纳米医学。作者手稿；2019年4月1日PMC提供。
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PMCID公司：PMC5899013
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院933617
吲哚青绿载玻尿酸衍生纳米粒用于胰腺癌荧光增强手术成像
，理学硕士，1 、理学学士、，2 、理学学士、，2 、理学学士、，1 ，博士，1 、医学博士、博士，三 ，医学博士，4,5 、医学博士、博士，6,7 ，博士，2,5和，博士1,5,8,*
鲍文奇（Bowen Qi）
1美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心药学系，邮编68198
Ayrianne J.克劳福德
2美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心Eppley癌症及相关疾病研究所，邮编68198
尼古拉斯·沃伊丁内克
2美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心Eppley癌症及相关疾病研究所，邮编68198
梅根·B·霍姆斯
1美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心药学系，邮编68198
约书亚·J·苏切克
1美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心药学系，邮编68198
格拉卡·阿尔梅达·波拉达
三美国北卡罗来纳州温斯顿塞勒姆威克森林大学健康科学学院威克森林再生医学研究所，邮编：27157
Quan P.Ly先生
4美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心外科68198
5美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心弗雷德·巴菲特癌症中心，邮编68198
塞缪尔·科恩
6美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心病理学和微生物学系，邮编68198
7美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心Havlik-Wall肿瘤学教授68198
迈克尔·霍林斯沃思
2美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心Eppley癌症及相关疾病研究所，邮编68198
5美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心弗雷德·巴菲特癌症中心，邮编68198
亚伦·M·莫斯
1美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心药学系，邮编68198
5美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心弗雷德·巴菲特癌症中心，邮编68198
8美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心生物化学和分子生物学系，邮编68198
1美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心药学系，邮编68198
2美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心Eppley癌症及相关疾病研究所，邮编68198
三美国北卡罗来纳州温斯顿塞勒姆威克森林大学健康科学学院威克森林再生医学研究所，邮编：27157
4美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心外科68198
5美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心弗雷德·巴菲特癌症中心，邮编68198
6美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心病理学和微生物学系，邮编68198
7美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心Havlik-Wall肿瘤学教授68198
8美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心生物化学和分子生物学系，邮编68198
*通信地址：内布拉斯加州大学医学中心药学系Aaron M.Mohs博士，地址：5-12315 Scott Research Tower，Fred and Pamela Buffett Cancer Center，Omaha，NE 68198-6858，ude.cmnu@shom.noraa - 补充资料
补充。
GUID:840474ED-2E20-4F14-8BE1-DCBDDB1C13F3
摘要
胰腺导管腺癌具有极高的致死性，手术切除是该病唯一潜在的治疗方法。在这项研究中，透明质酸衍生的具有物理化学包埋吲哚菁绿的纳米颗粒，称为NanoICG，用于胰腺癌的术中近红外荧光检测。NanoICG对健康胰腺上皮细胞没有细胞毒性，也没有诱导趋化或吞噬作用，在原位胰腺导管腺癌模型中，它在胰腺内显著积聚，并显示胰腺病变相对于胰腺非病变部分的对比度增强。荧光显微镜显示，与单独使用ICG相比，NanoICG在胰腺病变和脾转移中的荧光强度更高。这个体内NanoICG的安全性，包括NanoICG-治疗的健康小鼠的生化、血液学和病理学分析，表明其毒性可以忽略不计。这些结果表明，NanoICG是一种很有前景的胰腺肿瘤术中检测对比剂。
关键词：胰腺导管腺癌、透明质酸、吲哚青绿、荧光图像引导手术、脾转移
图形摘要
在手术导航和体外分析过程中，使用透明质酸纳米制剂吲哚青绿（NanoICG）造影增强胰腺导管腺癌（PDAC）。与邻近的健康胰腺相比，同基因原位PDAC的强化程度明显高于肿瘤单独ICG的强化程度。
介绍
胰腺导管腺癌（PDAC）由于诊断为晚期，具有高度致死性，中位总生存期为15个月，5年生存率为13%。[1]早期发现和手术切除可将5年生存率提高至31.7±3.6个月。[2]增强对比度可以帮助外科医生确认疑似胰腺肿块并阐明阳性边缘。[三]因此，改进肿瘤成像技术，更好地识别癌性病变，对于提高PDAC的完全切除率和随后的生存率至关重要。目前，通过肉眼检查和触诊进行肿瘤定位和疾病扩展评估[4]这可能导致不完全切除或不必要地切除健康组织。使用肿瘤特异性造影剂，图像引导手术有助于实时、术中和视觉识别胰腺肿瘤，提高对恶性组织和正常组织的辨别能力。[5]
临床上可用的术前成像方式，如计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描（PET），对手术计划至关重要。然而，由于身体位置的改变、组织操作以及缺乏检测微观病变的敏感性，将这些结果转化到手术室是困难的。[6]因此，需要一种高精度和高灵敏度的术中成像技术来填补术前和术中现实之间的差距。目前用于评估术中胰腺肿瘤扩展的技术，如超声检查（US）和术中冰冻切片分析（IFSC），存在局限性。在胰腺癌手术期间，需要丰富的经验来生成和解释有用的美国图像。[6]尽管IFSC在确保阴性边缘方面很有用，但在检查胰腺病变时，它的阴性预测值为50%，这可能导致组织学诊断和可切除性判定较差。[7]
荧光成像为术中发现胰腺癌提供了一种潜在的方法，以最大限度地切除恶性组织。荧光图像引导手术（FIGS）可以以高灵敏度和空间分辨率检测荧光造影剂，从而最大限度地减少造影剂剂量，并允许实时确定组织状态。[8,9]例如，AlexaFluor488结合CA19-9抗体用于在手术导航期间检测胰腺癌的原发肿瘤和脾、肝转移。[10]此外，近红外（NIR）FIGS可以将组织自身荧光、散射和吸收引起的干扰降至最低，从而可以相对深入地检测对比剂。[11,12]梅蒂迪等。在原位人类异种移植小鼠模型中，证实了MMP-2和MMP-9可切割肽结合Cy7用于FIGS准确标记胰腺肿瘤，这与标准强光下的切除手术相比，转移负担更低，远处复发率更低。[13]杨等。使用经尿激酶纤溶酶原激活剂（uPA）的Cy5.5偶联ATF（氨基末端片段）修饰的磁性氧化铁纳米粒子进行胰腺癌病变的手术检测。[14]荧光结合的单克隆抗体探针用于胰腺癌动物模型中，具有更高的特异性，但其效力受到天然存在的细胞靶点的限制，这些靶点通常在肿瘤中异质表达，与背景信号相比可能丰度较低。[15]因此，更通用的NIR荧光（NIRF）探针可能有潜力用于NIR FIGS，以减少PDAC肿瘤负担。
在这里，我们报告了透明质酸（HA）ICG纳米制剂（称为纳米ICG）在胰腺癌原位同基因模型中用于肿瘤检测的应用。ICG是一种FDA批准的NIR荧光团，可通过多达8毫米的组织进行检测。[16–18]另一方面，HA是细胞外基质的主要成分，参与细胞增殖、伤口愈合和癌症转移。[19]HA具有可修饰的化学基团，如羧酸盐、N-乙酰氨基葡萄糖、羟基和乙酰基部分，可用于化学偶联。[20,21]最近，我们报道，与MDA-MB-231异种移植中的ICG相比，NanoICG使NIR肿瘤信号增加了2.28倍和2.25倍[22]和4T1同源原位[17]乳腺肿瘤模型，显示了敏感肿瘤检测的潜力。在本研究中，在同基因原位模型中，将NanoICG与ICG作为NIR FIGS对比剂，用于术中胰腺癌的检测和增强。来自的结果在体外和体内研究表明，NanoICG是一种安全的造影剂，可能用于胰腺肿瘤检测和手术切除。
方法
材料
ICG、鲁米诺和酵母多糖A购自西格玛阿尔德里奇（密苏里州圣路易斯）。10kDa–20kDa透明质酸钠购自Lifecore Biomedical（明尼苏达州查斯卡）。HPNE细胞系由内布拉斯加州大学医学中心的Michel J.Ouellette博士提供，而KPC细胞系由Hollingsworth博士共享。HL-60细胞购自ATCC（弗吉尼亚州马纳萨斯）。HPNE细胞在70%DMEM中培养，培养基为25%M3、5%FBS、20 ng/mL人重组EGF、1%青霉素/链霉素；KPC细胞在含有10%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM中生长，HL-60在含有20%FBS的IMDM中维持。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）购自Dojindo Molecular Technologies Inc.（Rockville，MD）。Calcein AM从Invitrogen（加利福尼亚州卡尔斯巴德）购买。从Jackson Laboratories（ME Bar Harbor）购买10周龄雌性C57BL/6J小鼠。5.0铬肠线和5.0尼龙外科缝线购自强生公司（新泽西州萨默维尔）。综合诊断剖面试剂转子购自阿巴克西斯（加利福尼亚州联合市）。所有其他化学品都是按分析级购买和使用的。
纳米ICG的制备与表征
在文献的基础上，进行了两亲性HA-氨基丙基-1-芘丁酰胺（HA-PBA）的合成、在HA-PBA自组装过程中通过ICG的包封制备纳米ICG以及纳米ICG中ICG的定量。[17,22]使用Zetasizer Nano仪器（Malvern，Worcestershire，UK）测定NanoICG的平均流体动力学直径和ζ电位。以0.34 mg/mL的浓度制备纳米ICG用于尺寸测定，以0.06 mg/mL的速度制备纳米IC G用于测定紫外可见吸收和荧光发射。使用Evolution 220分光光度计（美国威斯康星州麦迪逊Thermo Fisher Scientific）扫描吸收光谱（600–900 nm），使用FluoroMax-4分光荧光计（美国新泽西州爱迪生Horiba）量化ICG、NanoICG和分解的NanoICG的荧光强度。
细胞毒性
使用CCK-8试验（Dojindo；Rockville，MD）测试NanoICG和空NP（自组装HA-PBA）的细胞毒性。将HPNE和KPC细胞以25000个细胞/孔的密度接种在96周板中，并允许其粘附24小时。将空NP和NanoICG溶解在不同浓度（0、0.01、0.05、0.1 mg/mL）的DMEM中，并向每个孔中添加200μL。将细胞处理24 h并用PBS洗涤两次。然后，向每个孔中添加100μL DMEM中的10%CCK-8试剂，并在37°C下培养。50分钟后，使用Synergy HTX多模平板读取器（BioTek，Winooski，VT，USA）在450 nm处测量每个孔的吸光度。相对存活率计算为处理细胞的微孔吸光度除以未处理细胞的孔吸光度。
趋化作用
趋化性分析采用美国国家癌症研究所纳米技术表征实验室（NCL）的程序(https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols网站)：ITA-8。简而言之，HL-60细胞悬浮在无血清IMDM（SM）中，并在使用前培养过夜。1×106将活细胞/mL（由台盼蓝测定）分散在带有3μm聚碳酸酯膜（德国默克米利浦）的多屏幕过滤板上，每孔50000个细胞。将试样（150μL）添加到进料盘中。轻轻组装滤板和进料盘并孵育4小时。孵育后，将Calcein AM（CAM）工作溶液添加到适当的孔中并孵养1小时。然后将溶液转移到光学底板（美国纽约州罗切斯特的Thermo Fisher Scientific公司）在485nm激发/535nm发射的荧光板阅读器上。趋化性增加倍数计算如下：
其中，FU的平均值SM/CAM公司=用SM和CAM处理的HL-60的荧光单位，平均FUSM/PBS公司=经SM和PBS处理的HL-60的荧光单位，以及平均FUTS/CAM公司=用测试样品和CAM处理的HL-60的荧光单位。
ICG和NanoICG的理论血浆浓度（TPC）是根据给小鼠的剂量计算的。[23]计算公式采用NCL方法ITA-8。空NP的TPC基于NanoICG中HA基质的质量比。ICG的10×TPC、1×TPC、1/5×TPC和1/25×TPC的浓度分别为5.1μM、0.51μM、0.10μM和0.02μM；NanoICG的10×TPC、1×TPC，1/5×TPC和1/25×TPC的浓度分别为38μg/mL、3.8μg/mL，0.76μg/mL和0.15μg/mL。吞噬试验中使用相同的浓度。
吞噬作用
根据NCL ITA-9评估吞噬作用。将多模读取器和96 well板预热至37°C。HL-60细胞浓度调整为1×107活细胞/mL（用台盼蓝测定）和完全培养基。每孔加入100μL细胞悬浮液。将100μL对照品或测试样品添加到预热的孔中，然后添加100μL鲁米诺工作溶液（PBS中250μM）。通过用20%混合的正常人AB血清（Innovative Research，Novi，MI，USA）在PBS中重组酵母菌聚糖A，使其浓度达到2 mg/mL，制备阳性对照。混合后，在样品孔中添加100μL细胞悬浮液，并彻底混合。动态读数过程为1.5小时，读数间隔为2.1分钟。计算每个孔的每个动力学读数曲线的曲线下面积（AUC）作为吞噬潜能。
肿瘤模型诱导
所有动物研究都是根据经批准的联合国排雷行动中心机构动物护理和使用委员会协议进行的，并按照《科学用途动物护理和利用指南》中的机构指南遵循程序。这些指导方针被遵守，以确保对动物的人道关怀。为了临床前评估ICG和NanoICG对胰腺癌的增强作用，选用成熟的C57BL/6小鼠进行原位肿瘤挑战，使用10000 LSL-KrasG12D系列/+;LSL-Trp53172H兰特/+;每只小鼠的Pdx-1Core（KPC）衍生PDAC同基因细胞。如前所述[24]麻醉后，在臀部和肋骨之间的腹部皮肤和腹膜上开一个大约5毫米的切口。这样可以将脾脏取出，将PBS细胞悬液注射到胰腺体内。然后分别使用内部可溶解的铬肠线和5.0尼龙外科缝线固定腹膜和皮肤。在恢复过程中对动物进行取暖、补水和监测。在引入肿瘤细胞后的两周内，在所有受到攻击的小鼠中均检测到可触及的肿瘤。
近红外荧光成像
将80μL超纯水中的ICG（每只小鼠10 nmol）或NanoICG（每个小鼠10 nmolICG）通过尾静脉静脉注射到小鼠体内(n个=每组5只小鼠）。注射后24小时对小鼠实施安乐死。在成像之前，移除肝脏和脾脏，以最小化因肝胆清除而产生的强ICG荧光，并评估ICG和NanoICG区分胰腺肿瘤和健康胰腺的能力。使用定制的FIGS系统检测胰腺肿瘤中ICG和NanoICG的对比度增强。成像系统利用手持式光纤耦合光谱单元，该单元激发ICG并收集波长分辨的近红外发射（DeltaNu；美国怀俄明州拉腊米）。分光镜单元还用作实时宽场成像系统（Spectropath；美国佐治亚州亚特兰大）的激发源，该系统融合了近红外通道（800–950 nm）和可见彩色通道，用于近红外信号的空间定向。这些系统的总体设计和集成此前已有报道。[25,26]在785 nm处使用80 mW的激光功率进行波长分辨率（800–950 nm）和宽场成像。
在FIGS之后，所有小鼠都进行了尸检。胰腺被切除整体为了保持原发组织、间质组织和健康组织的解剖完整性，以便进行荧光成像和组织切片。解剖器官在Pearl Trilogy小动物成像系统（LI-COR Biosciences，Lincoln，NE，USA）上成像。使用800 nm通道收集每个器官的荧光强度，并使用Image Studio 5.0版软件（LI-COR Biosciences，Lincoln，NE，USA）进行分析。每个器官的外围被随意确定以定义感兴趣区域（ROI）。平均像素强度用于计算信噪比（SNR），信噪比由ROI/背景ROI标准偏差中每个像素的平均组织强度定义。使用ImageJ 1.49v软件（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）分析代表性胰腺的荧光强度图。为了与手术期间获得的每个胰腺的光谱分析进行比较，在整个胰腺成像后，沿胰腺纵向绘制一条直线，以包括尽可能多的采集点。沿线的NIR荧光强度用打印纵断面ImageJ中的函数。
组织学分析
转移性肿瘤组织和器官被包埋在OCT贴装介质凝胶中，并在液氮中快速冷冻。对胰腺组织进行定位，以获得疾病胰腺和健康胰腺的最大足迹。使用Cryostat（Leica Biosciences，Buffalo Grove，IL，USA）以8μm的厚度切割这些样品。每只小鼠的切片用苏木精和伊红（H&E）染色，或不染色用于NIR荧光显微镜。使用带有氙激发源的IX73倒置显微镜对代表性载玻片进行成像，并使用DP80数字相机进行拍摄，并通过CellSens Dimension 1.13软件（均来自日本奥林巴斯）进行显示。H&E染色的载玻片用亮场滤光片进行可视化和成像，未染色载玻片则用FITC滤光片立方体进行自体荧光成像，NIR荧光用ICG滤光片立方进行成像。在所有样品中，ICG和NanoICG的暴露时间是恒定的。
体内毒理学
为了评估NanoICG的全身毒性，将15只成熟C57BL/6J小鼠分为溶媒对照组、低剂量组（相当于每只小鼠10 nmol ICG）和高剂量组（等同于每只鼠51.6 nmol ICG）（每组5只小鼠）。根据FDA推荐的ICG上限剂量计算高剂量。对小鼠进行相应的治疗静脉注射.注入。注射72小时后，将全血收集到肝素锂涂层采血管（BD Vacutainer，Franklin Lakes，NJ，USA）和K2心脏穿刺EDTA涂层采血管（BD Microtainer，美国新泽西州富兰克林湖）。血样的综合诊断曲线由化学分析仪（美国加利福尼亚州联合市Abaxis）测定，全血计数由血液分析仪（美国加州联合市Abasis）测定。收集肝、肺、脾和肾，固定、切片并进行HE染色进行病理检查。
统计分析
数据通过Prism 7软件进行分析（Graphpad，La Jolla，CA，USA）。采用双向方差分析和Tukey多重比较试验分析细胞毒性；采用单因素方差分析和Tukey多重比较试验分析趋化性和吞噬作用；使用多重t检验分析生物分布。体内毒性分析采用Kruskal-Wallis试验。所有数据均显示为平均值±标准偏差（SD）。
结果
纳米ICG的表征
NanoICG的平均流体动力学直径、NIRF特性和微观形貌报告于补充信息.
细胞毒性
将HPNE和KPC细胞归一化为未处理细胞，计算其相对存活率。总的来说，用空NP和NanoICG处理的HPNE和KPC细胞的相对存活率接近1。在0.1、0.01和0.001 mg/mL之间未观察到显著差异(). 此外，在空NP和NanoICG之间没有检测到显著差异。空NP和NanoICG不会损害健康胰腺上皮细胞的代谢活性。
对（A）HPNE细胞和（B）KPC细胞进行CCK-8分析，用不同浓度的空NP和NanoICG处理24 h，n个=5，各组间无显著差异。
趋化作用
与PBS相比，对完全培养基（阳性对照）的趋化性诱导为6.79倍。相反，ICG、NanoICG和空NP(第页<0.0001）显示，ICG的10×TPC的相对值（与PBS相比）为0.63±0.02，NanoICG的0×TPC为0.63？.04，空NP的10×TP为0.60±0.01(n个= 3) (). ICG、NanoICG和空NP的最低浓度（1/25×TPC）分别表现出0.85±0.02、0.87±0.03和0.81±0.01倍的相对趋化诱导（与PBS相比）(n个= 3). 这些结果表明，NanoICG和空NP没有显著的化学吸引特性。
（A） 根据4h时间点的理论血浆浓度（TPC），在不同浓度下使用ICG、NanoICG和空NP对HL-60进行趋化性分析。完整培养基为含20%FBS的IMDM。钙黄绿素AM的荧光光谱在485nm激发/535nm发射下采集；（B） HL-60中NanoICG的吞噬试验。酵母菌多糖A为阳性对照，PBS为阴性对照。以2.1分钟为间隔监测1.5小时的亮度读数，并将荧光信号的AUC量化为趋化反应****第页< 0.0001.
吞噬作用
无论试验样品浓度如何，HL-60对PBS、ICG、NanoICG和空NP的吞噬活性均较低(). 相比之下，酵母菌多糖A的内化程度更高(第页<0.0001），ICG、NanoICG和空NP的AUC值分别是10×TPC的1.87、1.83和1.93倍。与PBS相比，10×TPC的ICG、NanoICG和空NP对吞噬作用没有显著影响[分别为1.03±0.02、1.03±0.01和1.00±0.01(n个= 6)].
IGS荷瘤小鼠体内ICG和NanoICG的检测
如图所示，检查了ICG和NanoICG对IGS的适用性术中成像显示，IGS在胰腺肿瘤中可以检测到NanoICG和ICG；然而，与相同实验条件下的ICG相比，NanoICG导致肿瘤更加完整和强烈的增强（两者均在距离肿瘤恒定距离处用80 mW功率激发）(,底部). 从这些区域收集的光谱与宽场成像通道中检测到的NIR荧光非常一致，表明注射NanoICG的小鼠具有更强的近红外荧光(,中间的); 在814nm的峰值发射波长下，NanoICG治疗胰腺肿瘤的荧光信号是ICG组的2.03倍。IGS图像显示，NanoICG在原位PDAC检测中的对比度有所改善。
（A） 用于检测原位PDAC的图像引导手术系统的示意图。如文中所述，该系统利用波长分辨率近红外光谱测量和宽场多探测器摄像机进行实时手术指导，使用手持光谱笔作为激励源。（B） ICG增强胰腺肿瘤手术导航图像(左边)或NanoICG(正确的)24小时后静脉注射。注入。由于ICG清除的高背景信号，肝脏和脾脏被切除。Int=大肠，PT=胰腺肿瘤，St=胃，SI=小肠；(顶部)彩色图像显示了原位PDAC和手持光谱笔的位置，该笔提供近红外光谱信息，并用作宽场成像系统的激发源。(中部)宽场成像系统近红外通道中的伪彩色信号和对比度增强区域内的光谱信号；(底部)彩色图像上叠加的近红外信号（青色）显示同基因原位胰腺癌的强化。ICG和NanoICG均可观察到对比度增强，而NanoICG具有更强的信号（见插图中行）。
体外胰腺肿瘤荧光蓄积分析
胰腺的NIRF图像显示，与ICG相比，NanoICG处理的胰腺肿瘤部分的荧光信号积累更高，如（4A是胰腺的亮视野照片，用于空间参考）。显示了胰腺采集位置的光谱笔的量化荧光强度，以确定NIR信号和肿瘤对比度。胰腺尾部的斑点与KPC PDAC细胞植入的位置相对应，与头部和身体相比更明亮。点光谱测量与整个胰腺的NIR图像一致，如，在胰腺图像上画一条线，以从非增强区和对比增强区获取尽可能多的数据点，这些区域分别描绘了健康组织和PDAC。对于ICG，胰腺健康部分和肿瘤部分的平均荧光强度分别为0.35±0.12 AU和0.77±0.12 AU。相比之下，NanoICG健康部分和肿瘤部分的平均荧光强度分别为0.41±0.10 AU和2.30±0.67 AU。对于ICG和NanoICG，胰腺肿瘤部分与胰腺健康部分相比的平均折叠增量分别为2.20和5.61。
体外胰腺肿瘤中ICG和NanoICG积聚的分析。（A） 具有代表性的胰腺肿瘤的照片图像和（B）NIRF图像，标记有（B）所示光谱半定量的采集位置；（C） FIGS系统的光谱笔组件在中等激光功率和1s积分下激发的荧光强度；（D） ImageJ量化的NIRF图像中沿红色虚线的强度值图；（E） 荷瘤癌胰腺的显微镜下形态学检查（H&E）和荧光信号积累（NIR）(左边)和健康的胰腺(正确的)服用NanoICG。自体荧光（Auto）用伪绿色FITC滤光片立方体检测，近红外荧光用伪红色ICG滤光片检测。比例尺代表50μm。
在切片过程中，肉眼观察到实体瘤的表面呈淡黄色，这表明存在高度纤维化。[27]H&E染色的肿瘤切片显示具有高基质含量的特征性低分化腺癌(,左边). 良性胰腺组织切片显示正常胰腺形态(,正确的). 与ICG治疗组相比，NanoICG治疗的胰腺肿瘤部分的NIRF信号水平更高().
通过H&E染色切片确定脾转移和健康脾组织的边界，如在NanoICG治疗组中沿肿瘤边界检测到荧光信号，但在ICG治疗的组中未检测到。
PDAC脾转移的组织学检查。使用NanoICG（顶部）和ICG（底部）治疗PDAC的脾转移。SP=脾脏，T=肿瘤。H&E、Auto、NIR和Merge面板中的比例尺代表100μm。
ICG和NanoICG在PDAC中的相对生物分布
用原位PDAC模型评估小鼠器官中ICG和NanoICG的荧光强度。总的来说，与ICG组相比，NanoICG组胰腺中的SNR信号更高第页< 0.0001 (). 在器官之间，NanoICG治疗组的肝脏、脾脏、胰腺、骨骼、心脏和淋巴结的信号显著增高，分别是ICG组的5.3、4.4、2.1、2.1、2.3、2.2倍。另一方面，根据半定量NIRF图像确定，ICG显示出被胃肠道清除的巨大倾向()而对于NanoICG，肝脏和脾脏信号增加，提示RES清除().
对比剂给药后24小时基于NIRF图像定量ICG和NanoICG在PDAC小鼠中的生物分布。（A） ICG和NanoICG在PDAC小鼠中的定量分布，n个= 5, ***第页< 0.001, ****第页< 0.0001; （B） 经NanoICG治疗的PDAC小鼠指定坏死器官的典型NIRF图像；T=肿瘤，HP=健康部分；（C） 经ICG治疗的PDAC小鼠尸检器官的典型NIRF图像。
体内毒理学
为了比较纳米ICG对治疗小鼠的潜在毒性作用，我们进行了血液生化和血液学分析。显示标准血液学标志物的水平，如白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、红血球压积（HCT）和血小板（PLT）；白细胞对生理反应敏感，载体控制的平均值在正常范围内。NanoICG治疗组的白细胞数量略有减少，但这种减少没有显著差异，接近动物供应商提供的预期值[50]. 与对照组相比，NanoICG治疗组的所有其他参数均正常，且在正常范围内。此外，我们还报告了小鼠的生化结果，包括白蛋白（ALB）、碱性磷酸酶（ALP）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、淀粉酶（AMY）、血尿素氮（BUN）、总蛋白（TP）和球蛋白（GLOB）。与溶媒对照组相比，NanoICG治疗组的ALP、ALT和GLOB出现波动，但仍保持在正常范围内；在NanoICG剂量之间或与载体对照组之间未观察到差异。血液生化和血液学分析结果表明，即使使用NanoICG的上限剂量，也没有明显的毒性。
静脉注射后72 h，NanoICG处理小鼠的溶媒（黑色）、低剂量（0.39 mg/kg ICG当量，红色）和高剂量（2 mg/kg ICG当量，绿色）的血液学结果和血液生化结果。结果显示白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、红血球压积（HCT）、血小板（PLT）、白蛋白（ALB）、碱性磷酸酶（ALP）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、淀粉酶（AMY）、血尿素氮（BUN）、总蛋白（TP）、球蛋白（GLOB）的平均值和标准差。N个= 5.
为了进一步调查体内静脉注射不同剂量的NanoICG 72小时后，对其毒性、主要器官（包括肝、脾、肺和肾）进行组织学分析，并由董事会认证病理学家（SMC）进行检查，结果如下所示所有动物的脾脏都正常。这表明，由于脾的淋巴白髓保存良好，因此对免疫系统没有总体影响。肾脏在肾小球、肾小管、肾乳头、血管或肾盂中均未表现出毒性。因此，没有证据表明存在肾毒性。在肝脏中，偶尔有局灶性单核细胞浸润的动物（如黑色箭头所示），但这与任何坏死或再生的证据无关。没有涉及一致的地带性区域。溶媒对照组只有1只动物有此发现，低剂量组没有，高剂量组3只动物中有2只有此发现。因此，这可能反映了低水平的肝毒性。然而，这些结果与生物化学分析相矛盾，生物化学分析的载药控制、低剂量和高剂量NanoICG的ALT和AST水平正常(). 在肺部，溶媒对照组中有1只动物显示肺泡局灶性实变，没有炎症，低剂量组中有一只动物显示局灶性支气管周围慢性炎症，1只高剂量的动物也表现出局灶性肺泡-局灶性支气管周围炎和肺泡炎（如黑色箭头所示）。这些肺部变化很可能反映了材料的静脉给药，而与注射的材料无关。
静脉注射溶媒后72只C57BL/6小鼠的H&E染色组织切片（肝、脾、肾和肺）(顶行)，低剂量NanoICG（0.39 mg/kg ICG当量，中间一排)和高剂量NanoICG（2 mg/kg ICG当量，最下面一行). 肝脏的黑色箭头表示局部单核细胞浸润，肺部的黑色箭头表明局部实变或局部支气管周围慢性炎症。黑色条代表50μm，N个=4用于车辆控制，N个=低剂量组和高剂量组为3。
讨论
HA衍生NP的配方具有优势，最显著的是克服了治疗剂或成像剂的水溶性差。[28]其次，HA-衍生NP对健康组织具有长时间循环和低毒性。[29–31]第三，肿瘤靶向的可能性，包括通过特异性结合CD44[32]通过增强渗透性和滞留性（EPR）[28]效果，使其有望用于癌症成像和治疗。在本研究中，HA聚合物与PBA偶联得到两亲性HA，该HA很容易在水溶液中包封两亲性ICG。通过将ICG加入HA-衍生NP造影剂中，ICG在肿瘤中的积聚增加(,和)可能是由于所谓的EPR效应[28,33]同时减轻先天免疫系统的潜在毒性().
克服免疫系统屏障是靶向输送造影剂的关键步骤。加拉赫等。据报道，HL-60细胞对趋化剂和吞噬活性表现出反应性，这与成熟粒细胞的比例相当。[34]其他人报道HA物种的分子量从792到3×106Da均刺激多形核白细胞的吞噬和趋化功能，据报道，10kDa HA是天然免疫系统的有力刺激剂。[35,36]然而，对于HA衍生的纳米系统，不同分子量的HA修饰脂质体不会引起补体或巨噬细胞活化。[37]在在体外研究报告显示，除了受试样品的趋化潜能存在轻微的剂量依赖性外，未观察到明显的免疫毒性。可能的解释是，SM是一种对HL-60有效的化学引诱剂，其体积比随着测试样品的稀释而成比例增加。
在ICG和NanoICG治疗组中观察到整个胰腺内的对比度增强(,). ICG是一种小的两亲性染料分子。注射后，ICG立即与白蛋白和其他血清蛋白结合，然后释放到肝脏并在胆汁中清除，导致健康人体的半衰期不到20分钟。[33]报告S-180肿瘤的NIR图像，ICG注射后2 h至48 h对比明显，可能来自ICG结合白蛋白的EPR效应。[33]在在胰腺肿瘤中观察到ICG轻微积聚，与S-180肿瘤小鼠相当。[33]相比之下，在NanoICG受体中观察到胰腺健康部分和患病部分之间的对比度增强更明显(). Qhattal及其同事[38]据报道，肿瘤靶向性广泛受益于纳米系统的长循环，而汉族人等。[39]断言HA通过增加血浆半衰期而表现出有限的免疫毒性，其表现与聚乙二醇类似。因此，肿瘤中纳米ICG的积累可能是由于HA基纳米系统的循环延长所致。
布韦等。据报道，通过植入转染GFP的BxPC-3细胞，在脾、肠和网膜中检测到原位胰腺癌模型的转移病灶。通过活体检查，对肿瘤和转移区域进行量化，以进行生长监测[40]王等。报道了一种双光学和MR成像剂，以Cy5.5-ATF-IO表示，能够检测到直径小于0.5 mm的PDAC腹腔内转移病灶三光学近红外成像。[14]此外，光学近红外成像可以检测到1×104肿瘤细胞，是MRI能检测到的肿瘤细胞的1/10[14]另一项研究表明，CA19-9偶联的AlexaFluor488在检测PDAC的微转移（包括脾、腹膜和肝）方面是有效的。[10]在本研究中，NanoICG可明显显示脾转移的显微病变()多积聚于病灶周边。
HA-decorated NP靶向递送的一个重要限制是RES系统优先摄取。[28]一方面，经验表明，粒径小于100 nm的NP、中性或阴离子电荷以及较低的补体结合可以避免在静脉注射。管理。[37]此外，Qhattal等。发现高分子量（HMW）HA接枝的脂质体比低MW HA清除得快得多[38]因为HMW-HA与HARE或LYVE-1具有较高的亲和力，后者广泛表达于肝、脾和活化组织巨噬细胞的正常窦内皮细胞中。[41]因此，在这种情况下，由10kDa HA衍生的NP在肝脏中的累积程度较低，NanoICG在肝脏和脾脏中有明显蓄积(第页<0.0001），这表明RES摄取增加。目前正在进行进一步的研究，以确定用于胰腺肿瘤输送的NanoICG配方的最佳HA MW，并使RES摄取最小化。
内源性HA可能在胰腺癌的生物学中起重要作用[42]据报道，HA的高、低分子量形式在实验模型中的表达可抑制或增强胰腺癌细胞的恶性特性。对人体样本的仔细分析表明，HA在85%以上的胰腺癌中表达；[43]然而，其表达与人类预后的改善或恶化无关。HA也是治疗方法的靶点，其中其通过聚乙二醇化透明质酸酶的靶向降解用于改善药物递送[44]或者，HA复合物正被开发为药物递送剂。[45,46]综上所述，我们的研究结果以及现有和新兴的文献有力地支持了对HA作为胰腺癌递送载体和/或靶向剂的生物学和应用的进一步研究。
依据体内安全性方面，健康C57BL/6J小鼠在服用载体或两个NanoICG剂量中的一个剂量后的结果与其他剂量一致。例如，据报道，HA衍生的两亲性聚合物对顺铂或阿霉素诱导的肝毒性和肾毒性具有保护作用[47,48]这表明由HA共轭疏水分子构建的自组装药物载体能够有效降低全身毒性。另一方面，饶等。据报道，HA衍生的纳米载体可以控制药物有效载荷的释放，这取决于含HA的载体和药物的可逆相互作用。[49]这与Hill最近的结果一致，et（等）al，表明两亲性HA纳米结构的染料释放速率可控。[17]组织学变化可能与治疗无关，因为它们很小，与本研究中该菌株的对照组相似，而且历史上与坏死无关，不局限于肝小叶的特定区域，也与血清酶升高无关。因此，我们假设NanoICG的毒性可以忽略不计，这可能是由于以下几个因素的综合作用：显像剂以单一和低剂量给药；通过与PBA的π-π堆积，ICG被困在稳定状态[22]可能影响ICG释放；释放的ICG是FDA批准的低固有毒性医疗诊断试剂。
NanoICG是一种由HA衍生的NP，通过物理化学方法包埋ICG，显示出无毒安全性在体外和体内并为术中PDAC的检测提供了重要的近红外信号体内NIRF成像、FIGS和显微镜分析证实，在胰腺和脾脏转移中，NanoICG的荧光强度均高于ICG。总之，NanoICG在原位胰腺癌模型中检测胰腺肿瘤方面表现出了更好的疗效，NP衍生毒性可以忽略不计，这表明NanoICG是一种很有前景的潜在对比剂，可用于指导胰腺肿瘤切除。
致谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院（拨款编号：R00CA153916、R01EB019449、P50CA127297、P20 GM103480、U01CA210240、1S10RR17846、1S100RR027940和P30CA036727）、内布拉斯加州养猫人球发展基金和内布拉斯加研究计划的部分支持。
我们感谢Thomas C.Caffrey和Kelly A O'Connell对C57BL/6J小鼠原位胰腺癌模型的技术支持。我们还感谢Michel J.Ouellette博士分享HPNE细胞系。我们感谢洛拉·阿诺德女士为毒理学分析提供的技术指导。
缩写
| 自动变速箱油 | 氨基末端片段 |
| 澳大利亚 | 任意单位 |
| 计算机辅助制造 | 钙黄绿素 |
| CCK-8型 | 细胞计数套件-8 |
| 计算机断层扫描 | 计算机断层扫描 |
| 二甲基亚砜 | 二甲基亚砜 |
| 表皮生长因子 | 表皮生长因子 |
| 电子顺磁共振 | 增强渗透性和滞留性 |
| 图 | 荧光图像引导手术 |
| 胃肠道 | 胃肠道 |
| 健康与环境 | 苏木精和曙红 |
| 哈 | 透明质酸 |
| 嗯 | 高分子量 |
| HA-PBA型 | HA-氨基丙基-1-芘丁酰胺 |
| HPNE公司 | 人胰腺巢蛋白表达上皮 |
| ICG公司 | 吲哚菁绿 |
| 国际单项体育联合会 | 术中冰冻切片分析 |
| KPC公司 | LSL-Kras公司G12D系列/+LSL-Trp53172H兰特/+Pdx-1芯 |
| LMW公司 | 低分子量 |
| 基质金属蛋白酶 | 基质金属蛋白酶 |
| 核磁共振成像 | 磁共振成像 |
| 纳米ICG | 含物理化学包埋ICG的羟基磷灰石衍生纳米粒子 |
| 近红外光谱 | 近红外 |
| 国家无线电频率 | 近红外荧光 |
| 个人数字助理 | 胰腺导管腺癌 |
| 聚酯 | 正电子发射断层扫描 |
| RES系统 | 网状内皮系统 |
| 投资回报率 | 感兴趣的地区 |
| 标准偏差 | 标准偏差 |
| 信噪比 | 信噪比 |
| TPC公司 | 理论血浆浓度 |
| 美国公共行政管理局 | 尿激酶纤溶酶原激活剂 |
| 美国 | 超声波检查 |
| 白细胞计数 | 白细胞 |
| 加拿大皇家银行 | 红细胞 |
| HGB公司 | 血红蛋白 |
| HCT公司 | 红细胞压积 |
| 平板电脑 | 血小板 |
| 白蛋白 | 白蛋白 |
| 碱性磷酸酶 | 碱性磷酸酶 |
| 中高音 | 丙氨酸氨基转移酶 |
| 艾米 | 淀粉酶 |
| BUN公司 | 血尿素氮 |
| TP（转移定价） | 总蛋白质 |
| 地球仪 | 球蛋白 |
脚注
AMM是图像引导手术技术的共同发明人，该技术授权给Spectropath，Inc.（佐治亚州亚特兰大）。这里描述的工作在4第个2017年9月7日至8日的生物制药研究与开发研讨会（UNMC）和2017年9年9月13日至16日的世界分子成像大会（宾夕法尼亚州费城）。
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工具书类
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