中的突变巴西航空公司1（乳腺癌易感基因1）与家族性乳腺癌和卵巢癌有关，也与范科尼贫血（FA）有关1–5二十年前发现后6–8，BRCA1参与了包括mRNA剪接和microRNA生物生成在内的各种生物过程9–13、DNA损伤信号/细胞周期检查点2,14，避免复制-转录冲突15,16以及通过同源重组（HR）修复DNA双链断裂（DSB）1,三,17–19。BRCA1在这些过程中的作用大多仍不明确，主要是因为难以获得用于生化分析的高质量蛋白质制剂。BRCA1（1863个残基）与BARD1形成稳定的复合物（BRCA1相关的RING结构域蛋白1；777个残基）20,21BARD1的耗尽会导致DNA损伤敏感性、HR缺乏和基因组不稳定21–25.BARD1在小鼠体内的消融导致癌症易感性22，并且在癌症患者中发现可能的致病突变26–30.
我们努力描述BRCA1-BARD1在HR介导的DSB修复中的多方面作用。在修复过程中，DSB末端被切除以产生3′单链DNA尾部31这些DNA尾部被复制蛋白A（RPA）包裹，随后被重组酶蛋白RAD51取代，形成一种称为突触前丝的核蛋白复合物。突触前丝寻找、接合，然后侵入同源双链靶标，形成新生的异双链DNA接头，即置换环或D环。随后是DNA合成和DNA中间产物的分解，以完成修复32已发表的研究表明，BRCA1通过作为53BP1的拮抗剂和调节MRE11-RAD50-NBS1-CtIP复合物促进DNA末端切除，并与肿瘤抑制因子BRCA2和PALB2一起参与RAD51突触前丝的形成4,33为了从机理上了解BRCA1-BARD1如何促进HR，我们开发了一个在昆虫细胞中共同表达BRCA1和BARD1的强大系统，以及一个用于生化测试的获得BRCA1-BRD1的协议。我们的结果揭示了BRCA1-BARD1的新属性以及该蛋白复合体在HR介导的染色体损伤修复的DNA链侵入步骤中以前未被认识的作用。
BRCA1和BARD1结合DNABRCA1-BARD1在昆虫细胞中表达并纯化至接近同质性(). 我们采用DNA电泳迁移率变化分析（EMSA）测试BRCA1-BARD1结合放射性标记的ssDNA、dsDNA、复制叉（RF）、D-loop和DNA气泡。我们还进行了竞争实验，其中BRCA1-BARD1和放射性标记的D-loop的核蛋白复合物被一个未标记的DNA物种挑战。结果表明，BRCA1-BARD1对D-loop和DNA气泡的亲和力最高，其次是RF、dsDNA和ssDNA(和;).
BRCA1-BARD1的DNA结合和RAD51相互作用属性一、D-loop、DNA气泡（bubble）、复制叉（RF）、dsDNA和ssDNA的结合。b条，量化一数据为平均值±标准差，n=3或5。c（c）西南分析测试Dloop绑定。BSA为阴性对照。d日，RAD51或yRad51与BRCA1-BARD1相互作用的下拉分析。e（电子），《关于BRCA1和BARD1与RAD51相互作用的远西分析》。B1-B1，BRCA1-BARD1。BSA和RAD54分别为阴性和阳性对照。
已知BRCA1能结合DNA34,35使用Southwestern分析，我们发现BRCA1和BARD1都与D-loop结合，BARD1与底物的亲和力明显较高(). 与此一致，BRCA1-BARD11-142包含全长BRCA1且仅包含BARD1的RING结构域，对各种DNA底物的亲和力较低(). 总之，我们的结果表明，BRCA1和BARD1都有助于BRCA1-BARD1复合物的DNA结合能力。BRCA1的DNA结合域先前被发现位于蛋白质的中间区域34,35我们的绘图工作导致BARD1 DNA结合域的分离(). 重要的是，BARD1结构域表现出与复合物相似的DNA结合特性(). 因此，BARD1是一种结构特异性DNA结合蛋白，对D-loop和DNA泡具有最高亲和力。
BRCA1和BARD1的RAD51交互
发现BRCA1与来自细胞提取物的RAD51共同免疫沉淀17但尚不清楚它是否与RAD51直接相关。通过亲和力下拉，我们发现BRCA1-BARD1与人类RAD51相互作用，但与酵母RAD51（yRad51）几乎没有亲和力()或大肠杆菌收入分配表(). 我们还确定4–5个RAD51分子与BRCA1-BARD1结合(). 值得注意的是，BRCA1-BARD1-RAD51复合物的形成不受苯并酶或溴化乙锭的影响(和)表明这种关联不是由核酸桥接的。令人惊讶的是，BRCA1和BARD1在Far Western分析中都保留了RAD51，BARD1显示出更强大的信号()而HR因子RAD51D-XRCC2和DSS1在相同条件下没有绑定RAD51(). 这些结果有助于确定BRCA1-BARD1以物种特异的方式与RAD51相关，并且复合物中的两种蛋白质都参与RAD51相互作用。
考虑到BRCA1-BARD1结合DNA并与RAD51相互作用()，我们假设它可能会增强突触前纤维的组装和/或突触前丝介导DNA链入侵的潜力。我们采用了DNA链交换分析36,37()测试BRCA1-BARD1是否有助于RAD51突触前纤维的组装。结果显示，尽管如前所述36,38，BRCA2-DSS1复合物促进RAD51突触前丝在RPA涂层ssDNA上的组装，BRCA1-BARD1不具备这种属性(). 此外，我们发现，与BRCA2-DSS1不同37,38，当存在dsDNA时，BRCA1-BARD1无法将RAD51靶向ssDNA().
接下来，进行D-loop分析以测试BRCA1-BARD1是否促进DNA链侵袭(). 重要的是，BRCA1-BARD1在量上与RAD51呈亚化学计量关系，强烈增强了反应，无论ATP是否()或非水解类似物AMP-PNP()被用作核苷酸辅因子，而BRCA2-DSS1没有表现出任何刺激(). 相反，BRCA1-BARD1没有增强yRad51的活性(). 当ssDNA底物与RAD51预孵育或ssDNA与质粒DNA预混合时，我们发现BRCA2-DSS1对BRCA1-BARD1-RAD51形成D-loop没有刺激作用(). 然而，在RPA包被ssDNA的情况下，BRCA1-BARD1和BRCA2-DSS1组合的D-loop形成比单独使用这两种复合物更为稳健(). 综上所述，结果揭示了BRCA1-BARD1在促进RAD51催化的DNA联合形成中的意外作用().
BRCA1-BARD1增强RAD51介导的D-loop形成一，分析示意图。b、，与BRCA1-BARD1和BRCA2-DSS1的反应。c（c），量化b条数据为平均值±标准差，n=3。d日，描绘BRCA1-BARD1在DNA链入侵中的作用的漫画。
在同源DNA配对中，突触前细丝捕获双重伴侣，然后组装突触复合体，其中重组DNA分子在同源注册表中对齐，并发生碱基转换32.通过监测dsDNA对限制性内切酶消化的保护()，我们发现BRCA1-BARD1对突触复合体的形成有刺激作用(). 接下来，我们进行了DNA帘幕分析39,40实时检查同源DNA序列的配对(). 如前所述39,40，RAD51突触前丝能够与具有9-nt同源性的70bp双链DNA片段结合(). 重要的是，结果显示BRCA1-BARD1增强了DNA结合(). 然而，我们没有发现BRCA1-BARD1对结合位点分布、两两距离分布和驻留时间有任何影响的证据(k个远离的)结合dsDNA的(和). 由于BRCA1-BARD1不影响k个远离的在对齐的dsDNA中，我们推测它通过增加k个在dsDNA参与。我们注意到，BRCA1-BARD1突变体因BARD1-RAD51相互作用而受损或缺乏BRCA1的RAD51交互作用域，无法促进与双工靶点的配对（见下文）。我们还验证了BRCA1-BARD1并不影响携带yRad51的突触前细丝与dsDNA结合的能力(和).
BRCA1-BARD1促进突触复合体的形成一，Synaptic复合物分析示意图。b条，RAD51-ssDNA丝和BRCA1-BARD1形成突触复合体。c（c），量化b条数据为平均值±s.d.，n=3或6。日期：，DNA帘幕分析示意图39,40.e、，每个RAD51-ssDNA或yRad51-ssDNA丝线结合的dsDNA寡核苷酸的数量，作为BRCA1-BARD1浓度的函数。数据为平均值±95%置信区间，n=49、50、38、54、51或53。（f），Atto565-dsDNA与BRCA1-BARD1的结合分布。克，带有和不带有100 nM BRCA1-BARD1.*的突触复合体的半长存活曲线，P<0.05；**，P<0.01。NS=无显著性。在f和g中，数据是平均值±误差（通过引导确定）。用最小二乘法拟合f和g中的多重高斯线。
我们试图分离BRCA1-BARD1的RAD51结合缺陷突变体，用于生化和遗传测试。首先，我们在昆虫细胞中与各种BRCA1片段共同表达RAD51，并进行共同免疫沉淀。与之前的研究一致17，BRCA11-1527可以与RAD51交互，而BRCA11-1000和BRCA11-500在这方面受到了损害(). 重要的是，BRCA1-BARD1可能比BRCA1单独沉淀更多RAD51。这一结果，加上远西方的数据()，表示BARD1包含一个主要的RAD51交互域(). 基于缺失分析，发现BARD1残基123–162之间的区域对于RAD51相互作用是不可或缺的(和). 此外，携带这些残基的GST标记的BARD1片段可以有效地与RAD51结合()，表示它包含RAD51交互域。我们还发现RAD51的核心域（称为T3）通过BRC4重复BRCA2绑定41，能够与BRCA1-BARD1交互()，但不适用于BRCA1-BARD11-142或BRCA11-500-钢筋1(). 有趣的是，我们发现BRCA1-BARD1可以与BRCA2-DSS1竞争RAD51关联().
BARD1-RAD51复合物在DNA链侵袭中的相关性a、，BRCA1-BARD1中的域。b、，BARD1正交图中RAD51相互作用域的对齐。突出显示的残留物（绿色）变为AAE或N（红色）。星号表示在人类癌症中发现的BARD1突变（癌症基因组cBioPortal）。c（c），RAD51与野生型或突变型BRCA1-BARD1的相互作用测试。d日，检测D-loop反应中的BRCA1-BARD1突变体。e（电子），量化d日数据为平均值±标准差，n=3、4或5。使用双向方差分析计算P值，并使用Bonferroni方法校正多重比较。**，P<0.01。
我们表达并纯化了突变体BRCA1-BARD1Δ123–162为BARD1中的RAD51交互域删除的复数。我们发现BRCA1-BARD1Δ123-162，同时保持正常的DNA结合活性()，在RAD51交互中有缺陷()因此，无法增强D环的形成()或突触复合体(). BARD1同源序列中RAD51相互作用域的序列比对显示了一些保守的氨基酸残基（包括FXDA基序；). 基于此信息，我们生成了一个复合突变体，将保守残基F133和D135转变为丙氨酸，将A136转变为谷氨酸（AAE突变体）；F133作为其他RAD51交互基序包含在内41–43如BRCA2中的BRC441也含有功能上不可或缺的F残基。我们表达并纯化了突变体BRCA1-BARD1阿拉伯联合酋长国复杂。生化测试表明，尽管突变复合体能正常结合DNA()，不仅RAD51关联受损()也可以刺激D-loop的形成和突触复合体的组装(;和). 总之，这些结果提供了证据，证明BRCA1-BARD1-RAD51复合物对于增强RAD51介导的DNA链侵袭是必不可少的。
已在BARD1中发现RAD51相互作用域内的癌相关突变，其中一个突变（K140N）在两名大肠腺癌或子宫体子宫内膜癌患者中发现，改变了保守残基K140（cBioPortal for Cancer Genomic）44,45FXDA图案旁边(). 为了确定这种突变的重要性，BRCA1-BARD1K140牛顿表达并纯化突变复合物以进行检测。重要的是，结果表明，虽然突变对DNA结合没有影响()，它减弱BRCA1-BARD1对RAD51的亲和力()同时也损害了肿瘤抑制复合物增强D-loop形成和突触复合物组装的能力(和).
BRCA1-BARD1-RAD51复合物的细胞作用进行了基于细胞的研究，以检查BRCA1-BARD1和RAD51之间的关联，并确定BRCA1-BRD1-RAD51复合物的重要性。我们发现RAD51与BARD1共免疫沉淀的量重量物件通过MMC处理细胞增强()重要的是，BARD1阿拉伯联合酋长国物件突变损害DNA损伤诱导的与RAD51的关联(). 细胞分馏证实BRCA1和BARD1的核定位不受BARD1影响阿拉伯联合酋长国物件突变().
BARD1-RAD51复合物的生物学相关性a、，免疫沉淀法检测BARD1重量和BARD1阿拉伯联合酋长国用于MMC治疗后的RAD51关联。星号表示非特定带。b条，DR-GFP报告分析示意图（上部）。表达BARD1的细胞的结果重量物件或BARD1阿拉伯联合酋长国物件用BARD1 siRNA或对照siRNA（siCtrl）处理（底部）。数据为平均值±标准差，n=3。c（c），CRISPR/Cas9基因靶向分析示意图（上部）。表达BARD1的细胞的结果重量物件或BARD1阿拉伯联合酋长国物件用BARD1 siRNA或siCtrl处理后。数据为平均值±标准差，n=3。d日，表达BARD1的细胞的克隆存活率重量物件或BARD1阿拉伯联合酋长国物件在奥拉帕尼或MMC治疗后。数据为平均值±s.d.，n=3。EV，空矢量。使用双向方差分析计算P值，并使用Bonferroni方法校正多重比较。**，P<0.01。
接下来，我们聘请了DR-GFP记者46,47和CRISPR/Cas9刺激的基因靶向分析48,49询问BARD1阿拉伯联合酋长国物件变异影响HR熟练程度。正如预期的那样，siRNA敲低内源性BRCA1或BARD1会损害两个系统的HR(). 重要的是，BARD1的异位表达重量物件BARD1缺陷细胞完全恢复HR熟练程度，BARD1阿拉伯联合酋长国物件只导致部分互补(和). 此外，在克隆形成细胞存活分析中，BARD1缺陷细胞携带BARD1阿拉伯联合酋长国物件对MMC和PARP抑制剂Olaparib的敏感性明显高于表达BARD1的细胞重量物件(和).
我们还调查了BARD1阿拉伯联合酋长国物件突变会影响RAD51核病灶DNA损伤诱导的组装。正如预期的那样，内源性BRCA1的敲除可减少RAD51病灶的形成，无论是自发的还是在γ射线照射后(). 有趣的是，BARD1 siRNA治疗在较小程度上损害了RAD51病灶形成(). 在缺乏内源性BARD1并表达BARD1的细胞中重量物件或BARD1阿拉伯联合酋长国物件，RAD51病灶的形成过程类似，无论是自发的还是γ射线照射后的(). 然而，如RPA32的S4/S8磷酸化所示，BARD1阿拉伯联合酋长国物件MMC处理释放72小时后，细胞保留了更高水平的DNA损伤(). 这些结果表明BARD1的HR修复不足阿拉伯联合酋长国物件即使RAD51焦点形成不受影响。有趣的是，尽管53BP1（一种DNA末端切除抑制剂）耗尽50，部分克服了与BRCA1缺陷相关的HR缺陷()，它不能抑制BARD1缺陷细胞的HR缺陷(). 在缺少BARD1和53BP1的细胞中，BARD1阿拉伯联合酋长国物件能力不如BARD1重量物件弥补人力资源不足(). 总之，我们的结果有助于确立BRCA1-BARD1-RAD51复合物在通过HR修复DNA损伤中的生物学意义，并为BRCA1-BRD1在HR DNA链侵袭步骤中的作用提供了细胞证据。
BRCA1在RAD51介导的同源DNA配对中的作用为了探讨BRCA1在RAD51介导的反应中的作用，我们表达并纯化了BRCA11-500-BARD1缺乏BRCA1的RAD51相互作用和DNA结合域17,34，以及BRCA1Δ758-1064-BARD1，针对BRCA1的RAD51交互域删除。这些突变复合物似乎擅长DNA结合()但因RAD51交互而减弱(). 重要的是，两种突变复合物都不能强烈增强RAD51介导的D-loop形成()或突触复合体(和). 因此，BRCA1作为RAD51的辅助因子，对于BRCA1-BARD1的功能完整性也是不可或缺的。
方法
质粒的构建
A他的6使用QuikChange突变试剂盒（Stratagene）将亲和标记融合到pFastbac-BARD1（来自Jeffrey Parvin）中的BARD1。哺乳动物pS-Flag-SBP-BARD1物件通过从pS-Flag-SBP-BARD1载体（来自Xiaochun Yu）中删除GFP编码序列并分别使用寡核苷酸1和寡核苷酸2和寡核苷酸3和寡核苷酸4将沉默突变引入BARD1的siRNA靶区来修改表达载体（参见). 使用QuikChange定点突变构建BARD1的突变形式，即BARD11-122、BARD11-162、BARD11-261、BARD1Δ123-162、BARD1Δ123-261、BARD1Δ163-261、BARD1阿拉伯联合酋长国和BARD1K140牛顿（使用的引物序列可根据要求提供）。钢筋1123-162将其导入pDEST15中，以表达该BARD1片段的GST标记形式大肠杆菌。钢筋1124-270被克隆到pE-SUMO载体（LifeSensors Inc.）中，用于表达该BARD1域的SUMO标记形式大肠杆菌。
蛋白质纯化
昆虫细胞BRCA1-BARD1的纯化
pFastbac-Flag-BRCA1（来自Jeffrey Parvin）和pFastba-His-BARD1被引入大肠杆菌菌株DH10Bac用于bacmid世代。利用杆状病毒转染SF9昆虫细胞，生成重组杆状病毒。在SF9细胞中扩增后，病毒用于感染Hi5昆虫细胞以表达BRCA1和BARD1（10 ml BRCA1病毒和10 ml BARD1 P3病毒用于600 ml培养）。在27°C下培养44小时后，通过离心收集细胞，在液氮中冷冻，并在−80°C下保存。所有纯化步骤均在0°C至4°C下进行。为了制备提取物，将冷冻细胞颗粒（8 g，来自600 ml培养物）解冻并悬浮在40 ml细胞破碎缓冲液A（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，500 mM KCl，1 mM 2-巯基乙醇，0.5%NP-40，5 mM MgCl）中2，2 mM ATP和以下蛋白酶抑制剂：抑肽酶、凝乳抑素、亮氨酸蛋白酶和胃蛋白酶抑素A，每种3μg/ml，以及1 mM PMSF），用于使用Dounce均质器B型杵（30冲程）进行细胞裂解。通过10000×g离心15 min清除裂解液，上清液与3 ml抗Flag M2亲和树脂（Sigma）孵育2 h。树脂转移到柱（1.5×15 cm）上，用50ml裂解缓冲液洗涤，然后用50ml缓冲液B（25mM Tris-HCl，pH 7.5，300mM KCl，10%甘油，0.5mM EDTA，0.01%Igepal CA-630，1mM 2-巯基乙醇，5mM MgCl2和2 mM ATP），然后用2 ml含有单个Flag肽（200μg/ml）的缓冲液B洗脱结合蛋白四次。将洗脱液与32 ml缓冲液C（25 mM Tris-HCl，pH 7.5，10%甘油，0.5 mM EDTA，0.01%Igepal CA-630，1 mM 2-巯基乙醇）混合，然后在1 ml HiTrap SP Sepharose HP柱（GE Healthcare）中使用12 ml梯度75–500 mM KCl在缓冲液C中进一步分馏。在Superose 6 10/300 GL（GE Healthcare）凝胶过滤柱中进一步分离合并的BRCA1-BARD1组分（来自250–350 mM KCl），该凝胶过滤柱由含有300 mM KCl的24 ml缓冲液C制成。将峰馏分合并，分成10μl份，冷冻在液氮中，并储存在−80°C下。BRCA1-BARD1的突变形式用相同的程序表达和纯化。从600 ml昆虫细胞培养物中获得的高纯度BRCA1-BARD1的产量为150至300μg，最终浓度为300至500μg/ml。
BARD1的净化123-162和BARD1124-270来自大肠杆菌
GST-BARD1123-162表达质粒pDEST15-BARD1123-162或BARD1124-270表达质粒pET-SUMO-BARD1124-270被引入大肠杆菌罗塞塔（DE3）电池。将源自在37°C下生长的50 ml LB培养基中的单个菌落的过夜培养物用于接种2 L新鲜LB培养基。当电池密度达到OD时，将IPTG添加至0.4 mM600=0.8，在16°C下培养16小时后收集细胞。所有后续步骤均在0–4°C下进行。将细胞颗粒（8 g）悬浮在50 ml缓冲液D（20 mM KH）中2人事军官4用超声波法制备含有蛋白酶抑制剂（抑肽酶、凝乳抑素、亮氨酸蛋白酶和胃蛋白酶抑素A，每种抑制剂的pH值分别为3μg/ml和1 mM PMSF）的pH7.5、10%甘油、0.5 mM EDTA、0.01%Igepal CA-630、1 mM 2-巯基乙醇和300 mM KCl，以及细胞裂解液。离心（100000×g，持续90分钟）后，将澄清的裂解液与2 ml谷胱甘肽Sepharose 4 Fast Flow树脂（GE Healthcare；用于GST-BARD1123-162)或Ni-NTA树脂（GE healthcare；用于BARD1124-270)将亲和树脂转移到玻璃柱（1.5×15 cm）中，用20 ml缓冲液D洗涤，然后用3 ml 20 mM谷胱甘肽或150 mM咪唑在缓冲液D中洗脱3次。对于BARD1124-270，他的6-SUMO标签在4°C下通过过夜培养被Ulp1蛋白酶切割。洗脱液在Centricon-10K浓缩器（Amicon）中混合并浓缩至0.5 ml，然后在Superdex 200 10/300 GL色谱柱（GE Healthcare）中用24 ml含有300 mM KCl的缓冲液C进一步分馏。将峰馏分合并，如上所述浓缩至~100μl，分成5μl份，冷冻在液氮中，并储存在−80°C下。
其他重组蛋白
使用我们之前描述的程序将BRCA2-DSS1、RAD51、RPA和酵母RAD51纯化至接近同质性36,51,52.
DNA底物和DNA结合分析
D-loop、DNA气泡、复制叉和双链DNA分别由寡核苷酸5/6/7、寡核苷酸5/6、寡核苷酸8/9/10/11和寡核苷酸12/13组装而成（参见寡核苷酸序列）；星号表示32P标记在每个基板的5′端。单链DNA底物为5′32P标记的寡核苷酸12。将这些DNA底物（每个10 nM）与野生型或指定突变型BRCA1-BARD1在37°C的10μl缓冲液E（25 mM Tris-HCl，pH 7.5，90 mM KCl，1 mM DTT和100μg/ml牛血清白蛋白（BSA））中培养10分钟。添加加载缓冲液（50%甘油，20 mM Tris-HCl，pH7.4，0.5 mM EDTA，0.05%橙色g）后，反应混合物在4°C的TAE缓冲液（30 mM三醋酸三钠，pH 7.4和0.5 mM EDTA）中通过6%天然聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。凝胶干燥后，通过放射自显影术观察DNA物种，并使用个人分子成像仪定量™和Quantity One软件（Bio-Read）。由于BRCA1-BARD1形成的核蛋白复合物并不总是作为明确的物种迁移，我们通过测量DNA底物的消失来量化DNA结合。
亲和力下拉列表
RAD51、yRad51或RecA（5μM）与0.5μM Flag-BRCA1-BARD1或3μM GST-BARD1孵育123-162在4°C下，在30μl缓冲液F中放置30分钟（25 mM Tris-HCl pH 7.5，10%甘油，0.5 mM EDTA，0.05%Igepal CA-630，1 mM 2-巯基乙醇，150 mM KCl）。然后，将反应混合物与12μl抗Flag M2亲和树脂或谷胱甘肽Sepharose 4 Fast Flow树脂在4°C下混合30分钟，以分别通过BRCA1上的Flag标签或BARD1上的GST标签捕获蛋白质复合物。用200μl缓冲液F洗涤树脂三次后，用20μl 2%SDS在37°C下洗脱结合蛋白5分钟。用SDS-PAGE和考马斯蓝染色分析上清液（S）、末次洗涤液（W）和SDS洗脱液（E）各8μl。
西南分析
BRCA1-BARD1在7.5%的SDS-PAGE凝胶中溶解，并在4°C的转移缓冲液（25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸，pH 8.3，20%甲醇）中转移到硝化纤维素膜（Bio-Rad）上。在4°C的缓冲液G（25 mM Tris-HCl，pH7.5，2 mg/ml BSA，1 mM DTT，0.1%Triton X-100，10%甘油和100 mM KCl）中浸泡20 h后，用缓冲液h（25 mM-Tris-HCl，pH7.5200μG/ml BSA，90 mM KCl，4 mM MgCl）冲洗膜两次2和1 mM DTT），然后在含有32P标记的D-loop DNA（2 nM）在25°C下放置1 h。在通过磷成像进行分析之前，用10 ml缓冲液h将膜清洗四次。
远西方分析
SDS-PAGE后，将BRCA1和BARD1转移到硝化纤维素膜上，如西南分析所述。将膜浸泡在缓冲液I中（10 mM KH2人事军官4在pH 7.4、150 mM KCl、15 mg/ml BSA、2 mM 2-巯基乙醇、0.05%吐温20）、25°C下培养2 h，然后在25°C的缓冲液I中与5μg/ml RAD51培养2 h。然后，用10 ml缓冲液I清洗膜三次，在缓冲液I内与抗RAD51-HRP抗体（Abcam，ab195548）培养1 h，再次用10毫升缓冲液I冲洗三次，并用超级信号基板试剂盒（Pierce）显影。
同源DNA配对分析
这是按照描述进行的36,37反应在含有1 mM ATP和2 mM MgCl的缓冲液J（25 mM Tris-HCl，pH 7.5，60 mM KCl，1 mM DTT和100μg/ml BSA）中组装2最终体积为12.5μl。对于介体活性，首先将150米寡核苷酸14（6μM核苷酸）与RPA（600 nM）在37°C下孵育5分钟，然后将RAD51（2μM）与指示浓度的BRCA1-BARD1或BRCA2-DSS1合并到反应中。在37°C下孵育5分钟后，32添加P标记的同源dsDNA（40 bp；寡核苷酸15和16；1.6μM碱基对）和4 mM盐酸亚精胺。为了测试ssDNA靶向活性，32P标记的dsDNA和亚精胺盐酸盐（含或不含BRCA1-BARD1或BRCA2-DSS1）30分钟。通过添加等量的含1 mg/ml蛋白酶K的1%十二烷基硫酸钠终止反应。在37°C下培养5分钟后，脱蛋白反应混合物在TAE缓冲液中的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中溶解。将凝胶干燥到3MM CHR纤维素层析纸上（GE Healthcare），通过放射自显影术对DNA物种进行可视化和定量，如上所述。
D-loop分析
这是按照描述进行的42,53简单地说32将P标记的90米寡核苷酸17（2.4μM核苷酸）与RAD51（1μM）在37°C下在含有1 mM MgCl的缓冲液J中孵育5分钟2和2 mM ATP或AMP-PNP。在加入指示浓度的BRCA1-BARD1并在37°C下培养5分钟后，通过添加pBluescript SK复制型I DNA（37μM碱基对）启动Dloop反应，并在37℃下培养7分钟。反应中90-mer与pBluesscript质粒的摩尔比为2.1比1。通过添加等量的含有1 mg/ml蛋白酶K的1%十二烷基硫酸钠，并在37°C下培养5分钟，终止反应。脱蛋白反应混合物在1%琼脂糖凝胶中通过电泳进行分解，并将其干燥到Hybond上™-N膜（GE Healthcare）。使用磷光成像分析对放射性标记的DNA物种进行可视化和量化。
突触复合物分析
如所述，在37°C下进行测定5,6简单地说，RAD51（4μM）与60-mer寡核苷酸18（12μM核苷酸）孵育，该寡核苷酸与Ssp公司目标pUC19 dsDNA中的I限制位点，位于8μl缓冲液K（35 mM Tris-HCl，pH 7.5，50 mM KCl，2 mM ATP，2 mM-MgCl2100μg/ml BSA和1 mM DTT），持续5分钟。在1μl体积中添加指示量的BRCA1-BARD1后，将反应混合物培养5分钟。然后，在1μl中添加线性pUC19质粒DNA（85μM核苷酸），然后进行5分钟培养，并用2.5单位的Ssp公司反应混合物在TAE缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳分离，DNA物种用溴化乙锭染色。异源寡核苷酸19()用作控件。
DNA幕成像分析
将RAD51细丝组装在ssDNA帘幕上，并按所述测量所得RAD51-ssDNA细丝的dsDNA-结合特性39,40为了确定dsDNA结合事件的数量，用缓冲液K（30 mM Tris–醋酸盐，pH 7.5，1 mM MgCl）从1.5μM储备液中稀释BRCA1-BARD12，5 mM氯化钙2100 mM KCl、2 mM ATP、1 mM DTT和0.2 mg/ml BSA），浓度范围为10–100 nM，引入流式细胞室，然后在37°C下培养10分钟。用1 ml缓冲液K（1 ml/min）洗涤后，将2.16 nM Atto565标记的dsDNA（70-bp）与RAD51-ssDNA细丝具有9 nt同源性（寡核苷酸20和21）的dsDNA引入培养箱，然后在37°C下培养10分钟。然后，用0.5 ml缓冲液K（1 ml/min）清洗细胞，并拍摄三张图像。记录每个RAD51-ssDNA细丝的长度和结合的标记dsDNA分子的数量，并将其归一化为50像素（~40kb）的长度。计算了基于每根灯丝长度的加权平均值和标准偏差。95%的置信区间表示为误差条。对于存活概率，在没有或使用100 nM BRCA1-BARD1的情况下进行实验，并在90分钟内每隔30秒记录100 ms的暴露时间。每个实验的~180个分子的停留时间由测波仪测定，存活概率绘制在半对数图上。误差条表示通过bootstrap分析测量的70%置信度，这是平均值的一个标准偏差的近似值。
细胞培养和转染
来自ATCC的U2OS和HeLa细胞在添加10%胎牛血清（Sigma）、100μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素（Sigma-）的Dulbecco改良Eagles培养基（DMEM）中生长。Bionique检测实验室对细胞进行了支原体污染检测(网址：http://www.bionique.com/). 用于暂时耗尽BARD1和BRCA1的Qiagen siRNA寡核苷酸列于.53BP1 siRNA（s14313）购自Ambion-Thermo Fisher Scientific。siRNA、pS-Flag-SBP-BARD1的转染物件根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行pCMV-I-SceI-3xNLS。为了产生稳定的HeLa和U2OS细胞系，表达Flag-SBP-BARD1或其突变体，用其各自的质粒转染细胞（pS-Flag-SBP-BARD1重量物件，pSFlag-SBP-BARD1阿拉伯联合酋长国物件，和pS-Flag-SBP-BARD1K140牛顿物件)用800μg/ml G418筛选单个克隆。
协同免疫沉淀分析
收获前，将生长在15 cm细胞培养皿上的HeLa细胞用或不用1μM MMC处理一夜。用PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤后，刮去细胞并转移到Eppendorf管中。通过添加1 ml裂解缓冲液（300 mM NaCl、1.0%Triton X-100、5 mM EDTA、2 mM NaVO）制备全细胞裂解液4，2 mM钠4O（运行）7P（P）2，0.02%NaN三和50 mM Tris-HCl，pH7.4）与蛋白酶抑制剂（罗氏完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒片）混合到细胞颗粒中。在12 s超声处理后，通过在4°C下以18400 g离心15分钟的方式清除细胞提取物。将上清液部分（总蛋白2 mg）与DNase I（20U）在室温下孵育15 min，在37°C下孵养15 min。然后，添加50μl抗旗帜树脂（Sigma）或抗鼠IgG树脂（Santa Cruz），然后在4°C下培养12小时过夜。用裂解缓冲液洗涤树脂4次后，用100μl SDS凝胶负载缓冲液（50mM Tris-HCl pH 6.8，2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油，10%2-巯基乙醇）洗脱结合蛋白，并用抗Flag和抗RAD51抗体对100μl洗脱液进行Western印迹分析。
免疫印迹分析
使用NETN缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8、420 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5%Igepal CA-630、1 mM-DTT和Roche蛋白酶抑制剂鸡尾酒）和8个冷冻/解冻循环，从转染指定siRNAs两天后采集的细胞中提取蛋白质。用以下抗体检测印迹物（总蛋白20–50μg）：BARD1（Bethyl，A300-263A；Santa Cruz Biotech，Sc11438），BRCA1（Abcam，ab16780），53BP1（Abcam，ab36823），Flag M2-HRP（Sigma，A8592），Phospho RPA32 S4/S8，根据制造商提供的说明，Tubulin（Santa Cruz Biotech，sc-53030）、HA.11（16B12）（Covance，MMS-101P）或GST-HRP（NEB，E2624S）。如果需要，在使用ECL试剂盒（Thermo Scientific Pierce）显示蛋白质信号之前，用HRP结合的二级抗体（Pierce 31450用于兔抗鼠IgG-HRP；Sigma A6154用于山羊抗兔IgG-HRP；Santa Cruz Biotech Sc-2032用于山羊抗鼠Ig G-HRP）培养印迹。
DR-GFP报告分析
使用含有DR-GFP报告子的单个完整拷贝的DR-U2OS细胞系46,47将指数生长的细胞接种在6孔板中（2×10）5用2μl siRNA（20μM）和5μl Lipofectamine™2000（Invitrogen）转染前每孔细胞数。siRNA转染后第1天，用2μg I转染细胞-Sce公司I表达载体（pCBASce）和5μl Lipofectamine™2000。HR熟练程度通过使用BD FACS Calibur S在I后72小时计算GFP阳性细胞的分数来确定-Sce公司我转染。结果来自至少3个独立实验的3-5次转染。
CRISPR/Cas9诱导的基因靶向检测
按照说明进行分析48U2OS细胞以2×10接种于6孔板中5细胞转染2μl siRNA（20μM）和5μl Lipofectamine™2000（Invitrogen）之前。siRNA转染一天后，将1.6μg sgRNA质粒pX330-LMNA1（来自Graham Dellaire）和0.4μg供体模板pCR2.1-CloverLamin（来自Grahm Dellaere）和5μl Lipofectamine™2000（Invitrogen）共同转染细胞。质粒共转染后72小时，使用BD-FACS-Calibur S计数Clover阳性细胞的百分比，从而确定基因靶向效率。结果来自至少3个独立实验的3-5次转染。
免疫荧光显微镜和图像分析
按照制造商的建议，使用RNAiMAX（Invitrogen）和20 nM BARD1或对照siRNA在Opti-MEM培养基中连续两天转染指数生长的HeLa细胞。使用137Csγ辐照器（J.L.Shepherd，型号81-14），剂量率为1.05 Gy/min。如前所述进行免疫组织化学54，但细胞在室温下固定在4%多聚甲醛中10分钟，并在PBS中的0.4%Triton X-100中渗透5分钟。使用兔抗RAD51（H-92；Santa Cruz Biotechnology；1:2000）和山羊抗兔AlexaFluor-488二级抗体（Invitrogen；1:750）。对于RAD51焦距的图像捕获，使用63倍油物镜和蔡司Axio-Imager拍摄了每个样品100–150个核的20个叠层（0.2μm间隔）组成的Z叠层截面图像。配备Zen Blue软件的Z2显微镜（纽约桑伍德卡尔蔡司显微镜有限责任公司）。对于焦点的计算分析，Z堆叠被折叠到最大强度投影，并且ImageJ的组合(网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/)和细胞档案器(http://www.cellprofiler.org/)软件程序与以下自定义程序设置一起用于图像处理：最小对象大小=3；最大物体尺寸=35；脱颈率=0.3；滚动球大小=5。采用了一个定制的管道，用于自动细胞（80-300像素单位）和焦点计数，并设置了形状（即0.5）和尺寸（即5像素直径）。病灶检测阈值是根据sham-照射的样本确定的，每个核>5个病灶的细胞核被计数为阳性。以完全盲法进行分组和结果评估。
克隆存活试验
如上所述，用siRNA瞬时转染HeLa细胞。48小时后，将细胞以50–32000个细胞/孔的速度接种到6孔板中，用0、5、10和20 nM MMC（Sigma）或0、0.5、1和2μM Olaparib（Selleckchem）在常规生长培养基中处理14天。细胞用10%甲醇和10%乙酸固定，并用1%甲醇结晶紫染色，然后计数菌落。通过将每个处理平板上的菌落数除以未处理平板上菌落数，并考虑未处理细胞的平板效率，确定给定浓度的细胞的克隆形成存活率。
细胞质和细胞核提取物的制备
采用Dignam方法制备细胞质和细胞核提取物55简单地说，109用PBS和Dignam缓冲液A（10 mM Hepes pH 7.9，1.5 mM MgCl）清洗细胞2，10 mM KCl，0.5 mM DTT和0.5 mM PMSF），通过离心收集，并使用Dounce均质机（50冲程）和A型杵在Dignam缓冲液A的2个填充细胞体积中溶解。离心后，保存含有细胞质蛋白的上清液以供分析。将造粒细胞核重新悬浮并溶解在3 ml Dignam缓冲液C（20 mM Hepes pH 7.9，1.5 mM MgCl）中2、420 mM NaCl、0.2 mM EDTA、0.5 mM DTT、25%甘油和0.5 mM PMSF），使用Dounce均质器（80冲程）和B型杵。通过离心除去碎屑以产生核提取物部分。通过免疫印迹法分析细胞质和细胞核组分（各20μg）中BRCA1、Flag-SBPBARD1、Tubulin和组蛋白H3的含量。
