CTCF与CtIP合作推动双链断裂的同源重组修复

质粒构建和转染

分别使用pEGFP-N1（Addgene#6085-1）和pcDNA3-HA通过经典PCR方法构建了GFP-和HA标记的CTCF和MRE11全长和截短突变体。用于克隆的引物的寡核苷酸序列如所示补充表S1CTCF和MRE11结构的所有连接区以及CTCF片段的编码序列均通过DNA测序进行了验证。使用pSUPER.retro.puro，一种H1启动子驱动的RNA干扰逆转录病毒载体（Oligoengine，西雅图，华盛顿州）生成了靶向CTCF、MRE11和CtIP的双标记短发夹RNA（shRNAs）。shRNAs的序列如所示补充表S2使用效应基因转染试剂（Qiagen，Carlsbad，CA）在哺乳动物细胞中进行转染。

抗体

CTCF抗体取自Abcam（ab128873，1:2000稀释液用于免疫印迹（IB），1:2000用于免疫荧光（IF）；ab70303，每个染色质免疫沉淀（ChIP）样品2μg）、细胞信号技术（#2899S，免疫沉淀（IP）1:1000）和Millipore（07-729，每个ChIP样品2μg.）。用于IB、IF、IP和ChIP分析的其他抗体如下：HA（Abcam的ab9110，IB、ChIP和IP的1:2000）、GFP（Abcam的ab290，IB的1:2000，IP的1:1000）、γH2AX（Millipore的05-636，IF和IB的1:1000；Abcam中的ab2893，每个ChIP样品的2μg）、CtIP（Active Motif的61141，IF、IB、IP、ChIP的1:100）、，RPA（ab2175来自Abcam，1:1000用于IF，2μg用于ChIP），phospho-RPA（S4/S8）（A300-245A来自Bethyl，1:2000用于IB和IF），MRE11（Abcam的ab214，IF、ChIP、IP和IB的1:2000，ChIP的2μg；#4895S来自Cell Signaling Technology for IP），NBS1（ab32074来自Abcam.，1:200用于IB），RAD50（Abcam-ab89，IB和IP的1:2000），Tubulin（来自Millipore的05-829，IB的1:3000）、RAD51（来自Abcam的ab176458，每个ChIP样品2μg）、p53（来自Santa Cruz的sc-126，IB为1:2000）、p21（来自Milliepore的05-345，IB是1:2000），磷酸-（丝氨酸/苏氨酸）ATM/ATR底物多单克隆抗体（来自Cell Signaling Technology的#6966S，IB），BRCA1（圣克鲁斯sc-642，IB 1:1000）、53BP1（诺夫斯NB100-305，IB 1:2000）和β-actin（圣克鲁兹sc-47778，IB 1:3000）。

串联亲和纯化（TAP）和质谱

对瞬时表达S蛋白Flag-Streptavidin结合肽（SFB）标记CTCF（SFB-CTCF）的293T细胞进行γ射线照射或不照射。用TAP-NETN缓冲液（20 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，1 mM EDTA，0.5%Nonide P-40，pH 8.0）对细胞进行裂解。通过离心去除细胞碎片后，用链霉亲和素-琼脂糖珠（GE Healthcare，芝加哥，伊利诺伊州，美国）培养粗裂解物。在TAP-NETN缓冲液中用生物素（Sigma-Aldrich）洗涤和洗脱珠结合蛋白。然后用S蛋白琼脂糖珠培养洗脱液（Millipore，Burlington，MA，USA）。洗涤S-蛋白珠结合蛋白，用SDS-PAGE分离，然后用速溶蓝染色进行可视化（德国海德堡Expedion）。对于LC-MS/MS分析，凝胶层被切成不同的条带，并按以下方式处理。简单地说，乙酰化蛋白带被分成10毫米的切片，并用胰蛋白酶在凝胶中消化。胰蛋白酶消化物通过在线反相色谱法分离，使用Thermo Scientific EASY-nLC 1200 UHPLC，该UHPLC配有自动取样器，使用反相肽捕捉器Acclaim PepMap™100（内径75-μm，长度2cm）和反相分析柱PepMap™RSLC C18（内径75μm，长度15 cm，粒径3μm），均来自Thermo Scientific。然后以300 nl·min的流速进行电喷雾电离⁻¹色谱系统与Orbitrap Fusion Lumos质谱仪耦合。使用Proteome Discoverer Sorcerer 2.1软件和基于SEQUEST的搜索算法，根据UniProt人类数据库对获得的光谱进行筛选。使用Scaffold 4 Q+S对本研究中确定的蛋白质进行比较分析。本研究中获得的所有原始质谱蛋白质组学数据均已通过数据集标识符为PXD014441的PRIDE合作伙伴存储库存放到ProteomeXchange Consortium。

激光微辐照

将U2OS细胞接种到玻璃底培养皿（SPL Life Science，Korea）上，并用指定的质粒和siRNA转染。用10μM 5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU，Sigma）预定位细胞24–30小时，然后使用Eclipse T1和A1共焦系统（美国纽约州梅尔维尔市尼康仪器公司）在含有5%CO的37°C室中以405 nm的波长进行激光微辐照，持续3 s（32线/s）₂激光处理后，对细胞进行活细胞成像或进行IF处理。

免疫荧光

在指示的处理（微辐射、足叶乙甙、4′-羟基三苯氧胺[4-OHT]或γ辐射）后，用3.7%甲醛固定细胞，并用0.5%Triton X-100渗透。用1%牛血清白蛋白阻断后，用所示的一级和二级抗体孵育细胞。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma）染色。使用Vectashield安装介质（Vector Labs）安装盖玻片，并使用共焦显微镜（LSM 710，Carl Zeiss，Oberkochen，Germany）或荧光显微镜（Eclipse Ti-S，Nikon Instruments Inc.）获取图像。

免疫沉淀

用含有蛋白酶抑制剂的NETN缓冲液（0.1 mM二硫苏糖醇（DTT）、1%NP-40、150 mM NaCl、40 mM Tris-HCl、pH 8.0）在冰上溶解293T细胞，这些细胞先用或不用10或20μM ATM抑制剂（来自Santa Cruz的KU55933）预处理1 h，然后用50μM依托泊甙或载体（二甲基亚砜（DMSO）处理10 min。通过离心澄清细胞裂解物，并用核酸酶消化缓冲液（0.25 M蔗糖、1.5 mM Tris-HCl[pH7.4]、80 mM NaCl、3 mM KCl、7.5 mM NaCl、1 mM CaCl）培养₂，0.1 mM DTT，20 U/ml微球菌核酸酶），含蛋白酶抑制剂，含或不含150 U/ml苯甲酸酶®（Sigma）或0.1μg/μl溴化乙锭（Qbiogene），在37°C下保持15分钟。离心后，收集染色质结合蛋白，并在4°C下与针对指示蛋白的抗体孵育12小时，然后在4℃下与蛋白A珠孵育1小时。然后用NETN缓冲液清洗珠子三次，并用IB进行分析。对于标记蛋白IP，用足叶乙甙或载体处理的293T细胞在IP缓冲液（40 mM Tris-HCl[pH7.4]，150 mM NaCl，2 mM MgCl）中溶解₂含蛋白酶抑制剂的0.2%Nonide P-40，0.4%Triton X-100）在冰上放置30分钟。通过离心澄清细胞裂解物，并在4°C下与所示抗体孵育12小时，然后在4°C下与蛋白A珠孵育1小时。用洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl[pH7.4]，150 mM NaCl，0.2%Triton X-100）冲洗沉淀三次，用SDS-PAGE溶解结合蛋白并用所示抗体进行免疫印迹。

ChIP测定

AsiSI-ER-U2OS细胞(12)用300 nM 4-OHT（Sigma）处理4 h，诱导AsiSI-ER核定位和AsiSI核酸酶产生DSB。FokI-U2OS报告细胞(13)表达可诱导的ER-mCherry-LacI-FokI-DD用300 nM 4-OHT加1μM Shield-I（Clontech）处理4 h，以通过FokI核酸酶在转基因Lac算子序列中诱导ER-mCherly-LacI-FokI-DD和DSB的核表达和稳定。随后，根据制造商的协议（Millipore），使用EZ-ChIP试剂盒执行ChIP。使用Rotor-Gene SYBR通过定量PCR（qPCR）分析免疫沉淀和输入DNA^®Rotor-Gene Q系统（Qiagen）上的绿色PCR试剂盒（Qiangen）。PCR条件为初始预培养步骤，在95°C下培养5分钟，然后在45个95°C循环中培养5秒，在60°C培养30秒。最后一个扩增循环后进行熔融曲线分析，以确认PCR扩增的特异性。根据阈值周期计算相对IP值(C类_t吨)值使用2^{−ΔΔC类t吨}方法(16). 用于qPCR的引物序列如所述补充表S3.

HR、标准和替代NHEJ以及单链退火（SSA）DNA修复分析

使用基于H1299（人类非小细胞肺癌细胞系）的修复报告细胞系（H1299.GC用于HR，H1299.EJ用于标准NHEJ）测量HR和NHEJ效率(15)和基于U2OS的修复报告细胞系（HR用DR-GFP，规范NHEJ用EJ5-GFP，替代NHEJ的EJ2-GFP，单链退火用SA-GFP）(14)分别是。用CTCF靶向shRNAs转染H1299.GC和H1299.EJ细胞。用靶向CTCF 3′-UTR的siRNA转染U2OS DR-GFP、EJ2-GFP、EJ5-GFP和SA-GFP细胞。第二天，将I-SceI和HA-CTCF构建物转染到每个报告细胞系中，并在48小时后使用FACSAria III（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）评估GFP阳性细胞。

DNA末端切除的测量

使用gDNA提取试剂盒协议（Dneasy blood&Tissue kit，Qiagen）从转染有指定siRNAs和HA-taged CTCF构建物的AsiSI-ER-U2OS细胞中提取基因组DNA。然后用限制性内切酶消化DNA（阴性对照用HindIII，切除用BamHI（染色体1:89458296；CCBL2基因）或BsgI（染色体1:110319090））。使用如所示的引物集，通过qPCR评估特定AsiSI位点（DSB）DNA末端切除产生的ssDNA水平补充表S4如前所述，确定了DSB切除产生的ssDNA百分比（ssDNA%）(17,18). 简单地说，对于每个样品，a△C类_t吨通过减去C类_t吨来自C类_t吨消化样品的值。ssDNA%的计算公式如下：ssDNA%=1/（2^{(△C类t−1）}+ 0.5) × 100 (19).

siRNA

Genolution，Inc.（韩国首尔）合成了具有以下序列的siRNA双链体：CTCF，5′-GUAGAAGCAAAAUAUU-3′；CTCF的3′-UTR，5′-GCUCUGAUGUUAGCAAAUU-3′；CtIP，5′-GAAGGAUGAGGAGUAGUUU-3′。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将20 nM siRNA转染细胞。

免疫印迹法

如前所述进行免疫印迹实验(20). 图中显示了至少三个独立实验的代表性结果。

细胞分馏

如前所述进行细胞分馏，但有轻微修改(21). 简单地说，细胞用冰镇PBS清洗两次，然后收获。将细胞颗粒在含0.1%Triton X-100的200μl提取缓冲液[50 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM EDTA]中的冰上再悬浮15分钟，并添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒和磷酸酶抑制剂。以13000 rpm（16000 rpm）离心后克)持续5分钟，收集上清液（S1部分）。使用相同的缓冲液在冰上进一步提取颗粒15分钟，然后收集。在25°C下，在200μl补充有200μg/ml RNase A但没有Triton X-100的提取缓冲液中进一步培养微丸30分钟。以13000 rpm（16000 rpm）离心后克)5min后，从颗粒中分离上清液。将颗粒重新悬浮在含有1%SDS的PBS中，煮沸10分钟并超声处理10秒（加拿大科尔帕默超声波处理器）（P2组分）。将细胞组分与抗CTCF（1:5000）、CtIP（1:1000）、磷酸化-RPA（S4/S8）（1:1000。

克隆形成细胞存活试验

HeLa细胞接种到6孔板（2×10⁴细胞/孔），并允许在治疗前粘附24小时。用2 mM胸腺嘧啶核苷处理细胞16 h，然后在新鲜培养基中培养6 h，然后用0、2或5μM足叶乙甙处理1 h。培养24 h后，将细胞接种到60 mM板中。培养10–14天后，用冰镇甲醇固定菌落，并用20%乙醇中的0.4%结晶紫染色。CTCF沉默或过度表达介导的电镀效率归一化后绘制存活曲线。克隆存活曲线由至少三个独立实验构建而成。

RNA分离和定量逆转录PCR（qRT-PCR）

使用Hybrid-R Total RNA纯化试剂盒（GeneAll，韩国首尔）分离总RNA。用PrimeScript RT Master Mix（日本志贺县Takara Bio）逆转录1微克总RNA。在1:10稀释后，将2μl cDNA用作20μl PCR混合物中的模板。采用以下引物进行qPCR：CCBL2（5′-GCCAACACCACAGCTCCT-3′和5′-CCTGGGCATCCTTGAGTTCC-3′）；GAPDH（5′-AGCCACATCGCTCAGACC-3′和5′-GCCAATACACAACGACCAATC-3′）。使用ΔΔ进行基因表达的相对定量C类_t吨方法以GAPDH为参考基因。PCR程序如下：在95°C下初始变性2分钟，然后在95°C下45个循环5秒和60°C下30秒。最后的扩增循环后进行熔融曲线分析，以确认PCR扩增的特异性。

DNA损伤部位的CTCF富集取决于MRE11

大多数参与DNA损伤反应的蛋白质，包括MRE11，定位于DNA损伤并形成修复病灶。然而，DNA损伤后，我们没有通过免疫荧光染色观察到CTCF病灶。使用实时激光微辐射系统，我们观察到，与MRE11类似，CTCF被快速招募到激光条中（图​（图2A）。2安培). 此外，我们使用前面描述的FokI–U2OS报告系统（一个U2OS克隆，在基因组的一个位点携带Lac算子的重复序列）测试了CTCF招募及其与MRE11在DNA DSB的共定位，其中mCherry-LacI-FokI内切酶融合蛋白在基因组中引入了一个DSB(13). 与CTCF在激光条上的招募和MRE11-共定位一致，CTCF被招募并与MRE11在FokI-induced DSB站点共同定位（图​（图2B）。2B型). 如图所示​图2C，2厘米，CTCF-ChIP分析显示，CTCF被招募到FokI诱导的DNA损伤位点，类似于γH2AX的招募。在FokI–U2OS报告系统中，mCherry-LacI-FokI核酸酶在细胞中产生单个DSB。因此，CTCF可能在单个或几个本地DSB而不是多个DSB站点累积。为了排除这种可能性，我们使用了额外的AsiSI-ER-U2OS报告系统(12)其中AsiSI核酸酶切割细胞基因组中的多个AsiSI位点。与FokI诱导的DSB招募CTCF一致，CTCF很容易招募到AsiSI诱导的DSBs（图​（图2D）。第2天). 总之，这些观察结果表明，CTCF在DSB聚集，并与MRE11共存。

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图2。

DNA损伤部位CTCF的MRE11依赖性招募。(A类)MRE11缺失（shMRE11）或对照（shCTL）U2OS细胞用BrdU预敏化并接受激光微辐射。细胞被固定并用指示的抗体染色；比例尺：10μm。(B类)用靶向MRE11（shMRE11）或对照shRNA（shCTL）转染FokI-U2OS报告细胞，在ER-mCherry-lacR-FokI-DD诱导双链断裂后4h进行免疫荧光；比例尺：10μm。该图表示共同定位于mCherry-FokI病灶的CTCF阳性细胞的百分比。数据是三个独立实验的平均值±SD。每个实验中计数100多个细胞； *P（P）≤ 0.05. (C类)ChIP-qPCR是在FokI-U2OS DSB报告细胞中使用γ-H2AX或CTCF抗体进行的，该报告细胞转染了指示的shRNA（shCTL作为对照或shMRE11靶向MRE11），mCherry-LacI-FokI有（+）或无（-）DSB诱导。DSB招募值与未诱导DSB的细胞招募值相关。所有qPCR反应均一式三份，SEM值由至少三个独立实验计算得出*P（P）≤ 0.05; ***P（P）≤ 0.001. (D类)用指示的shRNA转染AsiSI-ER-U2OS细胞，AsiSI诱导（+）或不诱导（−）DSBs。用抗CTCF抗体免疫沉淀CTCF和染色质。折叠富集值与未诱导DSB的细胞的折叠富集值相关。22号染色体上的引物（无DSB）用作阴性对照。数据是至少三个独立实验的平均值±SD，所有qPCR反应一式三份。(E类)mCherry-LacI-FokI在CTCF-depleted（shCTCF）或对照（shCTL）FokI-U2OS细胞中诱导双链断裂（DSB）后4h进行免疫荧光；比例尺：10μm。条形图表示在mCherry-LacI-FokI病灶共定位MRE11阳性细胞的百分比。数据是三个独立实验的平均值±SD。每个实验中统计了100多个细胞。ns，不显著。(F类)激光微辐射诱导CTCF-depleted（shCTCF）和control（shCTL）U2OS细胞中MRE11（绿色）向DSB募集；比例尺：10μm。(G公司)用FokI-U2OS细胞（左和中）和转染对照（shCTL）或CTCF shRNA（shCTCF）的AsiSI-ER-U2OS（右）中的γ-H2AX或MRE11抗体进行ChIP-qPCR，FokI（FokI-U2OS）或AsiSI（AsiSI-ER-U2OS）可（+）或不可（-）诱导DSB。折叠富集值与未诱导DSB的细胞的折叠富集值相关。数据以三个独立实验的平均值±SD表示，所有qPCR反应均一式三份**P（P）≤ 0.01; ***P（P）≤ 0.001.

假设CTCF在DNA损伤时与DNA损伤传感器MRN复合体的MRE11相互作用（图​（图1），1)CTCF和MRE11都被迅速招募到受损DNA的位点（图​（图2），2)，我们研究了CTCF和MRE11是否会相互影响DNA损伤位点的补充。与对照细胞相比，MRE11的耗竭消除了激光诱导DNA损伤位点的CTCF募集（图​（图2A）。2安培). 与激光条中的CTCF招募一致，在携带mCherry-LacI-FokI报告者（FokI-U2OS）的蜂窝系统中，MRE11击倒后，DSB中的CTCFR定位显著降低（图​（图2B）。2B型). 以类似的方式，使用FokI-U2OS的CTCF ChIP结果（图​（图2C）2厘米)和AsiSI-ER-U2OS（图​（图2D）第2天)报告系统显示，与对照细胞相比，在MRE11敲除细胞中，CTCF被招募到FokI或AsiSI诱导的DSB中的数量显著减少。然而，CTCF的耗竭对MRE11向FokI诱导的DSB的补充几乎没有影响（图​（图2E）第二版)以及激光条（图​（图2F）。2楼). 同时，通过MRE11 ChIP分析，我们发现CTCF耗竭并没有改变mCherry-LacI-FokI和AsiSI诱导的DSB中MRE11的积累（图​（图2G）。2G（2G）). 总之，这些结果表明，CTCF向受损DNA位点的积累需要MRE11，但反之则不需要。

因为CTCF在DNA损伤位点的招募依赖于MRE11（图​（图2），2)，我们研究了MRE11–CTCF相互作用是否确实与MRE11介导的CTCF募集有关。因此，我们评估了外源性过表达GFP标记的全长或截短CTCF在DNA损伤部位的补充。正如预期的那样，我们观察到GFP标记的全长CTCF在激光微照射的几秒钟内被募集到激光条上（图​（图3A）。3A级). GFP标记的CTCF片段含有N末端或ZF结构域，能够与不同强度的MRE11相互作用（图​（图1D），1天)，在激光条中招募（图​（图3A）。3A级). CTCF片段募集到激光条上的效率是可变的（图​（图3A）3A级)并且似乎与MRE11的相互作用强度相关（图​（图1D）。1天). 例如，N-ZF和ZF片段表现出快速和强烈的募集，而N末端和ZF-C片段表现出微弱但可检测到的募集。相反，CTCF的C端片段没有与MRE11相互作用，未能积聚到激光条上（图​（图3A）。3A级). 该微辐射结果表明，CTCF–MRE11相互作用是CTCF募集到DNA损伤位点所必需的。为了证实这一结果，我们通过荧光显微镜监测FokI-U2OS报告系统中MRE11相互作用和非相互作用CTCF片段的招募。与微辐射结果一致，MRE11相互作用的CTCF片段（即N末端、ZF、N-ZF和ZF-C）可以在DSB以不同的效率被招募，而C末端片段没有招募（图​（图3B）。3B公司). 上述结果表明，CTCF以MRE11相互作用依赖的方式被招募到DNA损伤位点。

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图3。

DNA损伤的CTCF招募需要其N末端或锌指结构域。(A类)用GFP标记的全长CTCF及其截短结构转染U2OS细胞（见图​图1D，1天，顶部），并受到高达180秒的激光微辐照(B类)所示GFP标记的CTCF蛋白的招募（绿色；见图​图1D1天由mCherry-LacI-FokI（红色）在内源性CTCF-depleted（siCTCF）或对照（siCTL）FokI-U2OS细胞中诱导的双链断裂。CTCF击倒细胞（siCTCF细胞中GFP标记的C和ZF-C，右）中CTCF的外补体C末端结构域也被内源性CTCF抗体识别（蓝色）；比例尺：10μm。

CtIP定位到DNA损伤部位需要CTCF

由于CTCF与MRE11相互作用（图​（图1），1)在人力资源方面与CtIP合作(29)，我们假设CTCF会促进DNA损伤处CtIP的募集。因此，我们测试了CTCF是否会影响CtIP在DNA损伤中的募集。我们使用FokI–U2OS报告系统（图​（图4A）4A级)在CTCF-depleted细胞中。我们发现，CTCF耗竭显著消除了CtIP病灶形成（图​（图4A），4A级)这表明CTCF是CtIP招募到DNA损伤部位所必需的。接下来，我们监测了CTCF击倒细胞中激光条中CtIP的招募。CTCF耗竭严重削弱了激光条中的CtIP招募（图​（图4B），4B类)，类似于MRE11缺失的CtIP募集缺陷(补充图S3A). 为了证实这一结果，我们使用ChIP测定法检查了CTCF耗竭是否影响DNA损伤位点的CtIP积累。在CTCF-depleted细胞中，FokI–U2OS和AsiSI–ER-U2OS报告细胞中FokI诱导或AsiSI诱导的DSB上的CtIP积累显著减少（图​（图4C），4摄氏度)支持DNA损伤处CtIP募集依赖于CTCF的假设。相反，CtIP的缺失对CTCF或MRE11向DNA损伤位点的募集几乎没有影响(补充图S3B). 这些观察结果表明，CtIP招募到DNA损伤位点需要CTCF，但CtIP不影响这些位点的CTCF定位。

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图4。

DNA损伤处的CtIP招募需要CTCF。(A类)mCherry-LacI-FokI诱导CTCF-depleted（shCTCF）或对照（shCTL）FokI-U2OS细胞双链断裂（DSB）后4h进行免疫荧光检测；比例尺：10μm。条形图表示共同定位于mCherry-FokI（红色）焦点的CtIP（绿色）细胞的百分比。数据是至少三个独立实验的平均值±SD。每个实验中计数100多个细胞； *P（P）≤ 0.05. (B类)对CTCF缺失（shCTCF）或对照（shCTL）U2OS细胞进行激光微照射。细胞被固定并用指示的抗体染色。比例尺代表10μm。(C类)用CTCF-depleted（shCTCF）或对照（shCTL）FokI-U2OS细胞（左）和AsiSI-ER-U2OS（右）中的CtIP和γ-H2AX抗体进行ChIP-qPCR，同时（+）或（-）诱导DSB。折叠富集值与未诱导DSB的细胞的折叠富集值相关。数据为至少三个独立实验的平均值±SD，所有qPCR反应均一式三份； *P（P）≤ 0.05; ***P（P）≤ 0.001. (D类)CTCF与CtIP互动。使用对照IgG和抗CTCF，在（+）或（-）依托泊甙（Eto）处理下进行共免疫沉淀分析，并通过免疫印迹（IB）检测指示蛋白。(E类)CTCF通过其锌指结构域与CtIP相互作用。HA-标记全长CTCF及其截断片段（见图​图1D，1天，top）在293T细胞中表达。用SDS-PAGE解析HA-免疫沉淀物，并用印迹法检测HA（底部）和CtIP（顶部）。

因为DNA损伤处的CtIP招募需要CTCF（图​（图4A4A级–C类)，我们研究了CTCF是否能与CtIP相互作用。在存在或不存在DNA损伤的情况下，CTCF能够与CtIP结合，并且在存在DNA损伤时，CTCF-CtIP相互作用增强（图​（图4D）。4D（四维）). 然后，我们绘制了负责与CtIP交互的CTCF区域。HA-标记的全长CTCF及其包含ZF域的片段（即ZF、N-ZF和ZF-C）拉下了内源性CtIP（图​（图4E）。第四版). 相反，在N-末端和C-末端免疫沉淀物中几乎没有检测到CtIP（图​（图4E）。第四版). 因此，我们发现CTCF的ZF结构域对于CTCF–CtIP相互作用是必要的。

到目前为止，我们的结果已经证实，CTCF通过其ZF结构域与CtIP相互作用，并且CTCF的缺失会消除受损DNA位点的CtIP招募。接下来，我们测试了CTCF介导的CtIP招募DSB是否需要CTCF–CtIP交互。我们用靶向内源性CTCF 3′-UTR的siRNA和全长CTCF或其截短突变体共同转染细胞。使用荧光显微镜的FokI-U2OS DSB报告系统(补充图S4A)和ChIP分析（图​（图5A），5A级)在表达外源性全长CTCF或其含有ZF区域的片段的内源性CTCF-depleted细胞中，发现CtIP被招募到FokI诱导的DSB中(补充图S4A). 我们发现，能够与CtIP关联的ZF、N-ZF和ZF-C域将受损的CtIP招募恢复到DSB，这表明CTCF的ZF域足以向DSB招募CtIP。相比之下，N端和C端片段并没有将CTCF缺失的细胞从受损的CtIP募集挽救到FokI诱导的DSB。一致地，ChIP分析表明，携带ZF结构域的CTCF片段恢复了CTCF缺失细胞中DSB的CtIP招募，与全长CTCF相似（图​（图5A）。5A级). 相反，N端和C端片段并没有将CTCF缺失的细胞从受损的CtIP募集到DSB。这些结果表明，CTCF–CtIP互动对于CtIP招募到DSB是必要的。

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图5。

CtIP招募DNA损伤需要与CTCF的锌指结构域相互作用。(A类)通过ChIP–qPCR在CTCF缺失的FokI–U2OS细胞中评估CtIP对mCherry-LacI-FokI诱导的DSB的招募，并辅以所示HA融合CTCF蛋白（见图​图1D，1天，顶部）。用抗CtIP抗体免疫沉淀CtIP和染色质。对ChIP样品进行qPCR定量分析。折叠招募值与未诱导DSB的细胞的折叠招募值相关。数据为至少三个独立实验的平均值±SD，所有qPCR反应均一式三份； *P（P）≤ 0.05. (B类)GFP–CtIP在CTCF缺失的U2OS细胞中γH2AX病灶（红色）处的共同定位（绿色），辅以所示HA融合CTCF蛋白（见图​图1D，1天，顶部）。对CTCF缺失（siCTCF）和对照（siCTL）U2OS细胞进行激光微照射。细胞被固定，并用左边显示的抗体染色。比例尺代表10μm。(C类)用抗CtIP抗体在CTCF-depleted（+）或control（−）293T细胞中共免疫沉淀内源性CtIP和MRE11。使用右侧显示的抗体进行免疫印迹（IB）分析。

为了进一步证实这一结果，我们确定CTCF的锌指结构域是否需要，是否足以在激光条中招募CtIP。尽管γ-H2AX条带的形成不受CTCF缺乏的影响（图​（图5B）。第5页). 与使用带有FokI的U2OS-DSB报告系统的结果一致（图​（图5A5A级和补充图S4A)，全长CTCF或其含有ZF结构域的片段恢复了CTCF缺失细胞中γ-H2AX条带处的CtIP定位（图​（图5B）。第5页). 相比之下，N端和C端片段并没有拯救CtIP在γ-H2AX条带上的定位（图​（图5B）。第5页). 在γ-H2AX条带全长或ZF-碎片形式存在的情况下，将CtIP加入γ-H2AX条带，验证了CTCF及其ZF的重要性（图​（图5B）。第5页). 这些结果表明，CTCF的CtIP相互作用ZF结构域对于DSB的CtIP招募是必要和充分的，这与U2OS–DSB报告结果一致。

考虑到MRN复合物与CtIP相互作用，我们质疑为什么CtIP需要CTCF才能在DNA损伤处富集，以及CTCF如何促进DSBs处的CtIP积累。为了解决这个问题，我们首先研究了CTCF是否有助于CtIP与MRN复合体的相互作用。因此，我们通过在有或没有CTCF耗竭的情况下免疫沉淀CtIP来检测CtIP蛋白与MRN的相互作用，我们发现从CTCF耗竭的细胞提取物中与CtIP共免疫沉淀的MRN较少（图​（图5C）。5摄氏度). 这一结果表明，CTCF有助于CtIP与MRN复合体的相互作用，从而导致CtIP和CTCF在DNA损伤处的招募增强。根据CTCF依赖MRE11招募DSB的调查结果（图​（图2A2安培–D类)并且需要在DNA损伤处进行CtIP富集（图​（图4A4A级–C类)通过DNA损伤促进CTCF–MRN/CTCF–CtIP相互作用（图​（图11和4D（四维）)以及CTCF辅助的CtIP–MRN交互（图​（图5C），5摄氏度)如果CTCF依赖性CtIP在DSB的富集可归因于CtIP的招募，则CtIP招募动力学必须与CTCF及其片段的动力学相关。否则，如果CTCF依赖性归因于CtIP保留，则全长CTCF及其片段必须影响DNA损伤处CtIP驻留的稳定性（例如长度或范围），而不是影响CtIP招募的时间。为了验证这一点，我们对补充或不补充全长CTCF或其片段的CTCF缺失细胞的激光条中的CtIP募集进行了延时成像分析。如图所示​图3A，3A级激光线的CTCF招募最早可在微辐照后10秒检测到。相反，与CTCF相比，激光线路的CtIP招募明显延迟了60秒。在CTCF敲除细胞中，CtIP未能转位到激光系；然而，重新引入全长CTCF将CtIP招募挽救了60秒，随着时间的推移，这一定义变得更加明确(补充图S4B). 激光轨迹上CTCF（10 s，更早）和CtIP（60 s，更晚）募集时间点之间的差异，以及CtIP耗竭对受损DNA部位CTCF积累没有明显影响的发现(补充图S3B)但相反，CTCF消耗阻碍了CtIP招募（图​（图4A4A级–C类)，提出了CTCF在DNA末端切除中作用于CtIP上游的可能性。N末端CTCF片段的互补，在10秒时弱招募（图​（图3A）3A级)无法与CtIP交互（图​（图4E），第四版)，未能招募CtIP(补充图S4B)因为N末端无法与CtIP进行交互，导致没有CtIP招募。相反，所有含有ZF（即ZF、N-ZF和ZF-C）的CTCF碎片都与MRE11和CtIP相互作用（图​（图1D1天和第四版)并在微辐射后10秒招募（图​（图3A），3A级)导致CtIP招募60秒，持续到240秒，与全长CTCF的情况类似(补充图S4B). 无法进行DSB招募和CtIP交互的C终端CTCF未能招募CtIP(补充图S4B). 激光条上CtIP招募的动力学分析(补充图S4B)显示CTCF可能以CTCF–CtIP交互依赖的方式促进CtIP招募。然而，这些动力学结果并不排除CTCF在补充到DNA损伤后立即稳定CtIP保留的可能性，除了依赖于CTCF的CtIP补充外，还导致延长和/或强化保留。这可能是由于CTCF加强了CtIP与MRN的相互作用（图​（图5C）5摄氏度)并且在对DNA损伤的反应中与MRN和CtIP的相互作用更强（图​（图11和4D（四维）).

CTCF增强CtIP介导的DNA末端切除

MRE11与CtIP合作进行5′-3′DSB切除，这是控制HR启动的DNA修复的早期步骤(29). 如我们的结果所示，CTCF与MRE11相互作用（图​（图1）1)和CtIP（图​（图4D4D（四维）和E类)以及CTCF招聘需要MRE11（图​（图2）2)然后需要CTCF将CtIP招募到受损DNA位点（图​（图5），5)，我们假设CTCF将通过CtIP招募到DSB来增强MRE11–CtIP介导的DNA末端切除。为了验证这一假设，我们首先使用AsiSI–ER–U2OS报告系统在没有CTCF的情况下进行了DNA末端切除试验。我们发现，与表达对照siRNA的细胞相比，CTCF敲除显著降低了AsiSI诱导的第1染色体上DSB（89458296位）的DNA末端切除，达到了与耗尽关键催化酶MRE11的关键HR辅因子CtIP类似的水平（图​（图6A）。6A级). DSB处DNA末端切除的效率在CtIP和CTCF-depleted细胞中相似，证实了CTCF对DNA末端切除术的要求。这种DNA末端切除的减少是通过重新引入siRNA抗性的全长CTCF或其含有ZF结构域的片段来恢复的（图​（图6A），6A级)，表示除非不存在含有ZF的片段，否则切除不会受到影响。与N-ZF提供的稳健切除相比，ZF片段本身显示出适度的切除恢复，但ZF片段的表达水平显著低于N-ZF和ZF-C，这可能解释了分离片段的DNA切除恢复较低。然而，N-ZF和ZF-C的表达水平与它们的切除恢复效率不成比例。这表明N末端能够与MRE11相互作用（图​（图1D）1天)但不是CtIP（图​（图4E）第四版)并在与ZF域协调MRE11和CtIP方面发挥结构作用，ZF域能够与MRE11与CtIP同时交互。然而，C终端无法与MRE11和CtIP交互（图​（图1D1天和第四版)对于DNA末端切除来说似乎是可有可无的。相反，不含ZF结构域的CTCF N端和C端片段未能逆转CTCF敲除细胞中的DNA末端切除缺陷。CTCF片段的DNA末端切除效率与每个片段向DSB招募CtIP的能力相关，表明CTCF促进DNA损伤处的CtIP招募，并调节由此产生的DNA末端切割。接下来，为了检查CTCF在DSB修复期间的DNA末端切除中是否与CtIP合作，在CtIP和CTCF双敲除细胞中评估了切除效率。CTCF和CtIP的联合耗竭使AsiSI诱导的DSB的末端切除率降低到与单次耗竭观察到的相似水平(补充图S5A)提示DSB末端切除中CTCF和CtIP之间存在上位关系。因此，这些结果表明CTCF通过在DSB中招募CtIP在调节DNA末端切除中发挥重要作用。

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图6。

CTCF缺失损害DNA末端切除。(A类)在AsiSI-induced DSB（红色）周围的三个位点（左侧、2-1、2-2和2-3分别为364、1754和3564 bp，BamH1限制位点的配对引物显示为黑色箭头对）对5′末端切除产生的ssDNA进行定量在用所示shRNA和HA标记的CTCF构建体转染的AsiSI–ER–U2OS细胞中染色体1:89458296位置（右图）。穿过Hind III限制位点的22号染色体（无DSB）上的引物（黑色箭头对）用于阴性对照（左）。数据为至少三个独立实验的平均值±标准差，所有qPCR反应一式三份*P（P）≤ 0.05, **P（P）≤0.01（参见补充图S13A显示耗尽的CTCF或CtIP和补充的HA标记的CTCF-蛋白的水平。）。(B类)qPCR引物和探针的设计，用于测量染色体1:110319090位置（左）上AsiSI诱导的DSB（红色）附近3-1（180bp）、3-2（1213bp）和3-3（2928bp）位点的切除。第（A）部分（右图）中三个位点（位于Bsg I限制位点的左、3-1、3-2和3-3）切除产生的ssDNA的量化。数据表示三个独立实验的平均值±SEM（参见补充图S13B表明沉默和补充蛋白质的水平。）。(C类)在CTCF缺失的U2OS细胞中，RPA在激光条上的累积与所示GFP标记的全长或截短CTCF蛋白互补（左，见图​图1A，1安培，如上所示）。RPA与γ-H2AX的相对荧光强度如右图所示，作为至少三个独立实验的平均值±SD。每个实验中统计了30多个细胞。

CTCF被牢固地转移到激光线（图​（图2A，2安培,​，FF类和3A级)并有效招募CtIP（图​（图4B4B类和第5页;补充图S4B)DSB系，这是由激光微辐射诱导的，随机将DNA损伤引入整个基因组。这些观察结果增加了CTCF定位于DSB的可能性，而与DNA序列、转录活性或染色质状态无关。然而，来自全基因组方法的现有证据表明，活跃转录区是脆弱的，活跃转录区域内的DSB通过优先积累HR因子而对HR而不是NHEJ有利(30–32). 因此，转录因子CTCF可能通过其ZF DNA结合域定位到转录的染色质，其中DSB生成并固有HR-prone。为了测试这两种可能性，我们首先确认在1号染色体89458296位AsiSI诱导的DSB位点附近是否存在CTCF结合顺式元件。CCBL2基因位点定位于该位置，因此可能形成活性染色质。该CCBL2基因（染色体1:89458296）不是CTCF靶基因，以排除CTCF在AsiSI-ER核酸酶（在DNA损伤诱导之前已经存在）产生的裂解之前与该活性染色质位点结合的任何可能性，而不考虑DNA损伤。通过该位点的ChIP-qPCR，我们确认在DNA损伤前的正常条件下没有CTCF（图​（图2D）。第2天). 我们进一步评估了CTCF缺失对CCBL2基因转录的影响，发现该基因转录稳定，其转录几乎没有因CTCF的缺失而改变(补充图S6). 这表明CTCF几乎不参与CCBL2的转录，并且CTCF确实被招募到该基因活性染色质区域周围的DSB中，以应对DNA损伤。然而，这并不排除CTCF参与活性染色质区域DSB修复而非非活性染色质区DSB修复的可能性，因为HR而非NHEJ被选为活性染色质背景下的主要修复途径(30–32). 因此，CTCF和其他HR组件可以被招募到这些转录站点。

因此，除了上述CCBL2基因的AsiSI切割位点（chromosome1:89458296）外，我们还使用了一个额外的AsiS1切割位点（染色体1:110319090），该位点未映射到任何基因位点。由于附近存在限制性位点，因此以公正的方式选择了该位点进行后续切除实验。我们首先通过富集γH2AX（一种DNA损伤指示物）来评估AsiSI-ER融合核酸酶在不属于任何基因（染色体1:110319090）的非活性染色质上诱导的DSB。我们发现，在AsiSI-ER核酸酶诱导后，γ-H2AX积聚在这个非活性染色质区域（染色体1:110319090）。这表明可诱导的AsiSI-ER将DSBs有力地引入这两个非活性染色质位点(补充图S7)和活性染色质位点CCBL2（染色体1:89458296）。然后，我们询问CTCF是否可以在位于该非活性染色质的AsiSI诱导的DSBs上募集，以及DSBs上CTCF的存在是否影响CtIP和DNA末端切除的水平。同样，CTCF在位于非活性染色质的DSB处富集(补充图S7)，强烈表明CTCF在活性染色质和非活性染色质处被招募到DSB中。接下来，我们研究了CTCF缺失是否会影响非活性染色质区域周围DSB的CtIP募集和连续DNA末端切除。与活性染色质区域的DSBs类似，CTCF缺失减少了CtIP的积累(补充图S7)和非活性染色质区域的DNA末端切除效率（图​（图6B）。6亿). 正如预期的那样，无论是否有CTCF敲除，CtIP的敲除都会将非活性染色质区域的DNA末端切除效率降低到与CTCF或CtIP单一缺失的水平类似的水平(补充图S5B). 这与活动区域的影响一致(补充图S5A)支持CTCF和CtIP在相同的切除过程中发挥作用。总之，活性和非活性染色质实验的结果表明，CTCF在CtIP招募和DNA末端切除中起着关键作用，而与染色质状态无关。

在标准NHEJ（cNHEJ）和HR之间进行选择的细胞周期依赖性调节机制非常重要。在S/G中₂阶段，当姐妹染色单体可用于HR时，MRE11–CtIP负责DSB切除，这涉及DSB的核溶解处理，以产生HR所需的ssDNA尾部(33). 因此，我们研究了CTCF耗竭是否影响细胞周期分布，并发现在对照细胞和CTCF缺失细胞中细胞周期分布情况具有可比性(补充图S8)与前一份报告的调查结果一致(11). 这一结果表明，CTCF介导的HR并不是由细胞周期进程的调节引起的，而CTCF通过不同的机制促进HR。

在切除过程中，RPA覆盖ssDNA，然后磷酸化(29). 为了进一步确定CTCF缺乏是否影响切除，我们用足叶乙甙处理对照细胞和CTCF缺失细胞，并评估RPA磷酸化和染色质结合。在异步细胞中，CTCF-depleted细胞中染色质结合的磷酸化-RPA和CtIP水平变化不大(补充图S9A). 因此，我们评估了CTCF缺陷对S/G中RPA磷酸化和CtIP染色质结合的影响₂阶段。H2AX磷酸化（γ-H2AX）独立于DSB切除，在依托泊苷处理的对照组和S/G中CTCF-depleted细胞中类似₂相位(补充图S9B). 然而，S/G中CTCF-depleted细胞的RPA磷酸化水平和与染色质结合的CtIP水平较低₂与对照细胞相比较(补充图S9B). 此外，与对照细胞相比，CTCF缺失细胞中DSB处的RAD51组装大大减少(补充图S9C)表明CTCF促进了DSB切除，从而导致ssDNA的生成。因此，CTCF能够促进能够胜任RPA磷酸化和磷酸化-RPA染色质结合的ssDNA形成。

为了进一步确定CTCF在DNA末端切除中的作用，我们测试了CTCF的缺失是否会影响DNA损伤诱导的RPA病灶形成，因为CTCF缺失细胞中RPA磷酸化降低(补充图S9D和E)与DSB切除减少相关（图​（图6A6A级和B类). 在mCherry-LacI-FokI报告系统中，内源性CTCF的敲除减少了RPA焦点的形成(补充图S9D)或γ辐照后(补充图S9E). 使用AsiSI–ER–U2OS报告系统的ChIP分析证实，γ-H2AX在DSBs处富集于未转录（染色体1:110319090；非活性染色质）区域，与转录（染色体1:89458296上的CCBL2基因，活性染色质）区域相似(补充图S7)但在缺乏内源性CTCF的细胞中，这些转录和非转录染色质区域附近的DSB处的RPA富集显著受损(补充图S9F). 这些结果表明，在缺乏内源性CTCF的细胞中，尽管γ-H2AX病灶形成没有受到影响，但DSB DNA末端切除导致的ssDNA RPA涂层有缺陷。使用经验证的、以CTCF为靶点的siRNA和siRNA-resistance CTCF构建物，我们进一步评估了通过全长CTCF或其片段在缺乏内源性CTCF的细胞中获得的RPA涂层。在缺乏内源性CTCF的细胞中，全长CTCF或其含有ZF结构域的片段能够逆转RPA募集缺陷（图​（图6C）。6摄氏度). 相比之下，未能逆转CtIP招募缺陷的N端和C端片段（图​（图5）5)没有恢复内源性CTCF耗尽的细胞中受损的RPA募集（图​（图6C）。6摄氏度). 总之，我们的结果表明，CTCF通过增强CtIP对DSB的招募，在HR的DNA末端切除步骤中发挥着重要作用。

我们感谢Roger A.Greenberg博士提供的ER-mCherry-LacI-FokI-DD-U2OS报告员（FokI-U2OS）、Gaölle Legube博士提供的AsiSI-ER-U2OS报告人、Jeremy M.Stark博士提供的用于HR/cNHEJ/aNHEJ/SSA修复分析的GFP报告细胞系，以及Sunyoung Chae博士在微辐射方面提供的技术帮助。