新的杂合突变NFKB2型与早期发生CVID和NK细胞功能缺陷相关，并伴有传播性CMV感染和严重肾病综合征

摘要

背景

常见可变免疫缺陷症（CVID）是最常见的诊断症状性原发性免疫缺陷症之一。临床和免疫表型表现高度异质，临床上最典型的表现是反复感染、肺部炎症伴或不伴支气管扩张，有时与自身免疫性表现有关，如肉芽肿病和淋巴增生(1). 特征是B细胞功能障碍，导致抗体生成受损和低丙种球蛋白血症；并且多达三分之一的患者可能具有相关的T细胞缺陷。<10%的病例阐明了CVID的潜在遗传机制，并描述了20多个CVID的遗传原因(1–三). NF-κB转录因子对免疫应答至关重要，NF-κ的B转录因子及其调节因子的突变导致原发性免疫缺陷和自身免疫(4,5). 非规范NF-κB通路对B细胞存活、分化为浆细胞、同型类转换以及树突状细胞活化至关重要(6,7). 已在CVID患者中发现该途径中的许多单等位基因和双等位基因突变（即。，挡板、TACI、TNFSF12、TRAF3、NIK、NFKB2). 有趣的是，在TACI/塔西杂合子和双等位基因变异与AD/AR CVID疾病特征的关联表明，这种表型可能是由细微的基因剂量扰动引起的(8).

核因子κB亚单位2（NF-κB2）由p100蛋白组成，p100蛋白是非规范NF-κ的B通路的中心成分，也是规范通路的抑制剂。p100蛋白被其C末端丝氨酸残基（Ser 866，Ser 870）磷酸化激活，触发其分解为p52，然后转运到细胞核(7). CVID和中央肾上腺功能不全之间的联系以前被认为是前垂体功能缺陷伴可变免疫缺陷（DAVID）综合征(9). 后来NFKB2型（MIM 164012）被确定为导致早发性CVID，与中央肾上腺功能不全、外胚层发育不良和自身免疫性存在可变关联(10–16). 这些患者的免疫表型以B细胞严重缺乏和外周T细胞增殖和分化缺陷为特征(12,17). 也有报道称自然杀伤（NK）细胞功能下降(15,18).

在这里，我们描述了一名女性患者，在NFKB2型表现为早发CVID、外胚层发育不良、亚临床肾上腺功能不全和功能性NK细胞缺乏，伴有全身CMV感染，与严重肾病综合征相关。本病例报告强调了NK细胞功能与预后的相关性，并提示功能性NK细胞评估可能影响这些患者的治疗策略。

案例介绍

一名女性患者出生于无血缘父母的家庭，无免疫缺陷或内分泌疾病家族史，在2岁之前无症状，表现为脱发进展为普遍性脱发、甲沟粗大（沙纸状、粗糙的指甲，带有突出的线性脊），银屑病样皮炎和特应性皮炎。未检测到面部和牙齿异常(图1A). 随后，她出现反复的细菌性上下呼吸道感染，6岁时的免疫学评估显示出低丙种球蛋白血症（IgG 180 mg/dl，IgA<4 mg/dl、IgM 4 mg/dl），缺乏记忆B细胞的低B细胞和破伤风和肺炎球菌疫苗的非保护性抗体滴度与缺乏B细胞的CVID一致。T和NK细胞数量正常，但T细胞对植物血凝素（PHA）的增殖减少(表1).

在单独的窗口中打开

图1

患者临床表现。（A）左图显示因长期类固醇治疗而出现全脱发、水肿和类库欣样面容的患者的面部。右图为脚趾甲的气管炎。（B）显示两名健康的非血性父母和一名c.2611C>T突变患者（箭头所示）的家族谱系NFKB2型给出了家庭中每个个体的桑格轨迹。（C）NK细胞细胞毒功能测定方法⁵¹铬释放试验。左图显示了在利妥昔单抗存在（虚线）和不存在（实线）的情况下，针对Raji B细胞靶点测量的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。右图显示IL-2刺激存在（虚线）和不存在（实线）时对K562靶细胞的天然细胞毒性。由于样品可用性和运输限制，这证明了一次分析是一式三份的。（D）肾活检电镜显示足趾消失和少量系膜沉积（E）左图显示患者在疾病最后阶段拍摄的胸部X光片和胸部CT扫描，显示多个双侧肺泡损害病灶，双侧基底叶、左上叶和内侧叶广泛实变。（F）图示血液（蓝色）和蛋白尿（橙色）中CMV滴度的变化，黑色箭头表示肾病综合征（NS）再激活。免疫抑制和抗病毒治疗在疾病过程中使用时，用彩色方框标明。

患者在9岁之前，每月静脉注射免疫球蛋白（IVIG）替代治疗均未出现明显感染，当时她患上了CMV肺炎，并用静脉注射更昔洛韦成功治疗，随访时CMV聚合酶链反应（PCR）检测呈阴性。在第一次CMV感染后，尽管更换了免疫球蛋白并需要抗生素预防，但她还是出现了反复的上下呼吸道感染。CMV感染可能是她T细胞功能低下的一个特征，但也增加了NK细胞功能异常的可能性。因此，通过使用K562靶细胞进行铬释放试验来评估NK细胞功能，该试验表明NK细胞的细胞毒性降低，IL-2的改善效果不佳，并且抗体依赖性细胞的细胞毒作用降低(图1B).

在获得患者的知情同意和父母的知情同意后，进行了三组全外显子组测序（WES），并确定了一个从头开始的杂合c.2611C>T，（总读数的变体123/221=0.55）p.Gln871^*中的变量NFKB2型（NM_001077494）导致NF-κB2 C末端部分的过早终止密码子。WES结果位于该位点从头开始的变异等位基因的性质通过正交Sanger测序得到证实(图1C). NMDEsc预测器(19)用于确定该变体是否会被预测为逃避无意义介导的衰变（NMD）。与其他C端子类似NFKB2型变体(表2)格林871^*预计会逃避NMD，并可能导致截短蛋白的翻译。该变体不存在于ExAC、gnomAD、1000基因组项目或WES内部孟德尔基因组中心（CMG）数据库内约9000个受试者样本研究的其他个人基因组中；因此，我们将其解释为一种新的致病性罕见变异，推测为功能丧失（LoF）等位基因。ExAC计算出该基因的功能丧失不耐受概率（pLi）为1，这意味着它不太可能耐受LoF。该患者中未发现其他已知的原发性免疫缺陷突变或潜在候选基因。根据这一结果，通过客观的实验室分析对垂体功能进行了评估和研究，结果表明血清皮质醇和促肾上腺皮质激素（ACTH）水平降低；因此，开始了糖皮质激素替代治疗。其他垂体激素在正常范围内。自身抗体检测，包括抗核抗体（ANA）、抗中性粒细胞细胞质抗体（ANCA）、抗肾上腺和抗甲状腺抗体均为阴性。

患者12岁时因胃肠炎、全身性肠水肿和严重肾病综合征入院，并进展为急性肾功能衰竭。定量CMV PCR阳性>2×10⁶血液中拷贝数/ml，肾活检阳性（组织中未定量）。肾脏组织学显示局灶性节段性肾小球硬化，伴有毛细血管外高细胞和轻度肾小管间质萎缩。超微结构显示微小变化肾病的蒂完全消失特征，细胞病理学上未发现细胞内包涵体或抗体沉积(图1D). 免疫荧光对C3和IgG呈微弱阳性，对C1q、IgA、IgM和纤维蛋白呈阴性。外显子组文件筛选了可能与肾病综合征相关的致病性足霉素突变，但未发现致病性变异。有趣的是，血液中CMV滴度的升高似乎先于肾病综合征的复发，并与蛋白尿的增加相关(图1F). 由于慢性系统性巨细胞病毒感染和严重肾病综合征伴急性肾功能衰竭，她需要间歇性危重级护理和系统性类固醇治疗。她还接受了IVIG，广谱抗生素，jiroveci肺孢子虫使用复方新诺明、更昔洛韦预防CMV耐药株和CMV特异性免疫球蛋白（Cytogam®）导致的膦甲酸进展。尽管进行了积极的抗病毒治疗，但不可能完全控制CMV感染或肾病综合征，这些疾病的波动与血液中CMV滴度保持在1×10之间⁶和4×10⁶尽管进行了积极的治疗，但复制数/ml。免疫抑制治疗，首先是霉酚酸酯（MMF），然后是环孢素。她对这种治疗有初步反应，蛋白尿减少。不幸的是，CMV感染无法清除，肾病综合征最终对治疗无效。在这种临床背景下，干细胞移植是不可行的。在这最后的终末期疾病期间，她患上了jiroveci肺炎肺炎和真菌性肺部感染(图1E). 支气管肺泡灌洗阳性jiroveci肺孢子虫、CMV和半乳甘露聚糖。她因系统性巨细胞病毒感染相关的肾病综合征首次入院1年后，发展为多器官衰竭，13岁时死亡。

异基因免疫异常可能导致患者的临床表现和对慢性CMV感染的易感性。为了了解这些异常，在冷冻保存的PBMC死后对患者T细胞和NK细胞进行进一步的表型鉴定。在T细胞中，CD4和CD4的中央记忆和效应记忆T细胞减少⁺和CD8⁺观察到T细胞室(图2A). 如前所述，进行了全面的NK细胞表型分析(22). NK细胞数量和CD56的比例^明亮的和CD56^昏暗的NK细胞在正常范围内，与健康供者对照组相似(图2B). 在与黏附、激活和抑制或NK细胞发育相关的NK细胞受体的表达中没有检测到异常，尽管慢性CMV感染，但我们没有观察到NKG2C的扩张⁺或CD57⁺先前报告的子集(23). 用PMA和离子霉素刺激5小时后评估细胞因子的产生。虽然γ干扰素的产生与对照组相似，但观察到GM-CSF和TNFa的产生减少。CD107a动员和穿孔素水平与对照组相当(图2C).

在单独的窗口中打开

图2

（A）流式细胞术斑点图显示总CD3中的T细胞记忆亚群⁺T细胞和CD4⁺和CD8⁺子集。（B）流式细胞术点图显示患者和对照NK CD56⁺NK细胞和CD56上的门控^尺寸和CD56^明亮NK细胞。（C）显示CD56内不同NK细胞标记物和受体的平均荧光强度和阳性细胞百分比的5个面板^尺寸和CD56^明亮NK细胞。与健康供体相比，低百分比的细胞标记为红色。

发布本病例报告和任何可能的识别信息/图像时，已获得患者父母的书面知情同意。

讨论

NF-κB转录因子家族的两个成员，NF-κ的B1和B2，作为前体蛋白产生，即NFκB1 p105和NF-κB2 p100。NF-κB蛋白的转录调控涉及典型和替代途径，分别导致这些蛋白活化形式p50和p52的核移位。在非规范路径中NFKB2型转录物首先被翻译成p100前体蛋白，该前体蛋白通过NF-κB诱导激酶（NIK）进行活化依赖的细胞质蛋白水解过程，转化为较小的活性转录因子p52。NF-κB诱导物的一个子集（淋巴毒素-β、B细胞激活因子和CD40配体）刺激NFκB2/p100的处理，以调节外周淋巴器官生成、B淋巴细胞分化和适应性体液免疫(24,25).

正如先前报道的那样NFKB2型编码蛋白质C末端区域的基因，干扰免疫和内分泌功能，导致中枢促肾上腺皮质激素缺乏和CVID(10–13). 我们的患者携带一种新的NF-κB2 C末端突变，其临床和免疫学表型与该基因C末端突变的其他个体非常相似，包括早发性联合免疫缺陷、脱发和甲沟炎。肾上腺功能不全在临床上并不明显，只有在NFKB2型发现突变。

大多数与原发性免疫缺陷相关的突变NFKB2型LoF突变是否发生在C末端结构域，Arg853处的变异是最常见的报告(图3). 在大多数情况下，带有提前终止密码子（PTC）的无义/移码等位基因的转录物预测会逃避NMD，并导致截短的蛋白质失去磷酸化位点，而磷酸化位点对其与NIK的相互作用至关重要。因此，p100不会被处理成p52。最近描述了两个具有功能获得（GoF）等位基因的家族，从这些致病无义变异体转录的mRNA似乎也逃过NMD，导致截短的蛋白质，与C末端无义突变相比，截短的蛋白导致细胞核中p52的积累增加。有趣的是，对于E418^*变异，一个无症状家族成员携带变异，但没有截短的蛋白表达；表明mRNA降解可能保护他免受疾病(20). 我们的患者的停止增益突变也被预测不会使mRNA不稳定并受到NMD的影响，因此由于PTC，突变转录物可能被翻译并编码C末端异常蛋白(19). Gln871残基紧邻NF-κB2的S870磷酸化位点，其中p100与NIK相互作用，诱导其加工成p52。因此，很可能Gln871^*会干扰p100对p52的处理，导致细胞核中的p52减少，因此类似于Nfkb2号突变小鼠和之前描述的患者，其C末端错义突变损害NIK相互作用区域，以及无义和移码突变导致PTC(表2,图3) (13,26).

在单独的窗口中打开

图3

不同变体的表示NFKB2型这与疾病的颜色相关，并伴有不同的临床表现，包括NK细胞功能缺陷。

C末端患者NFKB2型突变，非规范NF-κB通路的缺陷总是损害B细胞功能，导致低丙种球蛋白血症和抗原特异性抗体反应差，在儿童早期表现为CVID(表2). 外周T细胞缺陷(12)自然杀伤（NK）细胞功能下降(15,18).

NK细胞对抗肿瘤和抗病毒防御至关重要，而主要免疫缺陷位于NK细胞（NK细胞缺陷）的原发性免疫缺陷的临床特征是由CMV、单纯疱疹病毒（HSV）、人乳头瘤病毒（HPV）、，水痘带状疱疹病毒（VVZ）和爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）(27). 六分之五的NK细胞缺陷与NK细胞成熟缺陷有关。

核因子-κB1在NK细胞成熟和效应器功能中起作用，核因子-kb B1单等位基因突变的患者存在功能性NK细胞缺陷，这些缺陷与主要由疱疹病毒家族的病毒（包括EBV、水痘带状疱疹病毒和CMV）感染的易感性相关(28). NF-κB2在NK细胞功能中的作用尚不明确，C末端突变患者的NK细胞异常功能似乎并不一致(图3). 到目前为止，它已经在两个先前发表的病例中得到证实，并在另外三名患者中被排除(15,18,29). 一些C末端患者NFKB2型突变表现为复发性唇疱疹和系统性CMV或EBV感染，但尚不清楚这些临床表现是否发生在功能性NK细胞缺陷的背景下，尽管一些患者的NK细胞数量较低(表2) (10,14,20). 与我们的发现类似，Lougaris等人描述了一名C末端患者NFKB2型突变和功能性NK细胞缺陷，其中NK细胞表型显示NK细胞成熟完整。与我们的观察结果相反，他们报告CD56上CD69的表达增加^昏暗的CD16型⁺NK细胞，表明其处于激活的稳定状态，但该患者的CMV和EBV病毒状态可能对这些标记物的表达产生影响，尚未见报道(18). 在健康受试者中，巨细胞病毒感染导致NKG2C扩增⁺NK细胞(30); 有趣的是，我们没有观察到NKG2C的扩张⁺或CD57⁺尽管慢性巨细胞病毒感染，但患者的NK细胞亚群。

尽管在我们的患者中发现NK细胞数量正常，但细胞毒性NK细胞缺陷是一致的，并且可能导致她对侵袭性CMV感染的易感性，同时进一步表明NF-κB2在NK细胞细胞毒活性中可能起作用。功能性NK细胞缺陷的一个可能解释是未处理的p100在细胞质中积聚，可能会损害典型的NF-κB通路，但需要进一步研究以确定NF-κ的B2缺陷可能影响NK细胞发育、活化和功能的机制。NIK缺乏患者的NK细胞异常先前提出了这个问题，但这些患者的典型和非典型NF-κB活化都有缺陷(31). 在我们的患者中发现功能性T细胞异常，即PHA增殖减少和CD8减少⁺CD45RO⁺记忆细胞与之前报道的一名患者的描述类似(12). 我们没有进行进一步的T细胞功能研究，目前尚不清楚这些T细胞异常是否是该病的一致特征。很可能T细胞和NK细胞的异常都导致了该患者的巨细胞病毒感染。在我们的患者中没有检测到抗细胞因子抗体，但在发生突变的患者中也有描述NFKB2型，这些可能直接作用于1型干扰素，也有助于抗病毒免疫受损(32).

患者的结局和并发症NFKB2型NK细胞发生或未发生功能紊乱的突变尚未进行比较。重要的是，该病例突出了包括巨细胞病毒在内的侵袭性病毒感染在该疾病中的风险，并表明功能性NK缺乏可能在这种易感性中发挥作用，并导致严重并发症。我们建议对所有非规范NF-κB途径发生突变的患者进行NK细胞功能评估。在NK功能受到影响的情况下，尽管NF-κB2的表达并不局限于造血细胞，但造血干细胞移植可能是合适的，因为一旦CMV感染定居，就很难清除，因此减少了未来成功干细胞移植的机会。

内分泌表现更为多变，临床上明显的ACTH缺乏表现约占三分之二的病例，通常是垂体功能减退的一种孤立形式。然而，生长激素（GH）缺乏和甲状腺功能减退也有描述(15). 脱发、甲沟炎和银屑病性皮炎也是疾病相关特征。内分泌和皮肤表现都被认为是自身免疫介导的，因为NF-κB2已被证明通过Aire依赖性途径在中枢耐受以及调节T细胞稳态和抑制功能中发挥作用(15,17,33,34). 这些自身免疫性表现的器官特异性的潜在机制尚未完全阐明。

只有一名患者患有NFKB2型此前有报道称，该突变与一种与CMV感染无关的良性肾病综合征有关(15). 我们患者的肾病综合征严重，免疫抑制治疗无效。这是第一次NFKB2型变异体表现为长期肾病。这种表现的确切触发因素尚不清楚。有趣的是，肾脏活检的CMV PCR呈阳性，她的肾病范围蛋白尿随血液CMV滴度波动。在巨细胞病毒感染期间，她的肾病综合征最严重，对治疗无效。CMV感染以前与肾病综合征有关(35–38)支持CMV在患者持续性蛋白尿中的作用。CVID患者描述的肾病综合征的其他可能原因是淀粉样变(39)和膜性肾病(40). 不能排除潜在的自身免疫过程，尤其是在NFKB2型然而，肾脏中缺乏自身抗体和免疫复合物沉积，这与这种可能性相矛盾。

总之，我们报告了一名在NFKB2型表现为早发性CVID、外胚层发育不良和脱发，患有功能性NK细胞缺陷，并死于巨细胞病毒感染和相关肾病综合征。

道德声明

本研究是根据贝勒医学院和附属医院机构审查委员会的建议进行的，所有受试者均书面同意。所有受试者均根据《赫尔辛基宣言》给予书面知情同意。该方案由贝勒医学院机构审查委员会批准。

作者贡献

AA和MP撰写了手稿。AV-H进行了实验并分析了数据。EM和LF监督NK细胞研究分析。AA、ML、AK和FC参与了患者的临床护理。ZC-A、SJ和IC执行并分析了ES结果。AR参与了样品分析和Sanger测序确认的协调工作。JL和JP监督基因组研究的数据解释。JL和JO参与了研究设计，并对手稿进行了批判性修改。所有作者都审阅了手稿。

致谢

笔记

内容完全由作者负责，不一定代表NIH的官方观点。

脚注

工具书类