去极化GABA作用于未成熟海马内在突起的锥体神经元驱动巨大去极化电位

摘要

介绍

对海马体、皮层、视网膜和脊髓的广泛研究表明，不成熟的神经元网络会产生周期性自发网络事件(Ben-Ari等人，1989年; Garaschuk等人。，1998,2000;Feller，1999年;奥多诺万，1999年;Ben Ari，2001年;Leinekugel等人，2002年). 它们通常被认为参与神经元回路的功能和结构发展(Feller，1999年;Penn和Shatz，1999年;Katz和Crowley，2002年;坎德勒，2004;Kasyanov等人，2004年;斯皮策等人，2004年). 基于锥体神经元的细胞内记录在体外出生后早期大鼠海马的自发事件最初被称为巨大去极化电位（GDPs）(Ben-Ari等人，1989年). 这些事件很容易在细胞外场电位（fp）记录中检测到(Lamsa等人，2000年;Khazipov等人，2004年)并侵入所有海马亚区，招募GABA能中间神经元和谷氨酸能主要神经元（Khazipov等人。，1997,2001;Garaschuk等人，1998年;Hollrigel等人，1998年;Menendez de la Prida等人，1998年;Menendez de la Prida和Sanchez-Andres，2000年;本·阿里，2001年). 它们的持续时间为0.5-2 s，频率为0.1-0.3 Hz在体外和体内(Lamsa等人，2000年;Ben Ari，2001年;Leinekugel等人，2002年). 尽管GABA_一-媒介传播促进GDP的发生(Ben-Ari等人，1989年;Garaschuk等人，1998年;Khalilov等人，1999年)，值得注意的是，它们被离子型谷氨酸拮抗剂完全阻断(Ben-Ari等人，1989年;Hollrigel等人，1998年;Bolea等人，1999年;Lamsa等人，2000年;Khazipov等人，2001年).

先前的工作已经充分证明，GABA能在新生儿海马体中传递是功能性兴奋的，表明动作电位放电(Khalilov等人，1999年;Dzhala和Staley，2003年)以及GDP被GABA抑制_一拮抗剂(Ben-Ari等人，1989年;Khalilov等人，1999年;Garaschuk等人，1998年)还有GABA_一激动剂增加GDP频率(Khalilov等人，1999年;Lamsa等人，2000年). 然而，重要的是要认识到，这些发现并不能解释兴奋性GABA能活动如何影响GDP的节律性网络活动特征。特别是，神经元间网络的节律性活动可能驱动GDP，这意味着GABA能活动具有“起搏器”功能。相反，GABA能量传输可能通过增加网络激励的一般水平来促进GDP的发生。最后，在当前背景下必须解决的一个机制是兴奋性GABA能传递在GDP期间神经元活动同步中的作用。

目前的实验是在CA3区域进行的，因为该子场具有产生GDP的最高倾向(Ben Ari，2001年). 总之，我们的数据表明，GABA能传递的去极化作用通过促进未成熟CA3锥体神经元的电压依赖性放电，在GDP的生成中具有暂时的非模式化促进作用。具有特征爆破特性的CA3金字塔负责塑造GDP活动的时间特性。

材料和方法

将Wistar大鼠幼崽（出生后0-6天，其中0天指出生日期）斩首，并在低温（0-4°C）氧合（95%氧合）条件下解剖大脑₂/5%一氧化碳₂)含有以下物质的标准溶液（单位：m米)：124氯化钠，3.0氯化钾，2.0氯化钙₂，25氯化钠_三，1.1 NaH₂人事军官₄，1.3百万硫酸镁₄、和10d日-葡萄糖，32°C时pH值为7.4。对于电生理记录，使用振动切片机（VT1000S；德国努斯洛赫莱卡）切割冠状脑片（350-600μm），并在使用前在32°C下恢复至少1小时。

电生理记录。将单个切片转移到浸没式记录室中，并灌注标准溶液（32-33°C）。Axopatch 200A和200B放大器用于全细胞记录。当填充以下物质时，贴片吸管的电阻为5-8 MΩ（单位：M米)：95 K-葡萄糖酸盐，40 KCl，5 NaCl，2 MgCl₂，和10个HEPES，pH 7.2，含KOH或140 Cs-甲磺酸（CsMs），2 MgCl₂和10个HEPES，pH 7.2，含CsOH。前者细胞内溶液用于电流灯记录，后者细胞内溶液则用于电压灯记录；记录的电压分别用计算的-10或-13 mV的液结电势进行校正(巴里，1994年). 电池输入电阻的测量基于电压和电流灯条件下的小超极化偏转（<10 mV）。分析中包括的所有细胞都有静息膜电位，或在自发活动时，超极化后的峰值（见结果）低于-55 mV。所有细胞内记录均来自CA3锥体神经元，这些神经元通过红外视频显微镜进行视觉识别(Stuart等人，1993年).

对于膜电压的穿孔贴片记录（未注入电流），在50μg/ml浓度的K-葡萄糖酸盐溶液中加入禾本科菌素D（西格玛，圣路易斯，密苏里州），并在用无禾本科菌素溶液预先填充尖端后应用于移液管。在这些记录中，初始密封电阻>5 GΩ，实际电压记录开始时的串联电阻<300 MΩ。

使用传统的氯化钠填充物（150 m）进行细胞外fp记录米)玻璃毛细管电极（尖端直径，5-10μm）放置在CA3区的地层金字塔中。

药物。2,3-二氧-6-硝基-1,2,3,4-四氢苯并[f]喹喔啉-7-磺酰胺（NBQX），d日,我-AP-5，甲溴荷包牡丹碱，6-亚氨基-3-（4-甲氧基苯基）-1（6H（H）)-氢溴酸哒嗪丁酸（SR 95531）（加巴嗪）和盐酸异谷维嗪来自托克里斯·库克森（英国布里斯托尔），苦曲霉毒素来自西格玛。NBQX和d日,我-AP-5为10μ米和40μ米，除非另有说明。苦毒毒素总是在100μ米; 结果中给出了其他药物的浓度。

术语注释。GDP最初是在细胞内记录中观察到的，当时已经得出结论，它们反映了网络活动(Ben-Ari等人，1989年). 然而，将GDP一词同时用于细胞和网络事件（文献中经常这样做）可能会非常令人困惑。在网络水平的GDP中，未成熟海马体中的一些锥体神经元产生GABA能传递诱发的“大超极化电位”(Ben-Ari等人，1989年). 这很可能反映了发育阶段的变化（参见。Tyzio等人，1999年)KCC2表达水平的变化(Rivera等人，1999年;Khirug等人，2005年)在单个锥体神经元中。此外，在没有网络事件的情况下，锥体神经元中经常可以看到动作电位在缓慢去极化的基础上爆发，这很容易让人联想到GDP（“异步”爆发）（参见图2A、 D、E). 因此，当提及细胞内和细胞外记录的网络事件时，我们使用术语GDP和字段GDP（fGDP）（参见。Khazipov等人，2004年)分别是。fGDP是根据特征性缓慢的负fp偏转（范围：20-100μV，0.5-2 s；参见中的成对fp记录图2一对于同步事件）。在成对fp记录中，电极尖端相隔30-200μm。在这些条件下，异步峰值反映了机组活动(Draguhn等人，1998年).

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图2。

单位活动和GDP之间的时间关系。一，在控制条件下，两个同时的fp记录（fp 1和fp 2；间隔约200μm）显示与缓慢的负fp偏移（fGDP）和单位异步突发（星号）相关的同步活动（见结果）。B类，从中所示实验的fp 1和fp 2记录中获得的慢、负fp位移和单位峰值（bin，10 ms；56 fGDP）的互相关直方图一.C类，单个fp记录的累积互相关直方图(n个=8），同时fp和cell-attached(n个=6）录音。D类，细胞内记录显示内在爆发和细胞内GDP（箭头）。请注意，在给定的记录中，可以通过眼睛区分固有脉冲和GDP，但情况并非总是如此。E类，在控制条件下，两个同时进行的fp记录（带通，1-600 Hz）显示fGDP（箭头），这两个记录站点都可以看到fGDP，并且只在任一站点检测到单元异步突发。浓度为10μ米NBQX和40μ米 d日,我-AP-5阻碍了国内生产总值的增长，但仍存在单位爆裂现象。F类fGDP区间直方图(n个=14次录音；n个=668 fGDP；垃圾箱，0.5秒）。G公司，异步峰值的ISI直方图(n个=696个峰值，来自5帧/秒和3个附在电池上的录音）。H（H），NBQX和AP-5中单位活动的ISI直方图（[K⁺]_o个=3-5米米)从四个fp记录中获得(n个=724个峰值）。垃圾箱宽度为0.5 s，与爆发内峰值间隔相关的第一条条在直方图中被截断G公司和H（H）.箭头在F-H（飞行高度）指示优选频率。

因为GABA能在未成熟神经元中传递去极化(Ben-Ari等人，1989年;欧文斯和克里格斯坦，2002年;Yamada等人，2004年)术语sGABA-PSC用于自发GABA能突触后电流，而不是传统的自发IPSC。

分析。使用Clampfit（加利福尼亚州福斯特市分子器件公司）、Strathclyde电生理WinWCP和WinEDR（英国格拉斯哥John Dempster）程序以及Labview（德克萨斯州奥斯汀国家仪器公司）编程的软件，在1.6 kHz下对数据进行低通滤波，在5 kHz下进行数字化，以进行分析。fp峰值的检测阈值设置为基线噪声信号振幅的>4SD。检测到自发网络事件（见结果），阈值设置为最大振幅的一半。在任何给定的实验条件下，用于量化的事件幅度的变化均小于±15%。对于峰值与缓慢负fp偏移的互相关直方图，分析了网络事件发生后±1s的时间窗口，并将在此时间窗口内发生的峰值从异步峰值分析中排除（参见图2A、 D、E、G).

测量补品GABA的含量_一-介导电流，我们首先根据原始数据计算所有点直方图(Brickley等人，1996年). 然后，根据从这些直方图中获得的拟合高斯峰值估计紧张电流的大小。sGABA-PSC被视为全点直方图正侧的不对称“尾巴”。因此，当sGABA-PSCs出现在原始记录中时，正侧最大振幅小于一半的箱子不用于高斯拟合（这些箱子由图5B类). 每个全点直方图包括20-40秒的主要数据。

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图5。

GABA对未成熟CA3锥体神经元的张力和时相作用。一，电压钳记录（0 mV；低氯填充溶液）显示荷包牡丹碱敏感（10μ米)强音电流（低通，100 Hz）。B类，根据中的记录计算的所有点直方图一用虚线包围的箱子未用于高斯拟合，以减少sGABA-PSCs对主音电流估计的影响（见材料和方法）。C类，对照组和荷包牡丹碱的重叠样本痕迹。虚线表示从所示的全点直方图中获得的平均张力电流水平B类虚线之间的区域表示主电流分量传递的电荷转移，而阴影区域反映荷包牡丹碱敏感电荷转移总量。D类，在控制条件下和SR 95331存在的情况下进行电压钳记录。E类，条形图显示不同浓度（微摩尔）GABA对张力电流的抑制_一拮抗剂。bic，荷包牡丹碱；SR，SR 95331。

使用Strathclyde Electrophysiology WinEDR程序检测sGABA-PSC，并使用在Labview下编程的软件计算sGABA-PSC间期的自相关直方图及其振幅谱。为了分析sGABA-PSC的节律性，将这些自相关直方图及其振幅谱与随机洗牌sGABA-PSC区间获得的替代数据的20次相同分析的平均值进行了比较。

带通滤波用于突出显示插图中的单元或总体事件。数据表示为平均值±SEM。

结果

新生儿CA3锥体的起搏器特性

在电流钳下，在存在离子型谷氨酸和GABA拮抗剂（NBQX、AP-5和苦毒毒素）的情况下，65个新生儿CA3锥体神经元中有44个神经元出现自发的棘波爆发，21个神经元在休息时沉默（-70±1.2 mV）。电池的输入电阻为1.2±0.1 GΩ。在自发活动的细胞中，负电流注入导致沉默，而在沉默的神经元中，正电流注入产生爆发活动。尖刺的爆发(图1一（插图）之前是缓慢的再生去极化，开始于约-60 mV，然后是缓慢的后超极化（sAHP），持续时间为～4 s，此时低频率爆发。随着去极化电流的增加，突触的频率增加，伴随着sAHP的振幅和持续时间的减少，而棘波阈值几乎没有变化(图1一).

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图1。

新生儿CA3锥体神经元的内在爆发特性。一，在一个静止的细胞中V（V）_米（-76 mV，0 pA），缓慢增加的正电流（至+9 pA）诱导去极化，去极化变得再生，并触发尖峰脉冲，随后出现sAHP。在较高的电流水平（+24 pA）下，脉冲的频率增强V（V）_米振荡（虚线）减少，而脉冲内的峰值阈值保持近似恒定（顶部虚线）。插入，典型突发（尖峰截断）。在10μ米NBQX，40μ米 d日,我-AP-5和100μ米苦毒毒素。B类，作为函数的突发平均频率的散点图V（V）_米，取自sAHP的负峰值。C类，间歇间隔CV与平均爆发频率(B类,C类; 来自总共10个细胞的不同水平注入电流的数据）。注意，频率大于～0.2 Hz时，间爆发间隔稳定。D类，无药物情况下自发爆发的细胞附带记录样本痕迹。E类，中记录的ISI直方图D类在本图和其他类似图中（见图。2F类-H（H）,​,6B类),6B类)，垂直箭头显示了提供首选爆破频率（0.33 Hz）估计值的分布模式。

神经元表现出高振幅的缓慢膜电位振荡（>15 mV；65个记录细胞中的19个），定义为尖峰阈值之间的最大差异（-50±0.7 mV；n个=10）和sAHP峰值，用于更详细地描述固有破裂。在图1B类，将突发频率绘制为sAHP峰值的函数，这表明其下限为～0.2 Hz（在NBQX、AP-5和苦毒毒素存在下记录的10个神经元的数据）。关于网络行为分析的一个重要发现（见下文）是，在频率低于～0.2-0.3 Hz时，间歇间隔的变异系数（CV；不规则性指标）较高。随着频率的轻微增加，CV突然下降至稳定水平(图1C类). 突发频率的变化（范围，～0.2-1.4 Hz）与突发持续时间（190±37 ms）、每次突发的峰值数（4.2±0.7）或突发内峰值频率（19±2.7 Hz）的变化无关。

在没有离子性突触拮抗剂的情况下，也观察到全细胞模式下的电压依赖性突触爆发（数据未显示）(Menendez de la Prida和Sanchez-Andres，2000年). 然而，由于用移液管填充溶液进行细胞内透析和电极诱导的静息膜电位偏移，全细胞记录变得复杂(Tyzio等人，2003年). 为了研究完整神经元的特性，我们使用了细胞连接的记录配置。在没有药物的情况下，9个神经元表现出如图图1D类，脉冲的首选频率为～0.3 Hz的峰值，如图1E类.

强直去极化对fGDP节律的影响

迄今为止获得的数据表明，一些CA3锥体细胞偶尔会在其振荡电压窗口中破裂，而其他细胞仅在fGDP期间被激活。fGDP由锥体爆裂控制的假设导致了另一个预测：强直去极化将大多数CA3锥体推入其振荡电压窗口，将导致稳定的fGDP节律，其频带与锥体神经元稳定爆裂的频带相同（大于～0.2-0.3 Hz）(图1C类). 该预测使用升高的[K进行了测试⁺]_o个以及一种特殊的GABA，异谷维甲酸_一已证明能使新生CA3神经元去极化的激动剂(Ben-Ari等人，1989年). 异古瓦辛（0.25-1.5μ米)fGDP频率增加(图3一₁，C)并将其稳定在～0.2-0.4 Hz。在四个实验中，有四个实验认为这是一个狭长的、高斯型的fGDP区间分布(图3一₂)fGDP区间的CV减小。类似地，[K的标高⁺]_o个不仅导致fGDP频率的增加(图3B类₁，C)但值得注意的是，当fGDP平均频率达到～0.2 Hz时，fGDP区间分布变得更窄，呈高斯型(图3B类₂). 散点图显示了fGDP区间与其平均频率的CV，如图所示图3D类与未成熟CA3锥体神经元内禀爆发相关的对应图极为相似(图1C类). 尽管fGDP区间分布在总体数据中显示了一个在～3.5秒的明显峰值(图2F类)，这在标准条件下fGDP平均频率非常低的个人记录中没有发现(图3B类₂). 然而，在这些实验中，强直去极化导致fGDP区间分布的峰值大于～0.2 Hz。正如预期的那样，[K⁺]_o个距控制标高3 m米至1-2米米导致fGDP几乎完全废除(n个= 4) (图3C类). 这些发现的新颖之处在于，可以从CA3金字塔的电压依赖性破裂行为中准确预测fGDP节律对去极化的依赖性。

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图3。

增强的紧张刺激对网络节律的影响。一₁，fp记录显示异古维a引起的fGDP频率增加（等g；0.5-1μ米; 【K】⁺]_o个在5 m处保持不变米; 带通，0.1-5 Hz）。一₂，fGDP区间直方图，来自实验，如所示一₁.B类₁，fp记录，fGDP处于不同的[K水平⁺]_o个（带通，0.1-40 Hz）。B类₂，对应的fGDP区间直方图（每个条件下101个fGDP；箱宽，0.25-2s）。C类，散点图显示fGDP频率与[K的平均值⁺]_o个来自15个实验，在不同的[K⁺]_o个以及在不同异古瓦辛浓度下14次记录的四个实验的平均fGDP频率与[异古瓦辛]的关系。D类，fGDP区间的CV与来自相同实验的平均频率的散点图C类.

与控制条件下的先前发现一致(Ben Ari，2001年;Leinekugel等人，2002年)同步电压灯和fp记录显示，sGABA-PSCs的节律性爆发与fGDPs在升高[K⁺]_o个（7米米;n个= 6) (图4一). 在图4B类sGABA-PSCs与fGDPs的叠加互相关直方图以及单位峰与fGDP的叠加互关联直方图表明，在fGDP生成期间，神经元间活动与锥体神经元的活动平行增加。然而，单位金字塔峰集中在fGDP的开始，而sGABA-PSC分布更均匀，出现的时间窗口更长。sGABA-PSCs的自相关直方图以3.8±0.2 s的间隔出现侧峰，而基于替代数据的自相关柱状图中没有清晰的峰(图4C类₁)（见材料和方法）。相应地，自相关直方图的振幅谱显示出稳健的周期性，峰值在～0.2-0.3 Hz，这在基于替代数据的谱中没有发现(n个= 6) (图4C类₂). 这表明中间神经网络正在经历具有类似fGDP的周期性的鲁棒网络振荡。然而，重要的观察结果是NBQX（10-40μ米)和AP-5（40-120μ米)消除了sGABA-PSC节律性和fGDP，但没有发现细胞外记录中的单位破裂(n个= 6) (图4A、 D类). 这表明中间神经元的节律活动不是神经网络的固有特性，而是由谷氨酸能神经元控制的。

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图4。

谷氨酸能神经元以首选fGDP频率刺激中间神经元的节律活动。一，同步电压灯记录（0 mV；低氯填充溶液）和7 m内的fp记录米【K】⁺]_o个显示与fGDP相关的sGABA-PSCs爆发以及NBQX和AP-5的影响。相同的fp记录以两种不同的带宽显示，以说明缓慢的负fp偏移（fGDP）和相关的fp峰值。注意在药物存在的情况下存在单位fp爆发和fGDP缺失。B类，sGABA-PSCs与fGDP（黑线）的交叉相关直方图，该直方图由七个电压灯记录获得，单位峰值与fGDPs（灰线）基于八个fp和六个细胞附带记录的数据。的零时间x个-轴设置为fGDP的一半最大值（参见材料和方法）。C类,D类，sGABA-PSC区间的自相关直方图及其功率谱（黑线）(C类₁,C类₂)和存在(D类₁,D类₂)拦截器的数量。灰色线表示替代平均值(C类,D类)，灰色虚线表示±2个SD(C类₂,D类₂).

未成熟的CA3锥体神经元接受强烈的GABA能量输入

在使用基于CsMs的移液管填充溶液（见材料和方法）和0 mV的保持电位进行电压灯记录时，GABA的槽应用_一拮抗剂荷包牡丹碱（10μ米)阻断sGABA-PSCs并将保持电流降低6.7±0.84 pA(n个= 10) (图5A、 B类). 与荷包牡丹碱降低电流噪声一致，高斯拟合的SD降低了35±0.049%(n个= 10;第页= 0.0006). 细胞输入电阻增加了43±10%(n个= 4;第页= 0.046). 苦毒毒素（100μ米)还阻断sGABA-PSCs并将保持电流降低8.6±0.9 pA(n个= 13) (图5E类). 这些数据表明，未成熟的CA3锥体神经元接收到明显的强直（很可能是突触外）GABA_一-中介输入(Brickley等人，1996年;Farrant和Nusser，2005年).

GABA介导的平均总电荷转移_一受体被计算为对照溶液中电流与荷包牡丹碱存在下电流之差的时间积分(图5C类，阴影区域）。通过乘以从全点直方图中获得的主频电流值，估算了主频电流传递的平均总电荷转移(图5B类)按时间(图5C类，虚线之间的区域）。强直电流对总GABA的贡献_一-介导电荷转移为87±3%(n个=10）在GDP间隔期间（即，看到异步机组突发的时段）。

另一个GABA_一拮抗剂SR 95531对相态GABA的抑制作用强于强直（突触外）GABA的作用(Bai等人，2001年;Stell和Mody，2002年). 浓度为0.2、0.4、3和10μ米，我们观察到基线电流的剂量依赖性降低(图5D、 E类). SR 95531（3-10μ米)完全阻断sGABA-PSCs，在10μ米比10μ米荷包牡丹碱(图5E类). 事实上，补品GABA的很大一部分_一3μ不抑制电流米SR 95531是一个完整的sGABA-PSCs块，在关于GABA能量作用对fGDP生成的作用的其他实验中使用(图8A、 B类)（见下文）。

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图8。

在没有神经元间输入的情况下，张力性GABA作用增强fGDP。一，控制条件下的电压钳记录（0 mV；低氯填充溶液），添加3μ米SR 95531，随后添加异谷维辛（10μ米)最后加入苦毒毒素。B类，在与中类似的条件下fp记录的痕迹一（带通，0.2-15 Hz）。斯里兰卡，斯里兰卡95531；等值线。，异古瓦辛。

GABA促进单位活动的能量

在AP-5和NBQX的见证下，进一步增加GABA_一拮抗剂（苦毒毒素或荷包牡丹碱）阻断配对fp记录中确定的单位活性(图6一). 值得注意的是，当[K⁺]_o个随后以1米的步幅升高米，单位爆炸活动已恢复(图6一)阈值为5-8 m米【K】⁺]_o个，并且ISI分布在5 s（～0.2 Hz）时再次达到峰值(图6B类). [K可能导致机组爆炸⁺]_o个在控制条件下未检测到异步活动的记录中，突触阻滞剂的存在也会使神经元兴奋，这表明静默的CA3神经元可以通过强直去极化来诱导神经元爆发。

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图6。

内源性GABA促进单位爆发活动。一，在AP-5和NBQX存在的情况下，同步fp记录（fp 1和fp 2；带通，1-600 Hz），显示被苦毒毒素阻断的单位脉冲。此后，通过升高[K⁺]_o个1米米台阶至8米米在存在阻滞剂的情况下达到峰值活动阈值。B类，ISI直方图在最低提升水平[K下获得⁺]_o个在存在离子型谷氨酸能和γ-氨基丁酸能拮抗剂的情况下，诱发单位放电（首选频率，0.21 Hz）（来自5 fp记录的汇总数据；n个=503个尖峰）。C类，在控制条件下，添加10μ米荷包牡丹碱。尖峰被截断。

用革兰西汀穿孔补片研究内源性GABA对新生锥体神经元的作用(Kyrozis和Reichling，1995年). 在五个实验中，有五个实验通过浴敷10μ米荷包牡丹碱伴随超极化(图6C类)2～10 mV，在对照组静息膜电位更为正的细胞中观察到更大的超极化（范围为-55～-68 mV）。

内源性GABA促进节律网络活动

与之前的观察结果一致(Ben-Ari等人，1989年;Garaschuk等人，1998年;Khalilov等人，1999年), 10 μ米在九个实验中的七个实验中，荷包牡丹碱完全阻断了现场记录中的fGDP(图7一)在剩下的两个实验中，频率明显下降。在应用荷包牡丹碱完全阻断fGDP的实验中，[K⁺]_o个总是诱导种群活动的恢复[称为非GABA事件（NGEs）]，这在许多方面类似于在控制条件下看到的fGDPs(图7A-D公司).

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图7。

内源性GABA促进网络活动。一，fp记录显示fGDP封锁10μ米荷包牡丹碱（bic）。随后的标高为[K⁺]_o个在完全缺乏GABA的情况下诱导同步种群活动的恢复_一传输（NGE；带通，0.2-15 Hz；见结果）。B类₁，fp记录，显示单个NGE（[K⁺]_o个=7米米).B类₂，从四个记录中获得的峰值与缓慢负fp偏移的互相关直方图。C类，显示平均NGE频率与[K的散点图⁺]_o个（•）来自8个实验，22个记录在不同的[K⁺]_o个为了便于比较，fGDP相关图中的数据来自图3C类也显示了（○；来自15个实验，56个记录在不同的[K⁺]_o个).D类，NGE间隔CV与平均频率（•）的散点图，与C类。来自的相应数据图3D类图中还显示了与fGDP相关的数据（○）。

在NGE期间，90%的峰值被限制在390 ms周期内，即-155 ms至+235 ms，从缓慢负fp偏移的一半最大值开始(图7B类). 这表明，对于NGE和fGDP，单位突发持续时间及其与网络活动的时间关系是相似的。此外，NGE频率显示出对细胞外钾的依赖性，尤其是向更高的[K⁺]_o个控制条件下与fGDP相比的水平(图7C类). 更高的要求[K⁺]_o个对于NGE相对于fGDP频率的给定增加，这与我们关于GABA在fGDP生成中的暂时非模式去极化作用的一般想法是一致的。最后，CV与平均NGE频率图显示出与fGDP在～0.2-0.3 Hz时类似的突然下降(图7D类). 这表明NGE和fGDP的间隔变化是由CA3锥体神经元在不同幅度的去极化过程中的间歇间隔形成的（见上文）(图1C类).

讨论

虽然fGDP生成的突触基础已经得到了很多关注，但这表明GABA具有功能性兴奋作用_一受体介导的动作（见引言），关于未成熟海马体中这种网络节律的调控机制，目前几乎没有可用的信息。目前获得的几条证据表明，GABA的关键作用是使CA3锥体神经元去极化至其产生突发电压窗口。CA3金字塔的这种内在破裂反过来又导致了所见的～0.3 Hz的首选fGDP频率在体外值得注意的是，在未成熟海马体自发网络活动的记录中也可以看到这种频率的峰值体内(Leinekugel等人，2002年).

在各种神经元结构中，包括丘脑、新皮质、小脑、脑干、脊髓和成熟海马，都充分证明了内在放电特性在网络振荡的生成和模式形成中的关键作用(利纳斯，1988年;Smith等人，1991年;Steriade等人，1993年;Hutcheon和Yarom，2000年;Marder和Bucher，2001年). 我们在这里表明，电压依赖性间歇放电是未成熟CA3锥体神经元的一种固有特性，在谷氨酸能和GABA能离子拮抗剂的存在下都可以看到。此外，在没有药物的情况下，也会发生频率为～0.3 Hz的猝发，这表明在持续的突触活动中，潜在的内在属性基本上控制着CA3金字塔的放电模式。

CA3锥体的内在爆发驱动和塑造未成熟海马中的fGDP，这一观点与以下事实完全一致，即离子性谷氨酸能传递对于fGDP下网络活动的生成是必需的，但对于单位爆发则不是必需的。特别是，在fGDP间期（异步爆发）和谷氨酸阻滞剂存在时，单位活动的首选频率与fGDP的首选频率相似。相反，阻止GABA_一-介导的传递通过膜超极化阻止自发单位放电，而随后的去极化是通过增加[K⁺]_o个诱导单位活动的恢复。当然，这是从CA3金字塔的电压依赖性爆发特性和强GABA的存在中可以预期的_一-介导电导。根据单个神经元的行为，降低[K⁺]_o个或阻止GABA_一受体对fGDPs具有抑制作用。通过增加[K实现去极化⁺]_o个或外源GABA_一激活不仅使fGDP的平均频率增加，而且使其在超过～0.2-0.3 Hz时的时间稳定性增强，这是未成熟CA3金字塔节律性内在爆发的频率。

目前的数据表明，神经元间网络不具备对～0.3 Hz节律至关重要的内在特性。事实上，谷氨酸受体拮抗剂消除了在首选fGDP频率下观察到的显著节律性sGABA-PSC活性(图4). 因此，在fGDP期间，中间神经元似乎被锥体神经元的节律性输入吸引至其约0.3 Hz的群体活动。在氰尿酸（一种竞争性谷氨酸阻滞剂）、代谢性谷氨酸受体激动剂、局部电刺激或应用GABA或AMPA的情况下，已证明可诱导细胞内记录的荷包牡丹碱敏感性爆发(Strata等人，1995年;Bolea等人，1999年). 这可能被视为fGDPs的中间神经起搏器的证据。然而，上述实验是使用细胞内记录进行的，无法明确区分细胞级突发事件和网络事件（参见材料和方法）。值得注意的是，GYKI 53655（一种非竞争性谷氨酸拮抗剂）完全阻断了这些细胞内记录的爆发(Bolea等人，1999年). 因此，所有可用数据表明，离子型谷氨酸受体介导的传输是fGDP生成所必需的。

除了上面讨论的结果外，缺乏对时间模式GABA的要求_一在异谷维甲酸和升高[K⁺]_o个在GABA在场的情况下进行比较_一拮抗剂。在一个完整的GABA模块中_一-荷包牡丹碱介导的传播，[K升高⁺]_o个总是恢复人口活动，其时间特性与fGDP相似。竞争性GABA_一拮抗剂SR 95531也使我们能够进行实验，发现强直性GABA增加_一行动是在完全没有相位和部分强直GABA阻滞的情况下实施的_一-媒介传播(Stell和Mody，2002年) (图8A、 B类). 最初，SR 95531抑制fGDP，但随后应用异古维a强烈激活节律性网络事件。以上讨论的所有观察结果都是基于一个简单的假设，即CA3金字塔的电压依赖性内在爆发是导致fGDP频率和时间稳定性变化的事件链中任何去极化或超极化影响的近端作用点。

值得注意的是，因为GABA_一拮抗剂在单位爆裂水平上也有抑制作用，不支持去同步化可以解释其对fGDP的抑制作用的观点。一般激发水平的降低（即非模式化、易化GABA能量作用）可以充分解释观察到的效应。这也得到了以下发现的支持：⁺]_o个总是会导致人口激增。相比之下，离子型谷氨酸拮抗剂在质量上具有非常不同的效果，因为它们会导致去同步(Ben-Ari等人，1989年;Hollrigel等人，1998年;Bolea等人，1999年;Lamsa等人，2000年;Khazipov等人，2001年)在升高的[K⁺]_o个但没有阻止这些细胞的自发活动。

本研究中一个有趣的新发现是，在未成熟的CA3锥体神经元中，内源性GABA激活了一个大的强直（突触外）电导(图5) (Brickley等人，1996年;Farrant和Nusser，2005年). 荷包牡丹碱的应用增加了稳态输入电阻，在GDP间期，补益成分占总GABA的～87%_一-介导电荷转移。在控制条件下，未成熟CA3金字塔中大量的强直GABA电导反映了非脱敏高亲和力受体的存在(Stell和Mody，2002年)与4-32μ米异古维辛（图。​（图3一,三一,8A、 B类)和其他GABA_一激动剂(Khalilov等人，1999年;Lamsa等人，2000年). 有趣的是，以前的结果(Valeyev等人，1993年;Demarque等人，2002年;欧文斯和克里格斯坦，2002年)对未成熟神经元的研究表明，强直性GABA活动在相突触GABA能量传递之前发生。前者被认为具有营养作用，依赖于去极化和随后的下游信号转导(欧文斯和克里格斯坦，2002年).

根据目前的数据，fGDP的产生是由任何足以激活可能只有几个金字塔细胞的亚群中电压依赖性内在爆发的去极化启动的(Traub和Wong，1982年; 囊性纤维变性。Miles and Wong，1983年). 这将导致（1）反复的锥体兴奋(Miles and Wong，1983年;Bolea等人，1999年)（2）中间神经元的兴奋(Khazipov等人，1997年)这可能会对未成熟的锥体神经元施加额外的、反复出现的GABA能量反馈驱动(图4B类) (Ben Ari等人，1989年;Khalilov等人，1999年; 梅内德斯·德拉普里达和桑切斯·安德烈斯，1999,2000). 因此，锥体神经元和中间神经元群之间的兴奋和同步性快速增强会产生fGDP（参见Traub和Wong(1982)关于去抑制的成熟海马体的数据]。如果对金字塔施加强直去极化，则fGDP间隔由金字塔细胞的本征爆发间隔确定，如当前数据所示（图。​（图2，2,​,3,三,​,44).

在控制（生理）条件下，GABA的强直作用在CA3金字塔的去极化中起主要作用。显然，我们的数据并不排除相位GABA能量输入可能引发固有金字塔爆发的可能性(Ben-Ari等人，1989年;Khazipov等人，1997年; 参见梅内德斯·德拉普里达（Menendez de la Prida）和桑切斯·安德烈斯（Sanchez-Andres），1999,2000;Ben Ari，2001年). 然而，值得注意的是，我们发现神经元间网络不会在锥体神经元上产生时间模式的输入，以加快fGDP活动。本研究中一个重要的新发现是，金字塔网络上的非模式去极化GABA能量驱动可以充分解释众所周知的GABA能量传输在fGDP生成中的兴奋作用。我们目前的数据还表明，在GABA_一受体被阻断，或存在高[K⁺]_o个(Traub和Wong，1982年;阿拉迪和麦卡费里，2004年). 此外，在人类内侧颞叶癫痫中，脑室下锥体起搏器中的兴奋性（去极化）GABA能活动会产生发作间期活动（Cohen等人。，2002,2003). 上述观察结果引出了一个有趣的观点，其中作用于锥体起搏器的功能性兴奋性GABA能传递是两种广泛研究的自发网络事件的共同特征：（1）未成熟海马产生的fGDP和（2）成熟癫痫海马的发作间期活动，其中，GABA能传递在神经元损伤后重新获得新生儿特征（Rivera等人。，2002,2004;Cohen等人，2003年;Payne等人，2003年).

脚注

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