九种在肝癌组织中表现出可变表达的新型人类小GT酶的鉴定和鉴定

利用生物信息学方法选择和管理EST

从GenBank数据库中收集的RAB家族24个已知成员和ARF/SAR1家族9个已知成员的氨基酸序列分别进行了比对。每个家族中选择了两个高度保守的区域，然后使用这两个区域的一致序列用tBLASTn算法搜索EST数据库。如果EST与任一一致序列在80 bp以上具有至少40%的同源性，则认为同源性有意义。然后使用选定的EST，使用BLASTn算法搜索GenBank中的非冗余分割。选择那些与已知基因的DNA序列至少150 bp具有50-95%同源性的基因。然后将重叠的EST整合到contigs中，然后使用contigs再次搜索GenBank中的EST分区，以扩展5′端和3′端。

cDNA克隆

为了确认EST连接的序列，根据连接中假定ORF的侧翼序列合成了特异性引物(表1)对人cDNA文库（Clontech）进行PCR扩增。PCR系统为：在含有2.5μl 10×PCR缓冲液、0.5μl 0.02 mol/l dNTPs、0.75μl 2.5×10的25μl体积混合物中扩增1μl模板⁻³摩尔/升氯化镁₂，和1个单位的Taq聚合酶（Promega）和0.5μl的2.5×10⁻²每种特定底漆的摩尔/升。PCR条件为94°C下初始变性步骤5分钟，然后在94°C条件下29个周期1分钟，在58–62°C下30秒，在72°C下额外延长步骤10分钟后，通过在4°C下培养终止反应。PCR产物纯化并直接测序后，将扩增片段重组到载体pGEM-T并转化为大肠杆菌JM109。从每种转化克隆中选择4个阳性克隆，提取质粒并用载体臂引物F进行测序₂（5′-CGCAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3′）和R2（5′-TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C-3′。

北方杂交

小GTPase的基因特异性PCR片段用[α-³²P] 用随机引物试剂盒（Amershan）将携带16种人类组织mRNA的MTN膜（Clontech）与携带12例中国HCC或CH患者总RNA的尼龙膜杂交。将膜在42°C的杂交/预杂交溶液（50%甲酰胺，5×SSPE，10×Denhardt溶液，2%十二烷基硫酸钠，100 mg/L小牛胸腺DNA）中预杂交24 h，然后与标记探针杂交另24 h，在杂交箱（英国Hybaid）中连续摇晃。然后在42℃的洗涤液（2×SSC，0.1%十二烷基硫酸钠；0.5×SSC（0.1%十二烷基苯磺酸钠）中对膜进行三次有序洗涤，然后在−70℃的X射线胶片下暴露5天。作为对照，MTN I和MTN II也在上述相同条件下与2.0 kbβ-actin cDNA杂交。杂交后，用增感屏在−80°C的X射线胶片上曝光4 h。用GDS-800（Bio-RAD）和Annustatin Grabber-1 T2.51扫描仪软件以及UVP Gelworks ID Advanced Version 2.51分析软件扫描放射自显影的杂交带。以总RNA电泳或β-肌动蛋白的结果作为对照，并进行类似扫描。

cDNA表达水平与总RNA水平或β-肌动蛋白标准化。

九种小GTPase的克隆及命名

随后，用基因特异性引物进行PCR扩增，证实了9个连续基因ORF的可靠性(表2)和直接测序。ORF的核苷酸和推导出的氨基酸序列与已知的RAB或ARF/SAR1家族成员具有同源性，与上述两种共识探针对应的区域显示出高度同源性(图2). 因此，这九个新的cDNA被保存在Gen-Bank数据库中，并分别指定为RAB1B、RAB4B、RAB10、RAB22A、RAB24、RAB25、ARL5、SARA1、，和SARA2标准根据HUGO命名委员会在哺乳动物中的同源基因。

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图2

小GTPase保守区域的表示。与使用的两个一致序列相对应的区域如（A，RAB亚家族）和（B，ARF/Sar1亚家族）所示。每个图中的上部车道显示了亚科的两个一致序列。较低的车道显示了两个亚家族的新型小GTP的排列。蛋白质的高度保守的残基显示在黑色阴影框中，类似的残基则显示在灰色阴影框中。（C） 示意图显示了九个小GTPase中的保守结构域。

氨基酸序列分析

除了序列相似性外，在所有推导的蛋白质中还发现了其他一些序列特征。推导的蛋白质均包含四个高度保守的GTPase基序，即Gl[GxxxxGK（S/T）]、G2（T）、G3（DxxG）和G4[（N/T）（K/Q）xD](图2B). G1基序形成一个环，其中氨基酸的主链酰胺氢和赖氨酸的e氨基与GDP和GTP的α-和β-磷酸盐相互作用。此外，Gl中的丝氨酸/苏氨酸与Mg相互作用²⁺离子，与GTP的β-和γ-磷酸盐的氧配位，并与基序G2中高度保守的苏氨酸相互作用，通过H₂0分子，基序G3中有一个不变的天冬氨酸。G4基序与鸟嘌呤核苷酸环相互作用。因此，所有四个基序对鸟嘌呤·核苷酸结合和水解都至关重要(3,4,19,24,25).

大多数RAB蛋白在以下C末端序列基序之一中包含两个相邻的半胱氨酸残基：-XXCC、-XCXC或-CCXX，它们可以通过独特的RAB特异性香叶基香叶基转移酶进行香叶基化(9). RAB1B、RAB4B和RAB10也具有此结构特征。然而，人RAB24的香叶基香叶基化可能是低效的，因为它与小鼠RAB24共享相同的C末端，而小鼠RAB24被报道为低效的香叶基香叶基化，这可能部分是由于靶半胱氨酸远端存在两个组氨酸(8). 与常见的C末端序列基序不同，RAB22A和RAB25具有非常规的C末端（分别为-CCISL和-CCISL）。

与大多数其他小GTPase家族不同，ARF和SAR蛋白没有翻译后的戊基修饰。ARL5、SARA1或SARA2的C末端没有半胱氨酸。相反，他们的C末端部分被发现与ARF（[HRQT]-x-[FYWI]-x-[LIVM]-x（4）-A-x（2）-G-x（2）-[LIVM]-x（2）-[GSA]-[LIVMF]-x-[WK]-[LIVM]）和SAR1（R-x-[LIVM]-E-V-F-M-C-S-[LIVM]（2）-x-[KRQ]-x-G-Y-x-E-[AG]-[FI]-x-W-[LIVM]-x-Q-Y）亚家族的一致特征模式相匹配分别为S。相应的段是H¹⁵⁰QWHIQACCALTGEGLGLEWM公司¹⁷²在ARL5、R中¹⁷¹请注意MCSVLKRQGYGEGFRWMAQY¹⁹⁶在SARA1和R中¹⁷¹设备管理系统¹⁹⁶在SARA2中。

肝癌组织中GTPases表达水平的改变

最近的研究认为内吞蛋白与癌症之间存在潜在联系(2). 考虑到RAB和ARF/SAR家族成员在中国膀胱交通和肝癌高发中的关键作用，我们测定了9个小GTPase在肝癌转录水平的表达变化(表3,图3). [α-³²P] 用dATP标记的基因特异性探针杂交尼龙膜，将从肿瘤及邻近正常组织中提取的总RNA样本进行杂交。基因的表达水平通过电泳带的密度标准化，因为据报道β-肌动蛋白在肝癌中过度表达(5). 在每种情况下，小GTPase在肝癌中的过度表达被定义为在邻近正常组织中的表达水平超过1.5倍。肿瘤样本中大多数小GTPase的表达上调或保持不变。这些基因包括RAB1B型（9/11例中过度表达），RAB4B型(4/11),RAB10型(8/11),RAB22A型(7/10),RAB24型（9/11），以及ARL5型(5/11). 值得一提的是，尽管某些基因的过度表达在少数情况下似乎是有限的，但这在很大程度上是由于我们制定了严格的标准。事实上，在几乎所有的肿瘤病例中，所有七个基因都以不同的数量上调，当用t吨-测试(第页=0.01). 然而，小GTPase的过度表达似乎与病例的病理分级无关，如肿瘤大小、AFP值或坏死。它可能反映了癌症的病理要求，例如细胞的快速无限生长。值得注意的是，RAB1B、RAB24、，和SARA1标准在11例癌症病例中有9例过度表达，这表明这些基因可能是HCC的标志物。

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图3

九种小GTPase在肝癌中的表达变化。每张图显示了三例人类肝癌病例（HCC01–HCC03）和一例胆管肝癌病例（CH）的Northern杂交结果，其基因特异性cDNA探针标记为1至9。N： 正常周围组织，T：肿瘤组织。从组织中提取的总RNA的电泳图用作对照。

两个例外是SARA2标准和RAB25.萨拉23例下调（肿瘤/正常密度比<0.67），1例上调，其余均保持不变。尽管目前我们未能确定其表达水平与病例病理背景之间的任何关系SARA2标准可能反映出案件之间的深层差异，需要进一步调查。至于RAB25型，在胆管肝癌中高表达，但在肿瘤性肝样本中下调。因此，研究是否在槽口25和胆管肝癌。

小GTPase的组织表达模式

以往的研究表明，大多数小GTPase广泛分布于正常人体组织中。然而，一些组织特异性或细胞类型特异性RAB已经被鉴定出来，通常在高分化细胞中，因此确定本文报道的小GTP酶的组织表达模式是有意义的。使用上述相同探针在MTN膜上进行北方杂交(图4A). 这些基因的表达水平通过β-肌动蛋白进行了标准化，并以图表形式显示出来(图4B). 在所有九个北方杂交中观察到两个不同长度的转录本，这是小GTPase家族成员常见的现象。结果还表明RAB1B、RAB4B、RAB10、RAB22A、ARL5、和SARA2标准在几乎所有被检测的16个组织中都有广泛表达，尽管表达量不同。

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图4

九种小GTPase在成人组织中的北方杂交。同位素标记探针用于杂交MTN膜。每条通道包含2μg聚（A）⁺从成人人体组织中分离出的RNA。以人β-肌动蛋白cDNA为对照探针，对同一膜进行杂交。（A） Northern杂交的放射自显影结果。每个通道中的表达水平用β-actin标准化，并在（B）中图示。

与那些广泛表达的基因不同RAB24型胰腺、心脏和外周血白细胞含量高。的表达式RAB25型仅在胎盘、肺、肾、胰腺、前列腺、小肠和结肠中检测到。有趣的是，尽管SARA1标准和SARA2标准在氨基酸水平上具有较高的序列相似性（89.4%），它们的表达模式不同。萨拉2普遍表达，而SARA1标准仅在心脏、肝脏、骨骼肌和睾丸中中度表达，在其他组织中表达极低。这一事实表明了它们在不同组织中的不同作用。组织特异性分布RAB24、RAB25、和SARA1标准提示这些蛋白质不仅参与囊泡运输的不同步骤，而且在各种组织中发挥特定作用。

感谢江苏省启东市肝癌研究所朱元荣博士、黄建华博士、徐炳华博士、袁爱军博士和黄兴华博士在本研究中提供肿瘤样本。这项工作得到了国家973计划、863高技术计划（863-Z-02-04-01）和国家科学基金（3952501539680019）的支持。