淀粉样β肽的产生是中枢神经元生存能力的关键要求

摘要

介绍

阿尔茨海默病（AD）的病理特征是进行性神经变性和聚集的淀粉样β肽（Aβ）沉积为老年斑块。尽管神经退行性变的机制尚不清楚，但越来越多的证据表明aβ在其中起着关键作用(塞尔科，2001). Aβ是由淀粉样前体蛋白（APP）通过指定为β-分泌酶和γ-分泌酶的蛋白酶高度调控和顺序裂解而来。人类脑脊液中容易检测到Aβ肽，其长度在38到43个氨基酸之间的一系列亚型，主要亚型是Aβ_1–40（90%）和纤维原性Aβ_1–42亚型（10%）。在阿尔茨海默病患者中，1-40和1-42的相对比例分别变为～50%(Mehta等人，2001年). 此外，大脑中的总Aβ负荷显著增加(卡明斯和科特曼，1995年). 因此，许多针对AD潜在治疗的药物开发策略都将重点放在减少这种Aβ负荷上。其中一种方法将β-和γ-分泌酶确定为药物靶点。然而，靶向这些分泌酶可能会产生意想不到的影响，因为已经提出了aβ的生理作用(Ramsden等人，2001年). 有鉴于此，我们研究了β-和γ-分泌酶抑制对中枢神经元活性的影响。我们报告的证据表明，通过药物抑制淀粉样变导致内源性Aβ的丢失，会导致中枢神经元的活性严重降低。

材料和方法

γ-和β-分泌酶抑制剂购自Calbiochem（英国诺丁汉），并溶解在二甲基亚砜和H中₂O、 分别是。Aβ_1–40是葛兰素史克研究公司（Stevenage，英国）赠送的礼物。Aβ_1–42从Bachem（英国圣海伦斯）购买，Aβ25-35从Sigma（英国普尔）购买。3D6抗体是Elan Pharmaceuticals（加利福尼亚州旧金山）赠送的礼物。肽溶解在二甲基亚砜中，溶解在脱氧去离子H中₂100μ时为O米，校准至10μl，并储存于-20°C。

细胞培养。通过酶解和机械分离，从16至18天龄胚胎Wistar大鼠大脑皮层获得皮层神经元的原代培养物(MacManus等人，2000年). 细胞生长在含有5%CO的增湿空气中的24孔板中₂37°C下95%的空气。培养基包括添加10%胎牛血清（FBS）的最低必需培养基（MEM），19 m米氯化钾，2米百万升-谷氨酰胺，26米米葡萄糖、50 U/ml青霉素和50μg/ml链霉素。48小时后，80米米培养基中加入氟脱氧尿苷以防止非神经元细胞的增殖。每3天交换一次培养基，并在第5天到第8天的实验中使用细胞在体外制备大鼠小脑颗粒神经元（CGNs）的原代培养物和大鼠星形胶质细胞的原代培养物，这些原代培养物是从6至8天大的Wistar大鼠获得的，并以与Plant等人(2002年a). 细胞用于第7天到第12天的实验在体外.

使用既定方法培养细胞系（DDT1-FM2、HEK293和畸胎瘤样肿瘤细胞）(Shukla等人，2001年;Plant等人，2002b)在5%CO中作为连续单层培养物₂–37°C时95%空气。培养基由50%MEM和厄尔盐组成我-谷氨酰胺和50%F-12神经元补充剂。培养基中添加10%的FBS、1%的非必需氨基酸、青霉素（50 U/ml）、链霉素和庆大霉素（均为50μg/ml）。

3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物测定。使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化盐（MTT）还原试验评估细胞活力(莫斯曼，1983年)如前所述(Ramsden等人，2001年;Shukla等人，2001年). 使用分光光度计在570 nm测试波长和630 nm参考波长下测量吸光度。学生的吨测试（未配对）用于确定平均值之间差异的显著性第页值<0.05被视为显著。

免疫细胞化学。对于免疫细胞化学实验，在用多聚甲醛（PBS中的4%）固定细胞20分钟之前，用PBS清洗细胞。第二步清洗后，用含有0.2%Triton X-100和10%正常山羊血清（NGS）的PBS渗透细胞。然后用含有1%NGS的PBS清洗细胞，然后用抗aβ（3D6）前五个N端氨基酸的单克隆抗体（1:1000）孵育过夜，该抗体在含有1%NGS的PBS中制备。在一系列PBS洗涤后，将二级抗体添加到含有1%NGS的PBS中1小时。二级抗体是一种与Cy3荧光标记结合的驴抗兔抗体（1:1000；Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）。使用PBS中50%的甘油将盖玻片安装在显微镜载玻片上，并使用标准指甲油密封。在使用之前，将载玻片存放在4°C的黑暗中。使用配备罗丹明滤光片组的蔡司（德国Oberkochen）Axioscop荧光显微镜观察细胞。使用CCD相机和AcQuis图像采集软件（英国剑桥Synchroscopy）拍摄图像。所有图像都是使用相同的曝光和设置获得的。

结果

抑制γ-分泌酶诱导皮层神经元的形态学改变

γ-分泌酶活性由含有早老素和尼卡司汀的多酶复合物介导，代表淀粉样变的速率限制步骤(Kaether等人，2002年). 该复合物的酶活性对肽醛2-萘酰-VF-CHO（γ-IV）敏感。γ-IV是细胞通透性的，已经证明可以可逆地抑制Aβ_1–40和Aβ_1–42ED生产₅₀值为2.6和2.7μ米分别为(辛哈和利伯堡，1999年). 我们用10μ米γ-IV持续24小时，并注意到这些细胞的外观发生了显著变化。应用γ-IV诱导细胞收缩、颗粒化和神经元细胞数量明显减少(图1).

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图1。

γ-分泌酶抑制对细胞形态的影响。与1n孵育24小时后皮层神经元的相控显微照片米Aβ_1–40(A类)，用10μ培养24小时米γ-IV(B类)，和24小时1 n的混合米Aβ_1–40和10μ米γ-IV(C类). 比例尺，100μm。

因为据报道，Aβ在中枢神经元中的转换速度高达2小时(Savage等人，1998年)，我们假设从头开始淀粉样变性和内源性Aβ水平下降可能是慢性γ-IV治疗明显毒性的基础。为了验证这个假设，我们将新皮质神经元与γ-IV和1 n米Aβ_1–4024小时。该策略排除了γ-IV治疗的明显毒性，并表明aβ水平的降低是这种效应的基础(图1C类).

分泌酶抑制与细胞活力降低有关

MTT法用于量化慢性γ-IV治疗后新皮质锥体神经元的相对存活率。这个比色分析证实了我们的形态学研究。因此，24小时γ-IV治疗使新皮质神经元的相对存活率降至43±5%(n个= 9;第页<0.05）与未处理细胞相比(图2A类). γ分泌酶的第二个抑制剂，N个-[N个-（3,5-二氟苯基）-我-丙氨酸）]-S公司-苯甘氨酸吨-丁基酯，指定为γ-分泌酶抑制剂IX（200 n米)在降低皮层细胞存活率方面同样有效(图2A类).

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图2。

分泌酶抑制对细胞活力的影响。A类，用γ-或β-分泌酶抑制剂孵育24小时，以提高皮层神经元的活力(n个=每种情况下为9）。B类，与经车辆处理的对照组相比，皮质培养物上γ-IV毒性的时间依赖性。值是每个时间点四个实验的平均值。C类，与分泌酶抑制剂孵育24小时对小脑颗粒神经元细胞死亡的影响（开放条；n个=9），SH-SY5Y细胞系（阴影条；n个=9）和大鼠星形胶质细胞培养（填充条；n个= 9).D类，用分泌酶抑制剂孵育48小时对非神经元细胞系DDT1-FM2生存能力的影响（开放条；n个=4），HEK293（阴影条；n个=4）和人类畸胎瘤样肿瘤细胞（填充条；n个=4). γ-IX，γ-分泌酶抑制剂。

γ-分泌酶活性与许多神经通路有关，包括Notch加工(塞尔科，2001). 确定淀粉样变在γ-分泌酶抑制毒性中的相对重要性至关重要，并排除其他途径可能介导此效应的可能性。为了解决这个问题，我们试图通过第二种方法防止Aβ的产生。H-KTEEISEVN-stat-VAEF-OH（βSI）是β-分泌酶活性（IC）的有效抑制剂₅₀30n的米) (Sinha等人，1999年)，阻止APP的初始裂解，从而阻止随后的Aβ生成。24小时βSI治疗（100 n米)模拟了γ-分泌酶抑制剂治疗后这些神经元相对细胞活力的下降(第页< 0.05) (图2A类). 第二种β分泌酶抑制剂，N个-苯甲酰氧基-羰基-碱性-亮氨酸-亮氨酸（βSI-II）（10μ米) (Abbenate等人，2000年)，在损害细胞存活方面也非常有效(图2A类).

γ-IV杀伤细胞的能力具有时间依赖性。图2B类显示了用10μ米γ-IV持续2-48小时。显著抑制(n个= 4;第页<0.05）的存活率在首次应用γ-IV后4小时内出现，并且在整个检查过程中观察到毒性增加。

分泌酶抑制剂对神经元有毒性，但对非神经元细胞没有毒性

为了评估分泌酶抑制对其他细胞类型的影响，我们用大鼠CGN和人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y的原代培养物证实了我们的研究。MTT分析显示，γ-IV和βSI对这两种细胞都有显著的毒性作用。24小时后(图2C类)在48小时（数据未显示）的治疗中，细胞存活率下降的程度与皮层神经元相似。有趣的是，从用于小脑颗粒培养的同一种动物的大脑皮层提取的原代培养大鼠星形胶质细胞主要不受分泌酶抑制的影响(图2C类)（另见背景星形胶质细胞图1). 这表明分泌酶抑制剂的毒性作用是神经元特异性的。为了进一步验证这一点，我们将分泌酶抑制剂应用于多种非神经元细胞类型。这些是仓鼠平滑肌细胞系DDT1-FM2、人类胚胎肾细胞系HEK293和从人类畸胎瘤分离的细胞的原代培养物。与γ-IV或βSI孵育48小时后，在这些非神经元细胞类型中未观察到明显的细胞死亡诱导(图2D类).

我们使用免疫细胞化学方法表明，分泌酶抑制剂在我们实验中使用的条件下可以有效地减少Aβ的生成。图3显示了γ-IV和βSI对小脑颗粒神经元内源性Aβ免疫染色的影响。在对照条件下，可以在细胞的细胞质和膜中观察到密集的点状染色(图3A类). 在用γ-IV或βSI处理24小时的细胞中，这种染色大大减少(图3B、 C). 因此，应用这些抑制剂可明显大幅降低内源性aβ水平。

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图3。

分泌酶抑制对神经元中Aβ水平的影响。对照条件下小脑颗粒神经元的荧光显微照片(A类)，用10μl培养24小时后米γ-IV(B类)，并在与100 n孵育24小时后米βSI(C类). 比例尺，30μm。

分泌酶抑制剂诱导的细胞死亡依赖于Aβ的产生

不同神经元群中两种不同酶的独立抑制提供了证据，证明淀粉样蛋白生成在决定培养中生长的中枢神经元的活性方面起着不可或缺的作用。为了证明Aβ对该系统的重要性，我们试图通过添加外源性Aβ来恢复与分泌酶抑制相关的相对细胞活力的不足。在以前的研究中，我们证明大鼠神经元原代培养物与生理上普遍存在的Aβ_1–40异构体，浓度高达1μ米与相对细胞活力的降低无关(Ramsden等人，2001年). 我们将细胞与γ-IV或βSI以及许多不同的aβ大小形式在一个浓度范围内共培养24小时米至1牛顿米能有效逆转γ-分泌酶抑制的毒性作用(图4A类). 的确，10便士米在皮层和小脑颗粒细胞培养中，Aβ对γ-IV诱导的细胞死亡有显著的挽救作用(n个每种情况下=9；第页< 0.05). 这些浓度在人脑脊液中Aβ浓度测量报告的范围内(Mehta等人，2001年)表明这是一种生理效应。Aβ在逆转SH-SY5Y分泌酶抑制剂的毒性方面效果较差。然而，在较高浓度下，Aβ的效果变得明显。例如，当细胞与10 n混合时米Aβ和10μ米γ-IV，细胞存活率为69±3%(n个=6）与58±7%相比(n个=8）仅在γ-IV存在下。将Aβ浓度进一步增加至100 n米或1μ米存活率增加到80±6%(n个=4）和83±9%(n个=4）。

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图4。

淀粉样蛋白对γ-分泌酶抑制剂神经毒性的影响。A类，与γ-分泌酶抑制剂孵育24小时对皮层神经元活力的影响（开放条；n个=9），小脑颗粒神经元（条纹条；n个＝9）和SH-SY5Y细胞系（阴影线条；n个=9）存在不同浓度的Aβ_1–40.B类，与γ-分泌酶抑制剂（10μ米)皮层神经元（开栅；n个=9），小脑颗粒神经元（条纹条；n个=9）和SH-SY5Y细胞系（阴影条；n个=9）在存在不同Aβ尺寸形式的情况下，浓度为1 n米在每种情况下。C类，单克隆抗体3D6（1μg/ml，24小时）对皮层神经元的毒性。通过与Aβ共培养逆转毒性_1–40（1个米)但不是Aβ_25–35（1个米). Aβ肽单独对细胞存活没有影响。在每种情况下，n个= 4.

重要的是，使用γ-或β-分泌酶抑制剂治疗的皮层神经元中，Aβ恢复细胞死亡的能力取决于所使用的Aβ的种类。Aβ_1–42约占人类脑脊液中检测到的淀粉样蛋白总量的10%。γ-IV或βSI与1 n的共立方米Aβ_1–42导致皮质神经元和颗粒细胞中与分泌酶抑制剂相关的细胞死亡得到部分挽救(图4B类). 这种Aβ亚型在1n时不能恢复SH-SY5Y细胞的细胞死亡米(图4B类)或浓度高达1μ米（数据未显示）。此外，Aβ、Aβ的合成毒性部分_25–35（1个米) (Kowall等人，1992年)，未能挽救与分泌酶抑制剂相关的皮层或颗粒神经元活性的缺陷(图4B类).

通过应用Aβ结合抗体3D6结合Aβ的实验，进一步证明了内源性Aβ的产生对神经元的存活至关重要。用3D6（1μg/ml）培养皮层神经元24小时后，细胞活力显著降低(图4C类). 这是抗体的Aβ结合特性特有的效应，因为与Aβ共沉淀_1–40，但不是Aβ_25–35，能有效逆转3D6的毒性作用。

讨论

这里的数据表明，抑制神经元中的β-或γ-分泌酶可能会损害细胞活力。在三种不同的神经元表型中，淀粉样蛋白分泌酶活性的药理学抑制导致细胞死亡。

这些化合物的毒性是否归因于Aβ生成的抑制？有几条证据表明情况确实如此。首先，在本研究中使用的浓度下，这些化合物对aβ的生成产生了深刻的抑制作用。抑制率大于99%从头开始在此处使用的γ-IV浓度下，预计会产生Aβ(Beher等人，2001年)我们自己的免疫细胞化学数据似乎证实了这一点。其次，通过对两种不同的酶的药理抑制，从两个方面阻止了Aβ的产生。重要的是，所有使用的化合物在结构上都不同，这表明毒性不是特定化学成分的非特异性结果。第三，在使用3D6抗体结合和中和Aβ的实验中，我们观察到了毒性作用。这种方法以前曾用于防止缺氧期间Aβ介导的一些效应(Green and Peers，2001年). 值得注意的是，通过与外源性添加的Aβ共培养，我们再次能够防止抗体的毒性作用。所有这些数据表明，分泌酶抑制剂在具有神经元表型的细胞中诱导的毒性不仅是化学毒性，而且与神经元特异性途径的相互作用有关，例如aβ的产生。最后，非神经元细胞类型的毒性不足强烈反对这些化合物的非特异性毒性。

有证据表明，用外源性aβ的微粒体浓度替代内源性aβ可以恢复细胞活力，这进一步证明了毒性是生理性aβ生成抑制的结果。重要的是，Aβ对细胞死亡的拯救取决于所用肽的种类。当使用生理上普遍存在的Aβ物种1-40时，这种影响最为显著。Aβ_1–40证明了以浓度依赖的方式解救毒性，并有效地恢复总细胞活力，以控制浓度在10p之间米和1n米。该浓度范围与人类脑脊液报告的浓度范围一致(Mehta等人，2001年). 值得注意的是，Aβ_1–42在人类脑脊液中的浓度低得多，在挽救神经细胞活性方面效率较低。这可能表示对aβ的生理需求较小_1–42，一种可能无法满足aβ的独特蛋白质_1–40-特定角色。另一种可能性是Aβ_1–42水平下降的速度不如Aβ_1–40分泌酶抑制后的水平。最近的研究支持了这一点，其中Aβ_1–42早老蛋白1（PS1）和PS2（γ-分泌酶抑制剂活性的可能位点）缺失的细胞中都有表达(Wilson等人，2002年). 然而，在我们的研究中，β-分泌酶抑制剂的作用反对这种可能性。与Aβ的保护作用形成鲜明对比_1–40，Aβ的25-35个氨基酸序列对用β-或γ-分泌酶抑制剂处理的神经元细胞没有拯救作用。这种合成肽在健康人或阿尔茨海默病患者体内都不存在。因此，Aβ_25–35在预防分泌酶抑制剂毒性方面，似乎无法取代内源性Aβ。

β-或γ-分泌酶活性的药物抑制剂正在以惊人的速度开发。因此产生了一个问题，为什么这种明显的神经毒性以前没有报道过。许多研究通过无细胞加工探索这些化合物的药理学，通常是根据β-和γ-分泌酶的酶活性(Sinha等人，1999年).体外研究主要使用一系列转化为淀粉样前体蛋白过度表达的非神经元细胞系(辛哈和利伯堡，1999年). 因为这里提供的数据表明，这些细胞的生存能力不依赖于Aβ的产生，所以不会观察到分泌酶抑制剂的毒性。使用神经细胞的研究只检测了分泌酶抑制剂在短潜伏期内的功效(Beher等人，2001年). 有人暗示分泌酶抑制剂的毒性，限制例如适合探索胚胎干细胞中γ-分泌酶依赖行为的γ-IV的浓度，尽管这种毒性没有进一步研究(Wilson等人，2002年).

还使用敲除小鼠研究了分泌酶活性降低的影响。β-分泌酶活性由BACE或β-位点APP裂解酶介导(Vassar和Citron，2000年). BACE-1基因敲除小鼠已被用于检测该酶的功能重要性，并发现其具有长达1年的正常表型，aβ生成减少(Roberds等人，2001年). 这可能意味着BACE-1不参与生理重要蛋白质的生成(蔡等人，2001;Luo等人，2001年). 单一酶活性的组成性降低通常会导致基因操纵生物体中的补偿机制。BACE-2和迄今尚未鉴定的酶对这种缺陷的补偿可能是这种异常的一种解释。对BACE-2活性的额外抑制将有助于我们理解β-分泌酶活性的生理相关性。

与BACE相反，早老素1和2活性的双基因敲除被证明是致命的子宫内(Herreman等人，1999年). 这种毒性主要是Notch信号抑制的结果(De Strooper等人，1999年)当时，对Notch的抑制被认为是γ-分泌酶抑制剂毒性的可能来源。尽管从这些动物培养的细胞中aβ的生成减少了80%，但仅敲除PS1并没有毒性作用(De Strooper等人，1998年;Annaert等人，2001年). 因此，Aβ的生理作用尚未通过此类模型得到证实。

一种替代分泌酶敲除的方法是敲除APP。这似乎会导致纯合子动物出现轻微的神经和行为缺陷(Zheng等人，1995年). 这种动物的神经元可以很容易地在培养基中生长(Harper等人，1998年;怀特等人，1998年)，表明APP及其切割产物不是细胞存活所必需的。然而，最近的研究表明，密切相关的APP-like蛋白（APPLP1和APPLP2）的裂解产物具有转录调节作用(Scheinfeld等人，2002年)可以替代APP本身。APP/APPP联合敲除显示生长迟缓和出生后早期死亡可归因于未知原因，支持APP/APPL家族及其产物具有重要生理功能的假设(Heber等人，2000年).

总之，我们发现，在啮齿动物和人类的神经细胞类型中，在体外抑制Aβ的γ-或β-分泌酶生成以及Aβ与抗体的结合和中和会导致毒性。通过添加生理相关浓度的Aβ恢复细胞活力表明，如前所述，该肽可能在神经元细胞的正常功能中发挥作用(Ramsden等人，2001年).

脚注

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