多巴胺能（DA）神经元被认为参与动机行为的认知和享乐基础(1–4). DA神经元在低频紧张活动和动作电位相突发之间的放电模式变化可能编码奖励预测错误和激励显著性(5). 与奖赏预测错误假说一致，DA神经元的放电活动被厌恶性刺激抑制(6). 然而，尚不清楚DA神经元的激活是否足以引发与奖励相关的行为。损伤、电刺激和精神药理学研究一直很重要，但无法对自由运动哺乳动物的DA神经元进行因果和时间上的精确控制；例如，电刺激不可避免地激活异质脑组织中的多种神经元，而药物刺激不允许在体内传递定义的DA神经元峰型。
为了选择性地控制DA神经元，我们使用了Cre诱导型腺相关病毒（AAV）载体(7,8)携带编码光激活阳离子通道视紫红质-2（ChR2）的基因，与增强型黄色荧光蛋白（ChR2-EYFP）融合(9–11). 为了确保在非靶向细胞类型中不会出现实质性的表达泄漏，我们设计了带有双floxed inverted open reading frame（ORF）的Cre-inducible AAV载体，其中ChR2-EYFP序列位于反义方向(). 将该载体立体定向传递到酪氨酸羟化酶（TH）的VTA，内部核糖体进入位点（IRES）-Cre转基因小鼠可实现ChR2-EYFP的DA神经元特异性表达。转导后，表达Cre的TH细胞以不可逆的方式转化ChR2-EYFP ORF，从而在强的组成活性延伸因子1a（EF-1α）启动子下激活持续的ChR2-E_YFP表达。
DA神经元特异性ChR2表达。(一)Cre-dependent AAV示意图；感兴趣的基因两侧有两组不相容的lox位点。在将ChR2-EYFP递送到THÉIRES-Cre转基因中后，ChR2-EYFP被反转以使其能够从EF-1α启动子转录。(B类)共聚焦图像显示TH神经元中细胞特异性ChR2-EYFP表达（绿色）（红色）。(C类)TH神经元的表达统计(n个= 491); 误差条代表整个SEM。(D类)标记的VTA DA神经元投射到下游脑区；ChR2 EYFP阳性轴突（绿色）支配NAc中的靶神经元（NeuN，红色）的共焦图像。
我们在体内验证了这种靶向策略的特异性和有效性。在转导THбIRES-Cre脑的冠状动脉VTA切片中，ChR2-EYFP与内源性TH特异性共定位(). 在病毒注射部位附近，90%以上的TH-免疫阳性细胞对ChR2-EYFP呈阳性反应，而总的阳性率超过50%，表明TH细胞具有高效的转导作用。在ChR2-EYFP表达细胞中，98.3±0.5%的细胞通过TH染色进行了联合标记()，显示出很高的特异性。表达稳定且持续至少2个月，表达ChR2-EYFP的神经元显示出强大的投射；EYFP阳性纤维在伏隔核下游丰富神经支配的局部神经元() (12).
为了评估转基因细胞的光遗传控制潜力，我们使用全细胞膜片钳测量ChR2表达的DA神经元的光诱导膜电流(). VTA中ChR2-EYFP表达细胞显示DA神经元的典型电生理特性，平均静息膜电位为-56.0±1.8 mV，平均膜电阻为372.3±19.3兆欧(n个=10个细胞），与之前报道的VTA DA神经元的值一致(13)表明仅表达ChR2并不影响其基本生理。在蓝光（473nm）照射下，所有打了补丁的细胞都表现出显著的向内光电流(;n个=10个单元格）。一连串的闪光驱动ChR2-EYFP神经元的动作电位放电；使用低和高光速，我们分别诱发了强直和相控DA神经元放电(). DA神经元通常不维持高频脉冲(14); 1到5赫兹的光脉冲可靠地驱动DA长神经元的棘波序列，而对于长序列，在20赫兹或更高频率下爆发，则在<50%的光脉冲中诱发动作电位(和图S1; 保持相控放电>15-Hz尖峰特性的脉冲可以通过使用高频光脉冲序列简单地触发）。光电记录证实，体内光刺激VTA DA神经元可诱发与VTA DA神经细胞胞外波形一致的宽棘波(6) (和图S2).
完整组织中DA神经元的光激活。(一)急性VTA切片中转导神经元的记录。记录的神经元通过细胞内染料负载进行验证（ChR2-EYFP，绿色；AlexaFluor 594，红色）。(B类)连续的蓝光（473纳米）激发内向的光电流。(C类)光电流特性概述(n个= 10). (D类)DA神经元的全细胞记录显示自发活动，以及分别由1Hz和50Hz闪光序列（25次闪光，每次闪光15毫秒）诱发的强直和相控放电。(E类)发光尖峰列车在一系列频率范围内都是可靠的；显示了指示频率（1至50 Hz）下25次闪光诱发的动作电位百分比(n个= 7). (F类)在显示光诱发DA棘波的转导THIRES-Cre麻醉小鼠中VTA DA神经元的体内optrode记录；看见图S2（插图）典型的三相DA细胞外尖峰。
接下来，我们通过条件位置偏好（CPP）范式测试了DA神经元相态活动的行为条件效应(和图S3)，使用相位光遗传刺激(15)DA神经元作为条件刺激(). 作为对照，我们将相对的腔室与相同数量的光脉冲配对，而不是以1Hz传输。小鼠接受2天的条件反射，通过比较在仪器的每个腔室中花费的时间来确定条件反射偏好。在第一轮实验中，小鼠在条件作用的第一天（第2天）在一个房间接受阶段性（50Hz光刺激）条件作用，在条件作用第二天（第3天）在另一个房间进行1Hz光刺激；使用两组小鼠，逆转房间刺激配对，以控制自发偏好转移(图S3). 通过几种措施，小鼠对与相位光刺激相关的腔室产生了明确的位置偏好(;P（P）<0.001（学生）t吨测试；n个=13只小鼠），两组小鼠均表现出这种条件偏好，与小室配对无关(图S5).
DA神经元的光激活诱导位置偏好。(一)CPP时间表（另请参阅图S3). (B类)光传输参数；以1分钟为周期，以1或50 Hz的频率闪烁25次(C类)光纤通过植入VTA上方的套管导管插入，以光激活DA神经元。(D类)显示条件偏好的代表性密度图；假彩色表示每个位置的持续时间。(E类)DA神经元调节的调节作用。（左）前测（白色）和后测（灰色）期间各室时间的比较。（右）实验的偏好得分的比较（Phasic Stim，n个=13）和对照组（无Stim控制，n个= 9; Littermate控制，n个= 9). n.s.表示不重要*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001. (F类)每个试验室的差异得分（计算为在指定试验室中进行试验前和试验后所用时间的差异）表明位置偏好发生了统计上显著的变化。(G公司)焦虑分析（房间中心的分数时间；n个= 13). (H（H）)试验前后，试验室进入、远程移动（不同的连续光束中断）和短程移动（相同光束的重复中断）(n个= 13).
我们进行了两类控制实验来验证结果。首先，非转基因同窝出生(n个=9）注射Cre依赖型ChR2-EYFP AAV，并接受与实验动物相同的刺激模式。另外，THIRES-Cre转基因小鼠(n个=9）注射Cre-dependent ChR2-EYFP AAV，但在条件反射期间未接受任何光学刺激，以进一步控制自发偏好转移。对照组均未表现出显著的CPP(正确的，P（P）>学生的0.5t吨测试）。此外，我们没有发现焦虑相关行为有任何显著变化()或在运动活动中()在偏好测试和野外测试期间(图S6).
接下来，我们测试观察到的CPP效应是由于50Hz刺激的食欲效应还是1-Hz刺激的厌恶效应。我们在两个独立的队列中比较了无刺激的每种放电方式的效果。与之前的CPP实验一致()时相队列在条件反射后对刺激室表现出明显的位置偏好()，从预测试期间的251±28秒到后测试期间的522±63秒(n个=7只小鼠；P（P）<0.05，学生的t吨测试）。然而，1-Hz队列(n个=6）对1Hz刺激室没有位置厌恶（相反，显示出对1Hz位置偏好的趋势；). 我们假设，在相位队列中观察到的CPP效应可能是由于50Hz光刺激触发的更大的瞬态DA释放所致。因此，我们使用体内快速扫描循环伏安法（FSCV）(16,17)检测DA瞬态。将光纤保持在VTA中，我们在NAc（VTA DA投影的主要目标之一）中植入了一个碳纤维电极，用于测量DA信号(). 尽管共享相同的总照明持续时间和闪光次数（1 Hz或50 Hz时25个15 ms闪光），但50Hz光列引发更大的DA瞬态(). 事实上，对于50 Hz和1 Hz的刺激，NAc中的平均峰值DA瞬态浓度分别为75.9±24.5 nM和1.3±0.8 nM(); 前者类似于自然反应触发的多巴胺瞬变的幅度(16)而在慢性1-Hz刺激期间DA的积累仍然很低(图S7; 从理论上讲，这种程度的DA仍可能导致行为改变）。
相控多巴胺神经元刺激导致短暂多巴胺释放和位置偏爱。(一和B类)相位（50 Hz）（A）和紧张（1 Hz）（B）刺激对位置偏好的影响。（左）偏好测试期间在每个腔室中花费的时间。（右）偏好分数的比较；对于A，n个=7，对于B，n个= 6. *P（P）< 0.05. (C类)使用相位控制、强直控制和非关联控制的差异分数检查刺激频率的相对影响（与)队列。(D类)VTA刺激的FSCV测量——在麻醉THÉIRES-Cre小鼠的NAc中触发瞬时DA释放。（上图）VTA相位（每50 Hz 25次闪光）和强直（每1 Hz 16次闪光）刺激期间的代表性伏安曲线。（插图）背景-从刺激峰提取伏安图，通过与体外获得的DA伏安图进行比较，表明所测信号为DA。（底部）在20秒间隔内记录的所有背景伏安图。年轴为外加电势(E类应用程序与Ag/AgCl参比电极）；x个轴是记录每个伏安图的时间。电极上的电流变化用颜色编码。在特征～0.650 V（氧化峰编码为绿色）和电压扫描结束时介于～−0.20 V和～−0.25 V之间的刺激期间可以看到DA。（E） 相位和强直光诱发DA瞬变的比较(n个= 3).
啮齿动物学会将刺激的效果与环境联系起来，并随后表现出对环境的条件性位置偏好(18). 以前的研究已经证明DA在显著信号处理中的重要作用(19)和目标导向行为(20). 然而，目前尚不清楚是否需要同时使用其他电路和神经递质系统(21)不同神经元类型的特定活动模式是否足以影响位置偏好。为了能够直接测试相位DA神经元放电对行为条件反射的作用，我们开发了一个通用的Cre诱导基因表达系统，以将转基因表达强度与细胞类型特异性启动子（通常太弱，无法驱动视蛋白的功能性表达）分离。通过使用该系统，我们用CPP范式中定义的刺激模式选择性地调节DA神经元的活动，发现相刺激足以在没有其他奖励的情况下建立位置偏好。这些结果确立了特定细胞类型中定义的尖峰模式在行为条件作用中的因果关系；当然，即使是单个细胞类型也可以释放多种神经递质和神经调节剂（例如，VTA DA神经元主要释放DA，但也可以释放其他神经递质，如谷氨酸），并将通过多种不同的下游细胞类型发挥作用。事实上，光遗传学方法与电生理学、行为学和电化学读出方法相结合，为探索DA神经元与其他神经调节电路之间因果、时间精确和行为相关的相互作用打开了大门(22–25)包括在神经精神疾病中起重要作用的单胺类和阿片类回路(26–28). 在识别候选交互神经传递系统的过程中，下游神经电路效应器(29)以及与行为和相关回路动力学相适应的时间尺度上的亚细胞生化机制，继续利用光遗传学控制的特异性和时间精度将是重要的(30).
