饥饿的293T细胞，以追踪CD4Tl和CD4Tl-Ub的总蛋白水平2 h。用ImageJ软件对细胞提取物进行蛋白质印迹（CD4抗体），以通过密度分析测量降解动力学。CD4Tl和CD4Tl-Ub水平归一化为eEF2。
（F和G）（F）在15、30、60和120分钟追踪（37°C）后，通过FRIA测定Endofin-depleted HeLa细胞与NT细胞中含有CD4Tl-Ub-和（G）CD4TCC-UbAllRΔG的内吞小泡的平均小泡pH值。CD4TCC-UbAllRΔG是四聚体单-泛素化货物的模型。数据为n≥3个独立实验的平均值±SEM。未配对学生t检验：*p<0.05，*p<0.01，***p<0.001。
