1.简介
结直肠癌（CRC）是世界上癌症相关死亡率的第三大原因。1尽管最近在化疗选择（包括单克隆抗体治疗）方面取得了进展，但转移性CRC的预后仍然很差。在CRC的单克隆抗体疗法中，抗血管内皮生长因子（VEGF）和表皮生长因子受体（EGFR）的单克隆抗体在临床上是可用的。2,三虽然EGFR在一些正常组织中表达，但由于肿瘤组织的通透性和滞留作用增强，单克隆抗体可以优先在CRC肿瘤组织中积聚。4,5然而，由于EGFR在正常皮肤组织中高水平表达，皮肤毒性是常见的，即使治疗对患者有效，停止单克隆抗体治疗有时也是不可避免的。6,7在抗血管内皮生长因子单克隆抗体的情况下，一些接受单克隆抗体治疗的患者具有危及生命的副作用，包括严重出血和胃肠穿孔。8
在这种情况下，我们需要找到一种新的CRC特异性分子，并开发针对该分子的单克隆抗体，以便在治疗转移性CRC时产生有效的抗体疗法，且副作用最小。
为了找到CRC特异性分子，通常在CRC细胞和正常的对应物粘液上皮细胞之间进行综合表达分析。然而，在现实中，即使使用激光显微切割方法，获得纯活的正常粘膜上皮细胞也比获得CRC细胞更困难。我们已经报道了粪便中许多黏液上皮细胞脱落，其中一些含有完整的mRNA。9基于这些结果，我们先前开发了一种方法，在对健康受试者进行结肠镜检查后，从灌洗液中获得几乎纯的正常粘膜上皮细胞。然后，我们在纯黏液上皮细胞和CRC细胞系之间进行综合表达分析后，确定了几个新的CRC特异性分子。10TMEM180就是其中之一，是一种预测的11通路跨膜蛋白（UniProtKB，http://www.uniprot.org/uniprot/). 在本研究中，我们开发了一种针对TMEM180的单克隆抗体，并评估了将其用于CRC治疗的潜力。
2.材料和方法
2.1. 人体样本采集
在进行结肠镜检查时，从两名健康献血者身上获得了盐水粘膜清洗液中的人类脱落结肠细胞。细胞纯化和处理方法如前所述。10
实验方案和程序得到了日本国家癌症中心机构审查委员会的批准。所有方法均按照相关指南和法规进行。
2.2. 细胞和细胞培养
人结肠癌细胞系SW480、LoVo、DLD-1、HT-29、HCT116和Colo320以及造血细胞系K562、Ramos、RL和Raji购自ATCC。根据我们之前报告的方案，使用shRNA载体（MISSION TRC克隆TRC0000243137；Sigma‐Aldrich，St Louis，MO，USA）建立TMEM180基因敲除SW480细胞。11为了过度表达TMEM180基因，质粒pCMV‐TMEM180（OriGene，Rockville，MD，USA）根据制造商的协议，使用Lipofectamine LTX（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA。
使用WST‐8分析（CCK‐8；Dojindo，Tokyo，Japan）评估细胞的生长和存活。通过测量450 nm处的吸光度并使用微孔板阅读器（SpectraMax Paradigm；Molecular Devices，San Jose，CA，USA）评估反应信号。
为了评估细胞对缺氧的反应，DLD‐1和SW480细胞在DMEM（Wako Pure Chemical Industries，Osaka，Japan）中培养，DMEM补充有10%的FBS（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）和1%的青霉素-链霉素-两性霉素B混悬液（Wako-Pure Chemical Industries），在常压（37°C，5%CO）下培养2，21%O2)或缺氧（37°C，5%CO2，1%O2)条件。BIONIX2低氧细胞培养试剂盒（Sugiyama‐Gen Co.，Ltd.，Tokyo，Japan）也用于根据制造商的说明产生低氧条件。
2.3. DNA微阵列
使用来自结肠癌细胞或脱落结肠细胞的10μg总RNA和Affymetrix基因芯片人类基因组U133+2.0阵列进行DNA微阵列分析；根据标准Affymetrix协议进行分析。12在微阵列分析中，从芯片阵列中包含的38500个基因中选择了91个编码膜蛋白的基因，这些膜蛋白在CRC细胞中高度表达，但在健康供体的结肠细胞中没有表达。
2.4. 实时定量RT-PCR
如前所述，进行RNA提取和qRT-PCR。13PCR由10μL TaqMan快速通用PCR主混合物（赛默飞世尔科学公司）、1μL TaqMan引物/探针混合物（赛默飞世尔科学公司）和9μL模板cDNA组成，稀释至总体积20μL。实时PCR在Applied Biosystems 7500 Fast System（Thermo Fisher Scientific）中进行。使用比较Ct（阈值循环）方法对每个样品中的总RNA进行相对定量。每个基因的相对表达与GAPDH公司或ACTB公司.
2.5. 原位杂交
如前所述进行原位杂交。10
用4%多聚甲醛（PFA；Wako Pure Chemical Industries）固定人体组织的石蜡切片（Genostaff Co.，Ltd.，Tokyo，Japan）。用7μg/mL蛋白酶K（瑞士巴塞尔罗氏）处理后，用4%PFA重新固定切片，并用0.25%醋酸酐乙酰化。组织脱水后，用地高辛标记的RNA探针（TMEM180的475 bp片段，GeneBank登录号NM_024789，核苷酸位置1314-1789）进行杂交。清洗组织后，进行RNase处理。然后重新冲洗切片，并用0.5%封闭试剂（Roche）处理，然后用20%热灭活羊血清（Sigma‐Aldrich）处理。在与碱性磷酸酶（AP）结合的抗-DIG抗体（Roche）孵育2小时后，使用硝基蓝四氮唑和5溴-4氯-3’-吲哚磷酸（NBT/BCIP）溶液（罗氏）对切片进行可视化。
2.6. 抗体
利用骨髓瘤细胞（p3x63）和来自大鼠的淋巴结细胞，免疫TMEM180阳性肿瘤外泌体的重组人外周体（355‐400 aa，UniProtKB条目号Q14CX5），建立产生抗TMEM180单克隆抗体（mAbs）的杂交瘤细胞。使用羟基磷灰石和凝胶过滤（Superdex 200 pg；GE Healthcare，Tokyo，Japan）从DLD‐1‐OE细胞培养上清液中纯化TMEM180阳性肿瘤外泌体。最初，使用TMEM180的重组人外周体获得抗-TMEM180单克隆抗体（大鼠IgM）。用单克隆抗体ELISA确认TMEM180在外显子中的表达水平。最后，使用TMEM180阳性肿瘤外泌体获得抗-TMEM180单克隆抗体（大鼠IgM，克隆669）。将重链变量和轻链可变区cDNA人源化并克隆到人IgG1表达载体中。将载体转染到CHO细胞中（日本茨城Riken生物资源中心）。分离出一个稳定的克隆（人源化IgG，克隆669）。该程序是根据标准协议进行的。14
2.7. 外显子分离、免疫金电镜和ELISA
DLD‐1电池（6.8×106)放在一个15厘米的盘子里，隔夜生长。用PBS洗涤两次，耗尽补充FBS的培养基。然后用30 mL/皿的无血清培养基培养细胞24小时。在收集并通过0.22‐μm过滤器过滤后，获得了含胞外体的上清液。在每次实验中，使用蛋白酶抑制剂（Wako Pure Chemical Industries）将上清液保存在4°C。
对于免疫金电子显微镜，分离的外泌体通过支撑膜吸附在镍网格上。将抗-TMEM180 mAb、抗-CD9（安塞尔公司，明尼苏达州贝波特，美国）或CD63 mAb（安塞尔集团）添加到网格中，然后在室温下培养。用1%的BSA/PBS清洗格栅后，在室温下用金结合的山羊抗大鼠/小鼠IgG多克隆抗体（英国生物细胞国际有限公司，Crumlin，UK）培养格栅，并用1%的牛血清白蛋白/PBS清洗。戊二醛固定后，用2%磷钨酸溶液（pH 7.0）进行阴性染色。然后将样品干燥并用透射电子显微镜观察（JEM‐1400Plus；JEOL Ltd.，日本东京）。图像由CCD摄像机采集（VELETA；奥林巴斯软成像解决方案股份有限公司，德国穆斯特）。
对于夹心ELISA，将抗-TMEM 180单克隆抗体或抗-CD9单克隆抗体（安塞尔公司）作为捕获抗体涂布在96孔板上。将来自DLD‐1或K562细胞的分离外显体添加到每个板中，并在室温下培养1小时。清洗后，在室温下用HRP标记的抗-TMEM180单克隆抗体作为检测抗体孵育平板1小时。清洗后，使用Spectra-Max范式（美国加利福尼亚州圣何塞市分子器件公司）测量450 nm处的吸光度。
2.8. 免疫组织化学
人体标本购自BioChain Institute，Inc（美国加利福尼亚州纽瓦克）。如前所述进行免疫组织化学（IHC）。15使用过氧化物酶标记试剂盒-SH（Dojindo）用HRP标记抗-TMEM180抗体或抗-EGFR单克隆抗体（cetuximab，Merck，Darmstadt，Germany）。然后将组织与HRP偶联的抗TMEM180 mAb或抗EGFR mAb在室温下孵育1小时。用PBS清洗组织后，使用二氨基联苯胺（DAB）（Dako，Santa Clara，CA，USA）观察反应，并用苏木精对载玻片进行复染。
对于细胞染色，用4%的PFA/PBS固定培养细胞。用0.1%Triton X‐100/PBS渗透并用5%脱脂牛奶封闭后，用R‐藻红蛋白标记的抗‐TMEM180抗体（R‐Phycorythrin Labeling Kit‐SH（Dojindo）作为主要抗体对细胞进行染色。然后用与Alexa Fluor 488（1:200；Thermo Fisher Scientific）偶联的山羊抗鼠IgG抗体作为二级抗体和DAPI溶液孵育细胞，以进行核染色。使用BZ‐9000数字高清显微镜系统（Keyence Co.，Osaka，Japan）采集图像。使用ImageJ（NIH）分析至少1500个DAPI阳性细胞的TMEM180的荧光强度。代表性结果来自至少两个独立实验。
2.9. 蛋白质印迹
用含有20 mmol/L Tris‐HCl（pH 7.5）、150 mmol/L NaCl、0.1%SDS、1%Triton X‐100和cOmplete蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的缓冲液溶解细胞。将裂解液在95°C下煮沸5分钟，以使内源性蛋白酶变性和失活。使用SDS‐PAGE（4%‐15%Mini-PROTEAN TGX预制凝胶；Bio-Rad，Hercules，CA，USA）分离样品，并转移到PVDF膜（Bio‐Rad）上。用含有5%脱脂牛奶和0.1%吐温20（Sigma‐Aldrich）的TBS封闭膜。然后将印迹与抗缺氧诱导因子1‐α（抗HIF‐1α）（1:500；GeneTex，Inc.，Irvine，CA，USA）或β-actin（1:1000；Epitomics，Inc.，Burlingame，CA，US）抗体作为主要抗体在室温下孵育2小时或在4°C下过夜。用含有0.1%吐温20（TBS‐T）的TBS清洗膜三次，然后用HRP偶联的抗鼠抗体（1:1000；R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）或抗兔IgG（1:1000，Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA，USA。Can Get Signal解决方案（日本大阪丰田）用于降低背景噪音。用TBS‐T清洗膜后，使用ECL prime（GE Healthcare）观察蛋白质。使用ChemiDoc成像仪（Bio-Rad）采集图像。
2.10. 流式细胞术
按照上述方法进行流式细胞术。10体外培养的细胞用抗-TMEM180单克隆抗体（克隆669）作为第一抗体，用Alexa Fluor 488/647偶联抗鼠/人Ig多克隆抗体（Thermo Fisher Scientific）作为第二抗体进行染色。使用Guava easyCyte 10HT（美国马萨诸塞州伯灵顿市默克Millipore公司）或Aria流式细胞仪（美国新泽西州富兰克林湖市BD Biosciences）分析染色细胞。使用碘化丙啶（PI）（Thermo Fisher Scientific）染色的死细胞被排除在分析之外。使用FlowJo程序（Tree Star，Inc.，San Carlos，CA，USA）对数据进行分析。
2.11. 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性试验
51进行Cr释放以评估抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）活性。这里，5×106将DLD‐1、SW480或K562细胞在37°C下用3.7 MBq的51铬（100μCi）。
为了进行ADCC评估，细胞被放置在96孔板中，大小为1×105或1×104细胞/孔。将细胞暴露于抗-TMEM180单克隆抗体或抗-EGFR单克隆抗体中，以40倍于自然杀伤（NK）细胞（日本东京化学评估研究所）的数量作为效应靶比率，并用作效应细胞。
为了进行CDC评估，细胞被放置在96孔板中，大小为5×104细胞/孔。将细胞暴露于带有补体人类血清的抗-TMEM180单克隆抗体或抗-EGFR单克隆抗体（日本化学评估研究所）。
然后在37°C、5%CO下培养细胞2持续4小时。细胞毒性（%）=（[试样释放量-背景释放量]/[最大释放量-背景释放量]）×100。所有样品一式三份。
2.12. 动物模型和抗肿瘤活性
雌性BALB/c裸鼠（5周龄）购自Charles River Laboratories Japan Inc（日本神奈川）。
为了评估抗-TMEM180单克隆抗体的抗肿瘤活性，在小鼠侧面皮下接种5×106DLD‐1或SW480电池。每4天测量一次肿瘤肿块的长度（L）和宽度（W），并使用（L×W2）/2计算肿瘤体积。当平均肿瘤体积达到约100‐200 mm时三，将小鼠随机分为每组5只。第0天通过静脉注射给予PBS、抗-TMEM180单克隆抗体或抗-EGFR单克隆抗体西妥昔单抗。我们选择静脉注射是因为它在类似的抗体治疗实验中得到了很好的应用。16,17,18,19此外，正如其他参考文献中所述，20,21我们证实，静脉注射和静脉注射单抗在生物分布和肿瘤堆积方面没有明显差异（数据未显示）。
所有动物程序均按照国家癌症中心动物实验委员会制定的《实验动物护理和使用指南》进行。这些指南符合法律要求的道德标准，并符合日本实验动物使用指南。
2.14. TMEM180 KO小鼠的产生
使用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术生成TMEM180基因KO小鼠。27简言之，在小鼠外显子2引导RNA（gRNAs）TMEM180型使用CRISPRdirect设计ATG起始密码子下游的基因组。28在体外消化分析系统中选择了两种gRNAs[gS01（5′-AGCTGTGGTGTACGGCTCGTGG‐3′），gS03（5′-TGTTTCCTGCTGTACTGGG-3′）]29使用目标时间180PCR产品。这两个gRNA被插入英国广播公司px330质粒中的I限制性位点，并构建为px330‐TMEM180像素基因组编辑载体。
C57BL/6J（Clea Japan，Tokyo，Japan）的原核期卵子通过体外受精和注射1.67ng/μL制备px330‐TMEM180像素根据标准方案将DNA载体导入原核。30当天，注射的卵子被转移到假孕Jcl:MCH（Clea Japan）雌性的输卵管中。
通过剖宫产分别获得了来自gS01的2只存活小鼠和来自gS03的14只存活小鼠。通过PCR对小鼠尾部DNA进行基因分型[正向（5′-CTAATGGCACAGCAGC‐3′），反向（5′-CTAAACAGCAGCCCC‐3’）]，并使用正向引物对纯化的PCR产物进行测序。序列分析结果如表所示S1（第一阶段）.
2.15. 统计分析
使用Student’st吨ELISA数据检验，ANOVA比较肿瘤大小和体重，卡方检验。所有分析均使用SPSS软件版本20（IBM，Armonk，NY，USA）进行。
3.结果
3.1. 新型CRC标记TMEM180的鉴定与表征
我们之前开发了一种方法，在对健康受试者进行结肠镜检查后，使用带有抗EpCAM单克隆抗体的免疫珠从灌洗液中获得几乎纯的正常粘膜上皮细胞。10此外，之前的研究报告了一项全面的DNA微阵列分析，比较了CRC细胞系（SW480、LoVo、DLD-1、HT-29和HCT116）和正常粘膜上皮细胞。10我们重新分析了这些微阵列数据，发现TMEM180在五种CRC细胞系中高度表达，但在两名健康志愿者灌洗后获得的正常结肠细胞中没有表达（图A） ●●●●。作为首次验证，在定量RT-PCR（qPCR）分析中，TMEM180在CRC组织样本中高水平表达（图B） ●●●●。然后进行原位杂交（ISH）进行最终验证（图C、 D和图S1（第一阶段）). 所有这些方法都表明TMEM180是一种新的CRC标记物（图).
TMEM180作为结直肠癌特异性标记物的鉴定。A、，TMEM180型使用DNA微阵列分析评估了五个结直肠癌细胞系和两个健康供体结肠细胞样本的基因表达。B、，TMEM180型使用定量RT-PCR评估五个临床样本中的基因表达。肿瘤与正常组织比率的相对量化。C、 D，临床样本中TMEM180的原位杂交。箭头表示癌症（D）
3.2. 首次使用重组TMEM180肽生产抗-TMEM180抗体
为了评估TMEM180作为CRC诊断和/或治疗新靶点的潜力，我们尝试生产单克隆抗体。然而TMEM180型该基因预计编码一个具有有限胞外结构域表达的11通路跨膜蛋白。首先，我们用TMEM180蛋白的重组胞外结构域免疫大鼠，并获得IgM单克隆抗体。在评估过程中，我们意外地注意到，SW480和DLD‐1 CRC细胞的培养上清液中存在TMEM180蛋白。我们收集上清液，并对其进行羟基磷灰石和凝胶过滤色谱。我们发现空隙部分中存在高浓度的TMEM180蛋白（图S2系列A） ●●●●。
由于在培养上清液中检测到TMEM180，我们假设TMEM180与外泌体或其他细胞外微粒共存。为了测试TMEM180是否存在于肿瘤源性外泌体上，我们对富含CD9或CD63单克隆抗体的外泌体和TMEM180单克隆抗体进行了免疫电子显微镜检查。图像清楚地表明TMEM180存在于肿瘤外泌体上，类似于CD9和CD63（图S2系列B） ●●●●。在夹心ELISA中，检测到TMEM180阳性和CD9阳性外泌体（图S2系列C） ●●●●。我们得出结论，DLD‐1细胞释放的肿瘤外泌体含有TMEM180。
3.3. 利用TMEM180阳性外泌体二次生产抗TMEM180抗体并验证CRC特异性靶点
我们判断，纯化全长TMEM180蛋白，同时保持生成可识别活细胞的有用单克隆抗体所需的天然结构，将是最困难的步骤。此外，我们认为利用天然结构的抗原可以获得一些亲和力较高的单克隆抗体。因此，我们再次用从DLD‐1细胞上清液中纯化的TMEM180阳性肿瘤外泌体免疫大鼠。新获得的抗-TMEM180单克隆抗体（IgM，克隆669）能够识别大多数CRC细胞，但不能识别造血细胞（图第3章A、 B）。
然后，我们将大鼠IgM转化为人源化IgG1，以评估单克隆抗体的治疗应用潜力。首先，我们通过IHC检测了TMEM180在大肠癌和正常主要组织（结肠、皮肤、肝、脑、肾、肺和心脏）中的表达。Cetuximab（一种抗EGFR单抗）被用作参考，因为它目前广泛用于CRC患者。我们发现37例CRC组织中有9例（24.3%）TMEM180强阳性，43.2%（16/37）TMEM180-弱阳性。关于EGFR，37例CRC组织中有7例（18.9%）为交替EGFR强阳性，35.1%（13/37）为EGFR弱阳性。然而，TMEM180和EGFR的表达水平没有显著差异（图A、 B）。带有单克隆抗体的IHC在包括大脑、心脏、肺、肝脏、肾脏、结肠和皮肤在内的主要器官中未显示染色（图C） ●●●●。相反，使用西妥昔单抗的IHC在皮肤中显示出强阳性染色，在肝脏和结肠中显示出中度阳性染色，而在大脑、肾脏和肺中显示出弱阳性染色（图C） ●●●●。
TMEM180在大肠癌（CRC）和正常组织中的表达，A，大肠癌组织中TMEM180和表皮生长因子受体（EGFR）的典型免疫染色模式分为阴性（−）、弱阳性（+）和强阳性（++）。B、 显示了大肠癌组织中TMEM180或EGFR各表达水平（−）、（+）或（++）的病例数（总数37）。C、 免疫组织化学显示正常组织（结肠、大脑、心脏、肺、肝、肾和皮肤）中TMEM180或EGFR的表达。比例尺，100μm
根据一个数据库，TMEM180在mRNA水平上的表达不仅在正常器官中很低，而且在各自的癌组织中也很低（图S4系列A、 B）。然而，这些数据集中使用的临床样本将包含各种基质细胞，如成纤维细胞或血细胞。因此，数据库中使用的常规方法低估了TMEM180的表达水平。相比之下，我们独特的综合表达分析使用纯CRC细胞和无基质细胞的正常结肠细胞，可以提高TMEM180的表达水平，使其能够作为新的CRC标记物稳定检测。
3.4. TMEM180的图表和功能作用
TMEM180被归类为主要促化因子超家族，似乎起着阳离子转运体的作用（图A） ●●●●。为了解决TMEM180的功能作用，我们建立了两个TMEM180型基因敲除（KD）SW480细胞系：TMEM180蛋白表达最低的KD1细胞和TMEM180蛋白质表达中等的KD2细胞（图B） ●●●●。由于谷氨酰胺和精氨酸在肿瘤细胞中的利用率显著增加，我们研究了谷氨酰胺和精氨酸在阳离子-症状机制中的摄取。31,32我们发现SW480‐WT细胞能够在含有谷氨酰胺和精氨酸的无血清培养基中生长。相比之下，KD1和KD2不能在同一培养基中生长（图C） ●●●●。这些发现表明，TMEM180在肿瘤生长和增殖中对谷氨酰胺和精氨酸的摄取或代谢具有重要作用。
TMEM180的示意图和功能作用。A、 TMEM180作为阳离子转运体的示意图如图所示。B、 SW480野生型（WT）、基因敲除克隆1号（KD1）或基因敲除clone 2号（KD2）细胞的流式细胞术分析。显示了SW480‐WT、‐KD1和‐KD2细胞中TMEM180表达水平的差异。C、 SW480‐WT、‐KD1或‐KD2细胞在（i）谷氨酰胺（Gln）阳性（+）、精氨酸（Arg）（+）和血清（+）中的细胞生长；（ii）Gln（+）、Arg（+）和血清阴性（−）；（iii）谷氨酰胺（+）、精氨酸（-）和血清（-）；或（iv）Gln（−）、Arg（+）和血清（−
3.5. 抗TMEM180单克隆抗体在靶向抑制CRC肿瘤方面非常有效
抗-TMEM180单克隆抗体在体外对DLD-1和SW480细胞几乎没有直接的细胞毒性（图第5章A） ●●●●。接下来，我们评估了DLD‐1和SW480细胞中的ADCC和CDC。本研究中也使用了头孢西莫作为参考。抗TMEM180单克隆抗体在两种细胞系中似乎都有ADCC和CDC（图第5章B、 C）。
由于两种单抗的体外ADCC活性，我们评估了抗TMEM180单抗和西妥昔单抗在携带DLD-1或SW480异种移植物的小鼠体内的抗肿瘤活性。初步实验表明，西妥昔单抗在两种肿瘤异种移植物中均具有显著的抗肿瘤作用。在抗TMEM180单抗的情况下，DLD‐1异种移植物的抗肿瘤作用显著。引人注目的是，所有SW480异种移植物都被抗-TMEM180单克隆抗体彻底根除。然后，我们在携带DLD‐1或SW480异种移植物的小鼠中，每周两次注射25或12.5 mg/kg的剂量，共注射8次，以证实这些结果。在DLD‐1异种移植物小鼠中，与对照组相比，抗TMEM180单抗和西妥昔单抗均显示出显著的抗肿瘤作用（图A） ●●●●。在使用SW480异种移植物的小鼠中，西妥昔单抗在25 mg/kg时表现出显著的抗肿瘤作用，但在12.5 mg/kg时没有表现出明显的抗肿瘤效果。相反，抗-TMEM180 mAb诱导了显著的抗瘤作用，在25 mg/kg和12.5 mg/kg时消除了肿瘤（图A） ●●●●。五组患者在治疗相关体重减轻方面没有显著差异（图B） ●●●●。
抗-TMEM180抗体对结直肠癌肿瘤的抗肿瘤作用。A、 B，抗-TMEM180单抗对DLD-1（A）和SW480（B）异种移植模型的抗肿瘤活性。当肿瘤体积达到约200 mm时三，每个治疗开始（第0天）。以12.5或25 mg/kg的剂量给每组小鼠（n=5）静脉注射抗-TMEM180单克隆抗体（TMEM180）、抗表皮生长因子受体（EGFR）单克隆抗体西妥昔单抗或生理盐水（PBS）作为对照，每周两次，从第0天到第22天。箭头表示用药天数，曲线显示治疗对肿瘤大小的影响。P（P）<.001（SW480异种移植，PBS与TMEM180 12.5 mg/kg或25 mg/kg相比；EGFR 12.5 mg/kg/kg与TMEM18025 mg/kg比较），P（P）<.01（DLD‐1异种移植，PBS与EGFR 25 mg/kg、TMEM180 12.5 mg/kg或25 mg/kg相比；SW480异种移植、EGFR 25毫克/kg与TMEM180 125 mg/kg相比）。P（P）<.05（DLD‐1异种移植物，PBS与EGFR 12.5 mg/kg相比）。标准杆。C、 D，采用与A和B相同处理的相同小鼠的体重变化百分比。Bar，SD
3.6. 大肠癌细胞和组织中TMEM180表达的生物学特性
使用公共数据库分析TMEM180型基因，我们发现有10个缺氧反应元件共有序列22,23在基因中（图A） ●●●●。此外，缺氧条件下DLD‐1和SW480细胞中HIF‐1α表达升高（图B） ●●●●。因此，我们评估了相同治疗对TMEM180表达的影响。缺氧显著增加TMEM180型SW480细胞中的mRNA表达，DLD‐1细胞中的表达也趋于增加（图C） ●●●●。缺氧处理后，DLD‐1和SW480细胞中TMEM180的蛋白表达水平显著增加（图D、 E）。因此，TMEM180在CRC细胞中的表达受缺氧调节。
大肠癌（CRC）细胞中TMEM180的表达受缺氧控制。A、 中启动程序的模式TMEM180型基因。在启动子序列中发现了10个缺氧反应元件共有序列（HRE）。HRE由箭头指示。B、 缺氧诱导因子1α（HIF‐1α）的Western blotting。正常氧（21%O）条件下CRC细胞系DLD‐1和SW480中HIF‐1α蛋白表达水平的差异2)和缺氧（1%O2)如图所示。β-actin的表达被用作对照。C、 定量RT-PCRTMEM180型.不同之处TMEM180型DLD-1和SW480细胞在常氧（21%O）下的mRNA表达水平2)和缺氧（1%O2)如图所示**P（P） < .01. 标准杆。D、 E，TMEM180免疫染色。正常氧（21%O）下DLD‐1和SW480细胞中TMEM180表达模式的变化2)和缺氧（1%O2)如图所示（D）。比例尺，10μm。对数据进行了量化，如（E）所示***P（P） < .001. 条形，SD
4.讨论
在本研究中，我们利用我们的原始方法鉴定了一种新的CRC特异性分子TMEM180，9,10并成功建立了针对TMEM180的mAb，然后将其人源化。TMEM180的表达谱与EGFR的表达谱不同，TMEM180 mAb染色在正常组织中几乎不存在，与EGFR mAb染色不同。我们还发现，TMEM180的表达水平与其他现有标记物（如EGFR和CD44）在癌症中的表达水平一样高，而与正常组织中的其他分子水平相比，其表达水平极低（图S6系列). 因此，我们认为TMEM180的肿瘤特异性大大高于其他分子。
更重要的是，抗-TMEM180单抗在体外具有ADCC和CDC活性，在携带TMEM180阳性CRC细胞异种移植的小鼠体内具有显著的抗肿瘤活性。抗TMEM180单克隆抗体治疗与西妥昔单抗治疗一样抑制DLD-1肿瘤生长。令人惊讶的是，SW480肿瘤通过抗TMEM180单克隆抗体治疗而非西妥昔单抗治疗完全根除。这种显著的抗肿瘤效果目前正在评估中。
在进一步的实验中，我们发现TMEM180型该基因共有10个缺氧反应元件共有序列，可能是缺氧控制的HIF‐1α结合位点。22,23,33最近的研究表明，缺氧和化疗不仅会诱导HIF‐1α的表达，还会导致T细胞无能，并增加癌细胞的扩散。34HIF‐1α目前被认为是肿瘤干细胞功能的关键因素。在癌症组织中，与正常组织不同，与癌症引起的凝血引起的坏死相关的血管生成和缺氧在临床进展中交替重复。35,36,37然而，除CRC外，HIF‐1α在许多类型的癌症中上调。因此，CRC中的另一种转录因子可能与HIF‐1α一起调节TMEM180的表达。需要进一步的分子和翻译研究来阐明TMEM180的详细生物学作用及其靶向治疗的抗肿瘤机制。
在临床实践中，治疗性用药也应考虑药物的安全性。根据数据库，TMEM180型mRNA在正常组织中几乎不表达（图S4系列A） ●●●●。此外，与其他已知CRC标记物的表达相比，TMEM180在所有器官中的表达极低。在本研究中，IHC还显示，在所有研究的主要器官中没有TMEM180表达。最后，我们成功地获得了TMEM180型未显示胚胎、新生儿和出生后致死性的基因KO小鼠（表S1（第一阶段）). 根据这些数据，我们预计在抗TMEM180单抗的临床试验中不太可能出现不可预测的不良反应。
我们的单克隆抗体目前正在按照良好制造商规范原则进行处理，用于首次人体临床试验的测试。我们认为，在进入临床试验之前，有几个问题需要澄清。我们必须使用其他CRC细胞系和PDX肿瘤进一步研究抗肿瘤活性。我们将在TMEM180的功能分析方面取得进展，包括在获得F2代KO小鼠后作为阳离子转运蛋白参与谷氨酰胺和精氨酸代谢。我们希望未来的临床试验将验证单克隆抗体对CRC治疗的重要性。
