机构：NIH图书馆 以会员/个人身份登录

本条 摘要 全文 服务 提醒我该杂志的新期刊 请求版权许可

支持信息

本数据补充中的文件：

小鼠和胚胎。所有被分析的胚胎都来自F₁129/Sv和C57BL/6小鼠品系之间的杂交或这些F的回交产生₁小鼠对C57BL/6小鼠品系进行一代或两代。全部长x2^–/–经分析（>40）的胚胎在肝脏中表现出相同的表型。

免疫组织化学、抗体、组织化学和现场杂交。使用以下主要抗体进行免疫染色，如所述（1）：生物素化兔抗白蛋白（YNRMALBB，Accurate Chemicals）、大鼠抗E-cadherin（13-1900，Zymed）、兔抗AFP（Biomeda，A02）、兔抗体结蛋白（RB-9014-P1，NeoMarkers）、小鼠抗结蛋白（克隆DE-U-10，D1033，Sigma）、，兔抗胶原蛋白IV（T40263R，BioDesign，Kennebunk，ME），兔抗层粘连蛋白（L9393，Sigma），兔抗人细胞角蛋白（A0575，DAKO），大鼠抗PECAM-1（553371，Becton Dickinson Biosciences），小鼠Cy3-结合抗-一-平滑肌肌动蛋白（克隆1A4，C-6198，Sigma）和小鼠抗纤连蛋白（FBN11，Research Diagnostics，Flanders，NJ）。以下二级抗体用于免疫荧光：Cy3抗兔IgG（Jackson ImmunoResearch）、Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG1（Molecular Probes）和Alexa Fluor 488-驴抗鼠Ig G（Moleculer Probe）。生物素结合双花扁豆凝集素（DBA）购自安永实验室。白蛋白抗体和DBA采用亲和素生物素法（Vectastain ABC试剂盒，Vector Laboratories）和3,3'-二氨基联苯胺四氯化物（Sigma）作为色原进行检测，DAPI购自Boehringer Mannheim。为了揭示某些抗体的表位，用5米g/ml蛋白酶K（抗结蛋白抗体）或在0.2%CaCl中加入0.2%胰蛋白酶₂（抗人细胞角蛋白抗体）。

杂交前用蛋白酶K处理E13.5胚胎的肝脏切片。将抗结蛋白抗体（1:100）与抗地高辛抗体一起添加，并在4°C下培养过夜。随后清洗切片并用次级山羊抗鼠抗体（1:1000）孵育1小时就地如所述（2），使用快速红（罗氏）开发信号。

使用image pro plus软件（4.1版；Media-Controlnetics，Silver Spring，MD）对结蛋白阳性细胞进行定量。测量了来自两个独立实验的八个WT和突变肝脏切片上500×500像素区域的红色荧光强度，并将其表示为长x2^–/–肝脏与WT肝脏相比。

实时PCR分析和引物序列。根据制造商的说明，使用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）进行实时PCR分析。PCR产物由ABI PRISM 7000序列检测系统（Applied Biosystems）检测。被测基因的表达水平标准化为GAPDH的表达水平，并用另外两个看家基因证实：次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）和TATA-结合蛋白（TBP）（数据未显示）。我们应用比较CT方法，通过WT量化突变样本中mRNA的相对含量D类CT值作为校准器。P（P）使用学生的t吨测试。PCR分析中使用了以下引物：胶原蛋白1一（一） GATGACGTGCAATGCAATGCAAA（正向）和CCCTCGACTCTACATCTTCTGA（反向）；MMP13，GTTCAAGGAATTCAGTTTCTTTATGGT（正向）GGTAAGGCATCAAGGATG（反向）；MMP2、CCCTCAAGAGATGAAGATGCAGTTC（正向）和TCTTGGCTCCGCATGGT（反向）；MMP3、AGGAAATCCCACACTACAG（正向）和TTTTCAATGGCAGACACACAT（反向）；PDGF、GGTCCATGCACATACCAT（正向）和CCGTCCTGCTTGCAAACT（反向）；TGF公司b条1、GCCTGAGTGGCTGTCTTTTGA（正向）和GCTGAAATCGAAAGCCCTTTTA（反向）；TIMP1、GCATGGACATTTATTTCTCCACTGT（正向）和TCTCTAGGAGCCCCGATCTG（反向）；TIMP2，TTCCGGGAATGACATCTATGG（正向）GGGCCGTGTAGATAACTCGAT（反向）；TNF公司一GGGCCACCACGCTCTTC（正向）和GGTCTGGCACTAGACTGATG（反向）；脯氨酸-4-羟化酶、CCGGCGCTATCCA（正向）和AAGTAGAATCCATAAAACAA（反向）；和GAPDH、CGTGTTCCTACCCCAATGT（正向）和TGTCATCATACTGGCAGGTCT（反向）。使用了以下人类基因特异性引物：人类（h）胶原蛋白一1（I）、GGCTTCCCTGTTCCTGG（正向）和CCAGGGGGTCCAGCCAAT（反向）；hASMA、AGGCACCCTGAACCCCAA（正向）和CAGCACGCCGTGGATAGCC（反向）；hGAPDH、CCGTCTAGAAAACCTGCC（向前）和AGCCAAATTCGTCATACC（向后）。

1.Harlow，E.和Lane，D.（1999年）使用抗体：实验室手册（纽约州普莱恩维尤市冷泉港实验室出版社）。

2.Heckesher-Sorensen，J.&Sharpe，J.（2001）机械。开发。 100,59–63.