微管结合药物通过稳定微管和逆转tau病模型中的快速轴突运输缺陷来抵消tau隔离

摘要

Tau异常与神经退行性Tau病的机制有关，包括阿尔茨海默病（AD）和遗传性额颞叶痴呆伴17号染色体帕金森综合征（FTDP-17），因为Tau病在神经病理学上的特征是成对螺旋丝（PHF）的大量聚集和/或由中枢神经系统（CNS）神经元和/或胶质细胞中异常磷酸化tau（PHFtau）组成的直丝（参考文献。1). 六种可溶性脑tau亚型由单个基因通过选择性剪接产生，主要在成人大脑的轴突中表达(1)在那里它们与微管（MT）结合并稳定(2). 因此，正常的τ蛋白起着稳定和维持神经元轴突运输所必需的MT网络的关键作用，正常τ蛋白功能的丧失与以τ蛋白内含物为特征的神经退行性疾病的机制有关(1,三). 例如，与正常τ相比，PHFtau不能执行重要的τ功能，例如稳定MT(4)和PHFtau聚集体在AD中形成神经纤维缠结（NFT）和神经丝(5)以及其他tau病中的纤维神经元和/或胶质内含物(1). 许多家族中的多个tau基因突变是FTDP-17的致病因素(1,6–9)，不同的突变似乎通过不同地改变特定CNS tau亚型的功能或水平而导致神经退行性变(1,10). 事实上，我们用小鼠朊蛋白（PrP）启动子产生了转基因（Tg）小鼠，该启动子在中枢神经系统神经元中过度表达最短人脑tau亚型（T44），并显示3至12个月大的PrP T44 tau Tg小鼠积聚丝状tau内含物和不溶性高磷酸化tau，同时伴有MT数量减少，受损的快速轴突运输（FAT）、神经退行性变和运动无力，从而重现人类tau病的关键表型特征(11). 超过18个月大时，这些tau-Tg小鼠发育出新皮质tau内含物，并用硫黄素S、刚果红和加利亚斯银染色(12). 因此，这些Tg小鼠是人类神经退行性τ蛋白病的相关动物模型(1).

在这里，我们测试了一个假设，即MT-稳定药物可以通过抵消由于τ螯合到缠结中而导致的正常τ功能的丧失，从而对人类τ病具有治疗益处(13). 值得注意的是，以前的研究使用在体外模型显示，MT-稳定药物（例如紫杉醇）可以减轻淀粉样β诱导的神经元死亡和tau磷酸化(14). 因此，我们每周在胶束载体（Paxceed；Angiotech Pharmaceuticals）或单独的胶束载体中腹腔注射MT-结合药物紫杉醇，治疗9个月大的PrP T44 tau Tg小鼠12周。我们评估了这些处理对FAT、MT数量、tau内含物和运动行为的影响。由于Paxceed恢复了tau-Tg小鼠的FAT，增加了轴突MTs，并改善了运动损伤，该研究提供了体内证明MT-稳定药物可能对人类τ蛋白病有治疗益处的证据。

材料和方法

MT-稳定药物。紫杉醇已从短叶红豆杉和其他成员出租车由于其通过MT稳定而具有抗有丝分裂活性，它已被临床用作一种有效的抗癌药物(13–16). Paxceed是紫杉醇的专利胶束制剂（Angiotech Pharmaceuticals），旨在减少炎症并提高紫杉醇在血液中的生物利用度。

PrP T44 Tau Tg小鼠。使用包含小鼠PrP启动子驱动的最短人类tau亚型（T44）cDNA和3′非翻译序列的转基因在B6D2/F上构建tau Tg小鼠₁前面描述的背景(11,12). 这里的研究是在9个月大的杂合系7 tau Tg小鼠上进行的。总共60只PrP T44 Tg和年龄匹配的非Tg小鼠被分为五组：未治疗的非Tg、未治疗的Tg、假（载体）治疗的Tg以及低剂量和高剂量Paxceed治疗的Tg小鼠(n个=每组12人）。两组年龄匹配的9个月大PrP T44 tau Tg小鼠经腹腔注射10 mg/m²（低剂量）或25 mg/m²（高剂量）连续12周每周服用一次罂粟碱，并与上述其他组中年龄匹配的小鼠进行比较。在12周的治疗方案后，进行腹根FAT、免疫组织化学、EM和表型分析。

FAT研究。13个月大的12只T44 tau Tg小鼠接受低或高剂量的Paxceed和年龄匹配的假处理Tg小鼠(n个=每组3例）在深度麻醉下从脊髓T13段至L1段进行椎板切除术。[³⁵S] 如前所述，用立体定向仪在5分钟内将0.8μl生理盐水中的蛋氨酸（300μCi；1μCi=37 kBq）微量注射到L5腹角两侧的两个部位(11,17). 在微量注射后3 h处死动物，取下每只小鼠的L5腹根进行定量Western印迹，以在所述的三份印迹上评估FAT(11,17).

腹根轴MT密度的EM分析和量化。对用低或高剂量巴克西处理的T44 tau Tg小鼠进行EM。12个月大的Tg和年龄匹配的假治疗和非治疗Tg小鼠和非Tg小鼠(n个=3/组），L5腹根接受所述单位面积MT密度的定量EM研究(11,17–19).

管蛋白和其他转运蛋白的定量Western Blot分析。评估Paxceed处理的T44 tau Tg和sham处理的Tg小鼠以及非Tg小鼠（12个月大；n个=每组3只），对这些小鼠在致命麻醉和灌注10 ml PBS后解剖的组织进行定量Western blot分析，包括为FAT研究准备的L5腹根，如所述(11,17).

免疫组织化学分析。用Paxceed治疗的T44 Tau Tg小鼠、年龄匹配的假治疗和未治疗Tg小鼠和非Tg小鼠（12个月大；n个根据宾夕法尼亚大学批准的方案，通过静脉注射盐酸氯胺酮（1 mg/10 g）和甲苯噻嗪（0.1 mg/10 g。然后将小鼠的大脑和脊髓按所述进行切除和处理(11,17). 石蜡包埋组织被切割成6μm厚的切片，腰椎节段的每五个切片（每只小鼠20个切片）用兔抗金多克隆抗体17027染色，以通过免疫组织化学方法定位和定量tau聚集体，如所述(11,17).

抗体。这里使用了以下抗体（参见参考文献。4–6,11,12,17、和18详细信息）：(我)17026，重组tau特异性兔多克隆抗血清；(ii（ii）)突触素，一种小鼠单克隆抗体（mAb）（Chemicon）；(三)驱动蛋白，一种单克隆抗体（Chemicon）；(iv（四）)中等大小的神经丝蛋白，单克隆抗体；(v（v）)α-微管蛋白，单克隆抗体（西格玛）；(不及物动词)β-微管蛋白，单克隆抗体（西格玛）；(vii（七）)dynein，单克隆抗体（Chemicon）；(viii（八）)Glu-Tub，一种对脱酪氨酸微管蛋白特异性的兔多克隆抗血清（纽约哥伦比亚大学格雷格·冈德森赠送）；(九)AC-Tub，一种乙酰化微管蛋白（Sigma）特异性单克隆抗体；和(x个)Tyr-Tub，一种酪氨酸化微管蛋白（Sigma）特异性单克隆抗体。

尾部悬挂试验。为了确定Paxceed是否改善了T44 tau Tg小鼠的运动障碍，对每个实验组进行了尾部悬吊试验(n个=每组20个）(11)在9-12个月大的时候，用尾巴悬吊老鼠15秒钟，每两周对它们进行一次录像。测试周期分为3秒的时段。每只动物的运动障碍都由三个对小鼠状态一无所知的个体按照五分制评分。异常运动被定义为后肢或后肢加上前肢和躯干的肌张力障碍，同时肢体被拉入体内。至少两名观察者将损伤定义为4-5分。使用广义估计方程模型的统计分析表明，与未经治疗的Tg小鼠相比，经Paxceed治疗的小鼠的运动损伤水平显著较低。Aχ²线性趋势检验用于确定巴赛德治疗和运动障碍之间是否存在剂量依赖关系。

结果

为了监测Paxceed对FAT的影响，我们测量了10或25 mg/m剂量的Tg小鼠腰5（L5）腹根轴突中的FAT²经过12周的治疗后，Paxceed和sham-treated Tg小鼠中的Paxcede同样有效。由于运动神经元退化并导致T44 tau Tg小鼠的运动无力，从神经肌肉接头摄取Paxceed使其能够进入脊髓运动神经元，而无需穿过血脑屏障。如所示图1一和D类与假处理的Tg小鼠相比，低剂量和高剂量Paxceed治疗的Tg鼠的远端腹根节中放射性标记蛋白显著增加。特别是，Paxceed处理的Tg小鼠显示放射性标记蛋白沿腹根轴突运输2–8mm，而sham处理的Tg小鼠则为2–4mm(图1一和D类). 此外，用低剂量和高剂量的Paxceed处理的Tg小鼠也显示出放射性标记蛋白的数量显著增加(图1B类和E类)以及他们的运输速度(图1C类和F类)L5腹根与假处理Tg小鼠的比较。

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图1。

Paxceed治疗的T44 tau Tg小鼠腹根FAT的剂量依赖性改善。SDS/PAGE显示13个月龄T44品系7 tau Tg小鼠脊髓L5腹根经低剂量治疗后的FAT改善(A–C)或高剂量(D–F型)Paxceed分别与年龄匹配的假处理T44 tau Tg小鼠进行比较。荧光透视仪(一和D类)显示各种FAT增加[³⁵S] 13个月大的T44 tau Tg小鼠用低剂量和高剂量的Paxceed治疗后的蛋氨酸标记蛋白质（用符号表示）。图表(B类,C类,E类、和F类)说明了用或不用巴克西德治疗的两对年龄匹配的T44τ-Tg小鼠中FAT传递的蛋白质的定量。中的符号一和D类对应于图中分析的蛋白质B类和E类分别是。n个= 3.^*,P（P）< 0.05;^**,P（P）< 0.01.

接下来，我们询问Paxceed对FAT的影响是否与这些Tg小鼠中MT的保存有关，正如假设的那样(13)我们用光学显微镜和电镜检查了脊髓腹根轴突。图2显示了一只12个月大的非Tg小鼠L5腹根的半薄切片的正常外观(图2一)其中可见大小有髓轴突。相反，年龄匹配的假处理和非处理tau Tg小鼠的腹根轴突显示出不规则形状的退化轴突(图2B类和C类). 然而，低剂量和高剂量Paxceed处理的tau Tg小鼠的腹根轴突具有更正常的外观(图2D类和E类)而不是经过脱毛处理和未经处理的tau Tg小鼠(图2B类和C类). EM对这些小鼠L5腹根轴突MT密度的研究(图2一′–E类'和2F类)在未经处理的12月龄tau Tg小鼠中，MTs密度显著降低约25%(图2B类′)与非Tg小鼠相比(图2一′)如前所述(11). 与之形成鲜明对比的是，低剂量和高剂量Paxceed处理的tau Tg小鼠的MTs与假处理的tau-Tg小鼠相比显著增加（分别为32%和49%）(图2C类′)，总结如下图2F类因此，低剂量和高剂量的Paxceed通过稳定MT来纠正tau-Tg小鼠中的FAT缺陷。

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图2。

Paxceed处理的T44 tau Tg小鼠脊髓腹根的轴突变性和轴突MT。(一)一张典型的半薄切片显微照片显示了一只12个月大的非Tg小鼠的L5腹根，神经内均匀分布着规则的大小有髓轴突。然而，T44 tau Tg小鼠、假Tg小鼠和未经处理的Tg小鼠的腹根轴突形状不规则(B类和C类)在tau Tg小鼠中发现了一个显著的神经内间隙(C类). 与假处理和未处理的tau Tg小鼠相比，低剂量和高剂量Paxceed处理的tau-Tg小鼠的腹根含有形状更规则的轴突，神经内间隙更小(D类和E类). MTs（大箭头）和神经丝（小箭头）如插入(一′）在12个月大时，用不同剂量的Paxceed处理的T44 tau Tg小鼠与假处理和未处理的tau Tg鼠的腹根轴突的电镜观察(一′–E类′). M、 线粒体。[比例尺：一，10微米；一'，100纳米。](F类)总结五个治疗组MT密度的图表。n个= 3.^*,P（P）< 0.05;^**,P（P）< 0.01.

我们还测量了用两种不同剂量的Paxceed处理的tau Tg小鼠和用sham处理的Tg小鼠的腹侧脊髓根、脊髓和大脑中的微管蛋白种类。通过从腹根装载等量的蛋白质，并监测Western blot中的中等大小神经丝蛋白作为装载对照，我们比较了低剂量和高剂量巴克西处理的T44 tau Tg小鼠腹根中α-和β-微管蛋白的相对水平；结果表明，该水平与假处理tau Tg小鼠的水平相当(图3一和B类). 然而，使用两种剂量水平的Paxceed中的每一种处理的T44 tau Tg小鼠表明，与未经处理的tau Tg小鼠相比，大多数腹根节段中稳定的去酪氨酸化微管蛋白（Glu-Tub）水平显著增加(图3A、 B类、和C类). 最后，用两种不同剂量的巴克西处理的T44 tau Tg小鼠在脊髓或大脑中的动力蛋白、突触素、酪氨酸化或其他微管蛋白亚型的水平没有显示出可检测的变化(图3D类)与假手术治疗或未治疗的tau-Tg或非Tg小鼠相比。

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图3。

Paxceed处理的tau Tg小鼠腹根（VR）中稳定的去酪氨酸微管蛋白（Glu-Tub）增加。所示为12个月大时用不同剂量的Paxceed处理的T44 tau Tg小鼠与用sham处理的tau Tg鼠相比，其腹根、脊髓和大脑中蛋白质的定量Western blot分析。相同印迹中的中型神经丝（NFM）免疫带在治疗组中显示相同水平(赖特)和虚假处理(左侧)tau Tg小鼠(一). SC，脊髓。用低剂量和高剂量巴克西处理的T44 tau Tg小鼠腹根中的α-和β-微管蛋白水平与用低度处理的tau Tg小鼠相当(一和B类). 然而，经低剂量和高剂量Paxceed治疗的T44 tau Tg小鼠的大多数腹根节段中稳定的去酪氨酸微管蛋白（Glu-Tub(A–C; 仅显示了高剂量治疗的数据）。(D类)用不同剂量的Paxceed治疗的T44 tau Tg小鼠的脊髓未见明显变化(赖特)和大脑(左侧)与年龄匹配的假治疗对照Tg小鼠进行比较。AC-Tub，乙酰化微管蛋白；酪氨酸化微管蛋白。^*,P（P）< 0.05;^**,P（P）< 0.01.

因为球体是T44 tau Tg小鼠的主要tau病理(11,12)，我们确定Paxceed是否影响这些病变；我们在12个月大时观察到，与假手术治疗的T44 tau Tg小鼠相比，Paxceed小鼠的脊髓中它们的丰度没有降低(图4一和B类)，但在Paxceed处理的小鼠中，不溶性tau略有减少，tau磷酸化没有任何变化（见图6和支持文本，发布为支持信息在PNAS网站上）。因为T44τ-Tg小鼠随着年龄的增长会出现运动无力，这与τ聚集物增加、MT数量减少和FAT受损有关(11,12)，我们询问了服用Paxceed的T44 tau Tg小鼠是否表现出运动障碍的改善，并且我们观察到服用低剂量和高剂量Paxcede的tau Tg小鼠的运动障碍显著降低(P（P）= 0.0289;图5).

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图4。

Paxceed治疗的tau Tg小鼠脊髓中的tau球体数量无明显变化。使用多克隆抗金抗体17026对T44 tau Tg小鼠脊髓进行免疫组织化学分析，发现12个月大的小鼠脊髓中存在如方框所示的tau球体(一). 高倍显微照片插图在Paxceed处理和sham处理的Tg小鼠中，在tau球体中显示出强烈的tau免疫反应。[比例尺：一，100微米；插入，10μm]。定量（每段脊髓中τ球体的平均数量）显示，用巴克西德治疗的T44 tau Tg小鼠的脊髓中没有检测到τ球体变化(B类). 方差分析，P（P）= 0.5016.

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图5。

低（L）和高（H）剂量的Paxceed改善了tau Tg小鼠的运动行为。9-12个月大的非Tg（N-Tg）和T44 tau Tg小鼠，无论是否有Paxcept(n个=每组20人），由三名盲眼观察者评估运动障碍。Aχ²线性趋势测试表明，Paxceed改善了电机性能(P（P）= 0.0289).

讨论

这项研究提供了支持这一概念的实验证据(13)通过抵消神经退行性τ病小鼠模型中τ病理学的“功能丧失”效应，MT-稳定药物可能成为τ病患者的新型治疗干预手段。具体来说，尽管tau内含物可以通过取代细胞器、闭塞过程等损害神经元的存活能力，但tau在内含物中的隔离会耗尽功能性tau的神经元MT，从而导致MT解聚和FAT受损，从而导致受影响轴突的死亡(1,三,11,13). 在这里，众所周知的MT-稳定药物紫杉醇（Paxceed）纠正了FAT缺陷，增加了MT，增加了更稳定的Glu-Tub种微管蛋白的水平，并改善了接受治疗的tau-Tg小鼠的运动损伤。或者，巴克西德治疗可以保护轴突MTs免受τ丝积聚引起的损伤(14). 因为，Paxceed对FAT的改善并没有改变脊髓tau内含物的数量，所以MT解聚后的转运受损可能比tau球体更有害，至少在本文研究的疾病阶段是这样，但需要进一步研究来解决这些问题，鉴于神经退行性变机制的动态本质。

事实上，我们的数据表明，Paxceed在这些tau-Tg小鼠中的有益作用在机制上与MT的稳定有关，因为我们发现，在用两个剂量水平的Paxceed治疗的T44 tau-Tg小鼠的腹侧根轴突中，稳定的去酪氨酸微管蛋白（Glu-Tub）水平和MT数量增加。此外，由于在用Paxceed治疗的T44 tau Tg小鼠中，脊髓tau球体的数量没有明显变化，因此Paxcede对FAT和运动行为的有益影响并不取决于减少tau被隔离的聚集物的负担。相反，这些影响可能是Paxceed诱导MT稳定的结果，这抵消了隔离τ的功能损失。值得注意的是，这是指导治疗的一次成功尝试体内纠正与神经退行性变有关的疾病蛋白的功能丧失缺陷，而不是纠正疾病蛋白的“功能毒性增加”。虽然需要对中枢神经系统中的MT-稳定药物的药物生物学进行进一步研究，以充分说明Paxceed治疗在τ病小鼠模型中的有益作用，这里的数据对于设计AD和其他神经退行性tau病的治疗方法具有重要意义，因为它们证明了tau聚集的有害影响可以接受治疗干预，并且MT稳定是一种“可药用的”在没有毒性证据的MT-稳定化合物剂量下靶向tau病(20,21). 因此，根据本文提供的数据，我们得出结论，诸如帕克西等MT-稳定药物是值得进一步研究的候选化合物，可用于治疗神经退行性τ蛋白病患者，包括AD、，其中MT的稳定可能需要补充针对其他神经退行性变机制的其他新兴AD治疗。

补充材料

致谢

笔记

作者贡献：B.Z.、V.M.-Y.L.和J.Q.T.设计的研究；B.Z.、A.M.、S.S.、F.L.、G.M.-J.、J.B.和S.J.进行研究；P.M.T.提供了新的试剂/分析工具；B.Z.、E.B.L.、S.X.X.、V.M.-Y.L.和J.Q.T.分析数据；B.Z.、V.M.-Y.L.和J.Q.T.撰写了这篇论文。

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：AD、阿尔茨海默病；MT，微管；Tg，转基因；朊蛋白；FAT，快速轴突运输。

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