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分子生物学细胞。2004年11月；15(11): 4829–4840.
数字对象标识：10.1091/桶。E04-06-0477号
预防性维修识别码：项目编号：524731
PMID：15331765

氧化应激中伴侣介导的自噬激活D⃞

罗伯塔·基芬,* 克里斯托弗·克里斯蒂安,* 埃尔文·克内赫特,†和安娜·玛丽亚·库尔沃*‡
詹妮弗·利平科特·施瓦茨，监控编辑器
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摘要

氧化损伤的蛋白质随着年龄的增长在几乎所有细胞类型和组织中积累。伴侣介导的自噬（CMA）是溶酶体中细胞溶质蛋白降解的选择性途径，其活性随着年龄的增长而降低。我们分析了CMA可能参与去除大鼠肝脏和培养的小鼠成纤维细胞中的氧化蛋白。除此之外，CMA底物在氧化后更有效地内化到溶酶体中，我们还发现CMA在氧化应激期间的结构性激活。氧化诱导的CMA活化与溶酶体易位复合体的几个成分的高水平相关，但尤其是底物摄取所需的管腔伴侣蛋白，以及溶酶体膜蛋白（lamp）2a型（先前被确定为该途径的受体）。与营养应激期间CMA激活的特征明确的机制（不需要从头合成受体）不同，CMA的氧化诱导激活是通过lamp2a的转录上调实现的。我们的结论是，CMA在氧化应激期间被激活，并且在这些条件下，该途径的更高活性，以及氧化蛋白被溶酶体吸收的更高敏感性，都有助于有效去除氧化蛋白。

简介

氧化蛋白的积累是衰老细胞的常见特征(邓禄普等., 2002;格伦和戴维斯，1997年; Grune公司等.,2001,2002年b;斯塔特曼，2001). 许多生理和病理过程都会导致自由基的产生和细胞内成分（包括蛋白质）的损伤。在大多数这些氧化事件中，受损蛋白质通过蛋白酶降解而从细胞中清除(邓禄普等., 2002). 不同细胞内蛋白水解酶系统的活性随着年龄的增长而降低(特曼，1995年;Cuervo和Dice，1998年a;弗里格等., 2000;卡拉尔等., 2002;多纳蒂等., 2001;Merker公司等., 2001;弗里格，2002年;凯勒等., 2002;沃德，2002年)这种受损的活性被认为是导致老生物体氧化蛋白去除不足的原因(格伦，2000;Merker和Grune，2000年;邓禄普等., 2002;斯威达等., 2002).

氧化蛋白对蛋白酶的敏感性随氧化损伤的持续时间和程度而变化(邓禄普等., 2002;Mehlhase和Grune，2002年). 因此，轻度氧化诱导部分蛋白质去折叠并促进蛋白水解裂解（格伦等.,1995,1997). 然而，由于暴露在疏水性氨基酸斑块中，持续或广泛的氧化损伤通常会促进蛋白质聚集。一旦蛋白质聚集，它就不太容易被蛋白水解分解(霍夫等., 1993;格鲁内等., 1997;戴维斯，2001;Demasi和Davies，2003年). 使用不同类型的蛋白酶分析了体外氧化蛋白质的降解动力学(Merker和Grune，2000年;邓禄普等., 2002;斯威达等., 2002). 蛋白酶体是这方面分析最广泛的蛋白酶之一。虽然大多数将蛋白酶体与氧化蛋白质降解联系起来的研究都是在体外进行的(里维特，1985年;戴维斯，2001)最近的证据也支持蛋白酶体参与体内氧化蛋白质的去除(霍斯勒等., 2003;施林加尔普尔等., 2003). 因此，用蛋白酶体抑制剂或反义寡核苷酸处理培养细胞以对抗必需蛋白酶体亚单位会导致细胞内氧化蛋白的积累，并降低氧化应激期间的细胞存活率。蛋白酶体对大多数氧化蛋白的降解与ATP和泛素无关(Shringarpure公司等., 2003)这表明蛋白质表面疏水区域的暴露是该蛋白酶的识别信号。

溶酶体系统是细胞中另一个主要的蛋白水解酶系统，由于缺乏选择性，通常不被认为是去除氧化蛋白质的可能候选系统。在哺乳动物细胞中，三种不同的主要机制有助于溶酶体内细胞内成分的降解（自噬）(骰子，2000;雷吉奥里和克林斯基，2002年;Wang和Klinsky，2003年; 库尔沃，2004年a,b条). 其中两种机制，即宏观自噬和微观自噬，导致溶酶体腔中细胞质完整区域的降解，包括细胞器。尽管这些自噬途径对细胞器的降解是有选择性的（即特定地去除受损的线粒体而保留正常功能的线粒体）(柠檬汁等., 2002)，没有证据支持可溶性细胞溶质蛋白降解的选择性。相反，第三种形式的自噬的主要特征是伴侣介导自噬（CMA），它对通过该途径降解的底物（细胞溶质蛋白）具有选择性(Cuervo and Dice，1998年b;骰子，2000;骰子等., 2003).

CMA是一种普遍存在于大多数细胞类型和组织中的自噬形式(梅西等., 2004). 迄今为止所描述的所有CMA底物蛋白都是可溶性细胞溶质蛋白，其中含有与五肽KFERQ生物化学相关的靶向基序(Chiang和Dice，1988年;骰子等., 2003). 该基序存在于细胞溶质中约30%的蛋白质中，由细胞溶质伴侣识别，该伴侣是73 kDa的热休克同源蛋白（cyt-hsc70）(Chiang和Dice，1988年;蒋介石等., 1989). 与该伴侣的相互作用，由hsc70耳蜗调节(Agarraberes and Dice，2001年)，将底物靶向溶酶体膜，在那里与溶酶体薄膜蛋白（lamp）2a型相互作用(Cuervo和Dice，1996年). 在转移到溶酶体腔之前，底物需要展开，已经提出了一些与溶酶体膜相关的细胞溶质伴侣来帮助展开(Agarraberes and Dice，2001年). 底物的移位需要溶酶体腔中存在hsc70的变体lyshsc70(阿格拉贝雷斯等., 1997;库尔沃等., 1997)然后由常驻溶酶体蛋白酶对底物进行快速蛋白水解（溶酶体腔半衰期为5-10分钟）。

虽然大多数细胞中可能存在一些基本水平的CMA活性，但营养应激已被证明能最大限度地激活这一途径(机翼等., 1991;库尔沃等., 1995). 营养剥夺期间的激活与溶酶体腔中较高水平的lys-hsc70和溶酶体膜上lamp2a有关(库尔沃等., 1995;琼脂等., 1997;Cuervo and Dice，2000年b). 由于底物蛋白与lamp2a的相互作用是该途径的限制步骤，因此溶酶体膜上lamp2a水平的变化调节CMA活性（Cuervo和Dice，2000亿,c（c）). 有趣的是，所有已知激活CMA的条件下，lamp2a溶酶体水平的上调并不需要蛋白质的从头合成，而是通过下调其降解并将一部分蛋白质从溶酶体腔重新定位到膜中来实现的(Cuervo and Dice，2000年b).

除饥饿外，在大鼠肝脏和肾脏中还观察到接触汽油衍生物后CMA的激活(库尔沃等., 1999); 在缺乏保护性蛋白/组织蛋白酶A的半乳糖唾液酸沉积症患者的成纤维细胞中(库尔沃等., 2003); 细胞内lamp2a过表达(Cuervo和Dice，1996年). 肾小管细胞生长期间CMA活性降低(法郎等., 2001)和衰老(Cuervo和Dice，2000a). 老年细胞中CMA活性的降低，已知其会积累氧化蛋白(Cuervo和Dice，2000a)再加上在有毒暴露期间激活CMA会导致被有毒化合物改变的蛋白质选择性降解(库尔沃等., 1999)我们发现，在抗氧化剂存在的情况下，CMA对核因子κB抑制剂的降解减少(库尔沃等., 1998)促使我们分析了CMA在去除细胞氧化蛋白中的可能作用。我们在这项工作中表明，CMA底物的氧化有助于它们通过CMA转移到溶酶体中降解，并且CMA本身在氧化应激期间被激活。出乎意料的是，氧化应激介导的CMA活化是通过一种新的机制实现的，这不同于以往针对营养应激的特征鲜明的CMA激活。

材料和方法

动物和细胞

雄性Wistar大鼠（200-250克）被随意喂食或在献祭前饥饿20或48小时。使用年龄控制大鼠品系（Fisher 344）研究年龄相关变化，并对3、12和22月龄大鼠进行比较。通过两次腹腔注射百草枯（40 mg/100 g体重），隔开24 h，在大鼠体内诱导轻度氧化应激。最后一次注射后24 h进行溶酶体分离。小鼠成纤维细胞（NIH3T3）来自美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）。细胞保存在DMEM（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）中，含有10%的新生小牛血清。为了去除血清中的细胞，用Hanks的平衡盐溶液（Invitrogen，Carlsbad，CA）广泛清洗平板，并添加不含血清的新鲜培养基。通过补充100μM H的培养基在培养细胞中诱导轻度氧化应激2O（运行）2或40μM百草枯1 h。去除氧化化合物后12–24 h进行分析。

化学制品

化学物质和抗体的来源如前所述(Cuervo和Dice，1996年;库尔沃等., 1997;Cuervo和Dice，2000a;马丁等., 2002). 我们实验室制备了针对大鼠和小鼠lamp2a和lamp2c细胞溶质尾部的抗体(Cuervo和Dice，1996年; Zhang、Bandhyopadhyay、Kiffin、Massey和Cuervo，未公开数据）。针对小鼠lamp1（1D4B）的抗体来自发育研究杂交瘤银行（爱荷华州爱荷华市爱荷华大学），针对hsp90（SPA-845）、hsp72（SPA-810）、hsp40（SPA-400）、hip（SPA-766）和Bag-1（AAM-400E）的抗体来自Stressgene Biotechnologies（Victoria，BC，Canada）。使用Chemicon International（加州特梅库拉）的OxyBlot氧化蛋白检测试剂盒检测氧化蛋白中的羰基。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和核糖核酸酶A（RNase A）用放射标记[14C] 如前所述，甲醛通过还原甲基化(Jentoft和Dearborn，1983年). 培养中的小鼠成纤维细胞的细胞质蛋白通过与[14C] 亮氨酸（2μCi/ml）在37°C下持续2天(库尔沃等., 1997). 细胞被氮空化破坏，细胞溶质部分是10万倍离心的上清液克在4°C下保持1小时。在分离前，用不同的促氧化剂处理细胞24小时，通过相同的程序制备氧化放射性标记的细胞溶质蛋白。

溶酶体组分的分离

大鼠肝溶酶体是从一个轻线粒体溶酶体组分中分离出来的，呈不连续的甲硝胺密度梯度(瓦蒂奥等., 1978). 如前所述，分离具有不同CMA活性的溶酶体组分(库尔沃等., 1997). 如前所述，从培养细胞中分离溶酶体(Storrie and Madden，1990年). 含有超过10%破碎溶酶体（以β-己糖胺酶潜伏期衡量）的制剂被丢弃。低渗性休克后分离溶酶体基质和膜(Ohsumi公司等., 1983).

分离溶酶体对蛋白质的吸收和降解

GAPDH或RNase A在MOPS缓冲液（10 mM 3）中培养-(N个-吗啉基）丙基磺酸[MOPS]pH 7.3，0.3 M蔗糖）与凝乳抑素处理的溶酶体，如前所述(库尔沃等., 1997). 在对样品进行蛋白酶K处理、SDS-PAGE和免疫印迹后，以与蛋白酶耐药溶酶体相关的GAPDH的量来测量转运。在另一组实验中，为了克服氧化蛋白对蛋白酶K的蛋白水解敏感性的任何可能变化，底物与凝乳抑素处理或未处理的溶酶体孵育，摄取量计算为溶酶体相关底物（凝乳抑素酶处理溶酶体）的量之差以及与膜结合的底物的数量（未经处理的溶酶体）(萨尔瓦多等., 2000). 的降级[14C] GAPDH（260 nM；1.5×108dpm/nmol）[14C] 核糖核酸酶A（150 nM；0.9×108dpm/nmol），或通过完整溶酶体或溶酶体基质测量放射性标记的细胞溶质蛋白池（500dpm/μg），如前所述(Terlecky和Dice，1993年;库尔沃等., 1997). 在37°C的MOPS/二硫苏糖醇（DTT）缓冲液（10 mM MOPS pH 7.3，0.3 M蔗糖，5.4μM半胱氨酸和1 mM DTT）（对于完整溶酶体）或0.03 M蔗糖（对于溶酶体基质）中培养30分钟后，样品在10%三氯乙酸中沉淀并通过多屏幕分析系统过滤（Millipore，Bedford，MA）使用0.45μm孔隙过滤器。在WinSpectral 1414液体闪烁分析仪（PerkinElmer Life and Analytical Sciences，Boston，MA）中，通过使用外部标准进行淬火校正，将流经过滤器和过滤器中的放射性转换为每分钟崩解数。蛋白质分解表示为孵化结束时，初始酸不溶放射性（蛋白质）转化为酸溶放射性（氨基酸和小肽）的百分比。

如前所述，使用针对lamp2a细胞溶质尾部的特异抗体进行免疫印迹，以跟踪分离膜中lamp2a的降解率(Cuervo and Dice，2000年b). 简单地说，将分离的溶酶体膜在37°C的MOPS缓冲液中培养，在不同的时间取出等分样品并进行SDS-PAGE和lamp2a免疫印迹。

GAPDH氧化

金属催化氧化兔肌肉d日-如前所述进行甘油醛-3-磷酸脱氢酶EC 1.2.1.12（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）(里维特和莱文，1990年). 用50体积的HEPES缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.2，100 mM KCl，10 mM MgCl）透析GAPDH（10 mg蛋白质）2)是否添加25 mM抗坏血酸和0.1 mM氯化铁（模拟）三37°C时。停止氧化反应，添加1 mM EDTA，样品在HEPES缓冲液中透析24 h，共有四个变化。用1 mM EDTA补充前两个变化。通过测量GAPDH暴露于氧化剂混合物中不同时间后的酶活性来监测氧化效率。如中所述图2GAPDH与氧化剂混合物孵育30分钟，其酶活性降低70%。

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CMA底物的氧化促进溶酶体对其的吸收。（A） GAPDH暴露于抗坏血酸/铁氧化反应中30分钟，如下所述材料和方法未经处理的GAPDH（CTR）和暴露于氧化剂混合物（ASCORB/FeCl）的GAPDH的剩余比酶活性三)或仅显示透析缓冲液（MOCK）。数值为两种不同制剂的平均值±SE，并进行了三次测量。（B） 将未修饰的GAPDH（Ctr）或GAPDH暴露于氧化剂混合物中指定的时间段，在标准条件下与从20小时饥饿大鼠分离的完整的凝乳抑素处理的肝溶酶体孵育30分钟。如有指示，用蛋白酶K处理样品，以去除与溶酶体膜细胞溶质侧结合的GAPDH。培养结束时，通过离心收集溶酶体，并进行SDS-PAGE和GAPDH免疫印迹。（C） 将A中描述的不同形式的GAPDH（50μg）分别与溶酶体酶（断裂溶酶体的25μg蛋白质；pH 4.5）（左）或蛋白酶K（0.1μg）（右）在37或0°C下培养。在指定的时间取出小份样品，并进行SDS-PAGE和考马斯蓝染色。值是来自三个不同实验的GAPDH密度测定值的平均值+SE。（D） 小鼠成纤维细胞被代谢标记为[三H] 将一组成纤维细胞暴露于100μM H2O（运行）2（左）或40μM百草枯（Pq）在标记期间保持1小时。空化后，未经处理（Ctr）和H的细胞溶质部分（Cyt）2O（运行）2制备或百草枯处理过的成纤维细胞，并在37°C下与完整的大鼠肝脏溶酶体（25μg蛋白质）或低渗性休克破坏的溶酶体在标准条件下孵育30分钟（溶酶体破裂；15μg蛋白）。孵育结束时，蛋白质水解被计算为酸可沉淀放射性（蛋白质）转化为酸溶性（氨基酸和小肽）的量。值是六个不同实验的平均值+SE(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

免疫细胞化学染色

按照常规程序对培养细胞进行免疫荧光研究(Cuervo和Dice，2000年c). 在盖玻片上生长的细胞，直到汇合，并在有或无血清的条件下保存20小时，用3%甲醛溶液固定，封闭，然后用原代和相应的异硫氰酸荧光素或Cy5结合二级抗体培养，如前所述(Cuervo和Dice，2000年c). 安装介质含有4,6-二氨基-2-苯基吲哚染色，以突出细胞核。使用Axiovert 200荧光显微镜（纽约桑伍德卡尔蔡司）采集图像，并使用制造商的软件进行反褶积。使用MetaMorph（宾夕法尼亚州唐宁镇通用成像公司）测定颜色。所有数字显微图像均使用Adobe Photoshop 6.0软件（Adobe Systems，Mountain View，CA）制备。

mRNA定量

按照制造商的指示，使用RNeasy protect迷你试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN）从大鼠肝脏中提取总RNA，并在-80°C下保存直至使用。第一链cDNA由1μg总RNA与SuperScript II RNase H逆转录酶（Invitrogen）和寡核苷酸（dT）合成12–18底漆。采用SYBR绿色聚合酶链反应（PCR），用特异性引物（lamp2a，5′-GTCCAAGCGCCATCATACT-3′[forward]和5′-TCCAGAGTCTGTTAAGTAGC-3′[reverse]；actin，5′-AAGGATCTATAGTGGTGACGAGAGA-3′[fronte]和5’-ATCTCCATGTCGCCAGTG-3′[revere]）扩增lamp2a和actin外显子5的一个区域工具包（PE Biosystems，英国沃灵顿）。在光循环器（SmartCycler；Cepheid，Sunnyvale，CA）中实时测量lamp2a和actin DNA产物的扩增（分别为120和108 bp）。对于这两个基因，通过琼脂糖凝胶电泳和分析逆转录-PCR反应的熔化曲线来验证是否存在单一扩增产物。将不同样品中lamp2a的表达水平相对于相同样品中肌动蛋白的表达水平进行归一化。根据循环数的差异计算样品之间的差异，以达到一定的荧光强度水平。由于扩增片段的大小非常相似，我们不需要校正片段长度。使用相同的引物进行标准PCR，但增加cDNA池的稀释度。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳和密度测定。根据同一样品的肌动蛋白产物的强度，对lamp2a产物的密度测定强度进行归一化。

一般方法

蛋白质浓度采用Lowry法测定(劳里等., 1951)以牛血清白蛋白为标准。如前所述测量溶酶体酶活性(Storrie and Madden，1990年). SDS-PAGE后(莱姆利，1970年)和免疫印迹(拖车箱等., 1979)，通过化学发光方法（Renaissance；PerkinElmer Life and Analytical Sciences）对特异性抗体识别的蛋白质进行可视化。按照制造商的建议，使用DNP部分的抗体通过免疫印迹与DNPH衍生后，可观察到氧化蛋白。使用图像分析仪系统（S1800；Inotech，Sunnyvale，CA）对免疫印迹膜和染色凝胶进行密度定量。学生的t吨检验用于统计分析。

结果

溶酶体中的氧化蛋白质

为了测试溶酶体系统，特别是CMA在去除氧化胞浆蛋白中的作用，我们首先分析了氧化应激后溶酶体中存在的这些蛋白。我们用博来霉素，1，1′-二甲基-4，4′-联吡啶二氯化物（百草枯）治疗大鼠，这是一种具有良好抗氧化作用的超氧化物生成药物(Haly，1979年). 为了验证百草枯对大鼠肝脏的氧化作用，我们比较了未经治疗和百草枯治疗的大鼠胞浆中羰基蛋白的含量(图1A，车道1和2）。虽然在未经治疗的大鼠的细胞液中可以观察到一些氧化蛋白，但我们发现连续两天注射亚致死剂量百草枯的大鼠细胞液中这些修饰蛋白的含量显著增加。对CMA有活性的溶酶体可以从大鼠肝脏中分离出来，因为它们的内腔伴侣lys-hsc70含量高，是底物摄取所必需的(库尔沃等., 1997). 当我们从治疗和未治疗的大鼠中分离出这种特殊的溶酶体群体，并从其内腔内容物中分离出其膜时，我们在百草枯治疗大鼠溶酶体的膜和内腔部分中都发现了含羰基的蛋白质(图1A，将车道3和5与车道4和6进行比较）。用1 M NaCl清洗溶酶体膜，释放出大部分氧化蛋白质(图1A，通道7和8），表明它们可能是与膜相关的细胞溶质蛋白，而不是整体溶酶体膜蛋白氧化的结果。同样，当我们在电泳前将溶酶体基质培养在37°C以促进溶酶体腔中非溶酶体蛋白的降解时，该组分中的氧化蛋白水平急剧下降(图1A，第9和第10车道）。注意，百草枯处理动物在37°C孵育后，基质中检测到的新的低分子量条带可能是新分离基质中检测出的蛋白质的蛋白水解产物。这些结果支持了溶酶体内检测到的氧化蛋白很可能是在那里被降解的非溶酶体蛋白。有趣的是，尽管它们来源于细胞溶质，但与溶酶体部分相关的氧化蛋白的电泳模式与细胞溶质中的不同。由于在膜相关蛋白中也观察到了这些差异，我们不认为它们是由于某些氧化蛋白对蛋白酶的不同敏感性所致；相反，我们认为这表明一部分氧化蛋白被溶酶体选择性吸收。

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溶酶体中的氧化蛋白对CMA具有活性。（A） 从未经治疗或百草枯（PQ）治疗的大鼠肝脏中分离的富含hsc70的溶酶体在低渗休克后分离出的细胞溶胶（20μg蛋白质）和溶酶体膜和基质（10μg蛋白）进行衍生化，并进行SDS-PAGE和2,4-二硝基苯肼（DPNH）部分的免疫印迹。为了显示所有通道中的蛋白质模式，通道1和2的暴露时间比其他通道短5倍。通道7和通道8是通道3和通道4的重复样品，在衍生化之前用1 M NaCl清洗膜。通道9和10是通道5和通道6的重复样品，在衍生化之前，基质在37°C下培养20分钟。省略衍生化后，在相同样品中未检测到条带（我们未公布的数据）。（B） 从3个月龄、9个月龄和22个月龄大鼠的肝脏中分离出细胞溶胶（40μg蛋白质）和溶酶体基质（20μg蛋白）。这些组分中氧化蛋白的含量如A所示进行分析。1–3车道的暴露时间比4–6车道短3倍。第7和第8道显示的样本与第5道相同，分别衍生或未衍生DPNH和免疫印迹。胶片曝光过度（5道曝光的8倍），以显示抗体未特异识别的蛋白质带含量低。

如前所述，即使不使用促氧化剂治疗，也可以在正常肝脏中检测到氧化蛋白，其含量随着年龄的增长而增加(图1B). 当我们分析氧化蛋白与3个月龄和9个月龄大鼠肝脏溶酶体的相关性时，我们发现溶酶体腔中氧化蛋白的含量随着年龄的增长而增加，类似于细胞溶质中的氧化蛋白含量(图1B，比较车道1和2以及4和5）。相反，在最老的动物（22个月大）中，我们之前描述过CMA活性严重下降(Cuervo和Dice，2000a)尽管细胞溶质组分中氧化蛋白的含量较高，但溶酶体中检测到的氧化蛋白的数量按比例低于9月龄动物(图1B，比较车道5和6）。与上述类似的分析证实，氧化蛋白是溶酶体外来源的，可以被溶酶体蛋白酶降解（我们未公布的数据）。的最后一个面板图1B显示了这些研究中使用的抗体对羰基的特异性，在非衍生样品中，羰基仅与单个蛋白质发生弱交叉反应（衍生样品（7道）和非衍生样品（8道）中的比较信号）。尽管大自噬，一种非选择性的自噬形式，也会随着年龄的增长而减少(特曼，1995年;多纳蒂等., 2001)事实表明，所分析的溶酶体群体对CMA非常活跃，并且在溶酶体中只检测到一部分氧化蛋白，这鼓励我们分析CMA在去除氧化蛋白中的作用。

CMA基板的氧化

我们首先分析了已知CMA底物的氧化是否有助于CMA降解它们。我们氧化了GAPDH，一种特性良好的CMA基底(安尼托等., 1993)通过将该蛋白质与抗坏血酸/铁氧化混合物孵育。与该混合物孵育30分钟后，约70%的GAPDH活性丧失(图2A)和羰基很容易在纯化蛋白中检测到（我们未发表的数据）。我们之前优化了一个体外系统，该系统允许分析分离溶酶体对CMA底物的结合和摄取(安尼托等., 1993; 库尔沃等.,1997,1999). 当我们比较未经处理的GAPDH与溶酶体的相关性或暴露在氧化混合物中时间延长的GAPDH，我们发现结合到溶酶体膜并转运到溶酶体腔（蛋白酶K抗性）的蛋白质数量增加，GAPDH的氧化时间延长(图2B). 卵清蛋白是一种不含KFERQ样基序的蛋白质，因此不是CMA底物，其氧化并没有增加其与溶酶体的联系（我们的未发表数据）。在溶酶体腔中检测到的较高量的GAPDH也可能是由于氧化蛋白对溶酶体蛋白酶或蛋白酶K降解的抵抗力增加，蛋白酶K去除了与溶酶体膜胞质侧相关的蛋白质。但是，如所示图2C氧化蛋白更容易被位于溶酶体腔中的蛋白酶池和外源添加的蛋白酶K降解。

当我们不使用特定的CMA底物时，氧化蛋白的溶酶体易位增加也很明显，我们比较了氧化细胞溶质蛋白池的降解，其中约30%是可能的CMA基质（包含KFERQ相关基序）(图2D). 从暴露于H的成纤维细胞分离的放射性标记细胞溶质蛋白2O（运行）2(图2D，左）或百草枯(图2D与未经处理的成纤维细胞中的细胞溶质蛋白相比，与完整的大鼠肝溶酶体孵育时，其降解速度更快。因为当溶酶体膜在与细胞溶质蛋白孵育之前被破坏时，这些差异会大大减少，从而使蛋白酶可以自由进入底物，所以我们得出结论，如GAPDH所示，氧化蛋白的降解增加是因为它们通过CMA进入溶酶体的易位率较高。这些结果支持CMA底物蛋白质的氧化通过这一途径促进其降解。

氧化应激中CMA的激活

与氧化对CMA底物的影响无关，这使它们更容易通过此途径降解，我们发现CMA在氧化应激期间的结构性激活。我们从连续两天接受亚致死剂量百草枯治疗的大鼠中分离出溶酶体，以产生轻度氧化应激反应。在这些条件下，通过测量β-己糖胺酶潜伏期，我们没有发现溶酶体膜稳定性与对照组有显著差异（补充图1）(Storrie and Madden，1990年)和溶酶体外蛋白水解活性(安尼托等., 1993). 从暴露于百草枯的大鼠中分离的溶酶体比从未经处理的动物中分离的溶酶体降解更多未修饰的GAPDH(图3A，左）。RNase A（另一种特征良好的CMA底物）也观察到类似的结果(Terlecky和Dice，1993年;库尔沃等., 1994) (图3A，右侧）。在这两种情况下，如果溶酶体膜被破坏，则不再观察到底物降解的增加。事实上，在百草枯处理的动物中，溶酶体蛋白酶对两种底物的降解都略低。如前所述，这种减少可能是由于氧化应激期间某些溶酶体蛋白酶活性降低所致(奥尼尔等., 1997;卡尔，2001;克拉布等., 2002). 无论如何，百草枯处理动物的完整溶酶体底物降解能力较高，这是溶酶体腔中结合/摄取增加的结果，而不是较高的蛋白水解。

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轻度氧化应激对CMA底物蛋白和溶酶体的加性效应。（A） 的降级[14C] GAPDH（左）和[14C] 从百草枯治疗的大鼠分离的溶酶体中的核糖核酸酶A（右），如下所述材料和方法.孵化按照图2D值是五到八个不同实验的平均值+SE(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。（B） 放射性标记细胞溶质蛋白的降解图2D来自未经处理的成纤维细胞（对照组）或来自暴露于H2O（运行）2（左）或百草枯（右），通过未经治疗的大鼠（溶酶体对照）或使用百草枯治疗的大白鼠（溶菌体PQ）的完整肝脏溶酶体，如下文所述材料和方法蛋白质水解的计算方法如下图2D值为六个不同实验的平均值+SE。*，与溶酶体对照相比的差异；+，与细胞质控制相比的差异；†，溶酶体和胞浆控制与溶酶体及胞浆处理的差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

然后，我们确定氧化应激是否可以通过作用于两种底物，增加其被溶酶体吸收的能力，以及作用于溶酶体，增加其吸收底物的能力，从而增加CMA介导的蛋白质降解。为此，我们首先验证了如上所述的GAPDH和RNase A，未经处理的成纤维细胞的细胞溶质蛋白更容易被百草枯处理的大鼠的完整溶酶体降解，而不是被未经处理大鼠的溶酶体分解(图3B). 然后，我们分析了溶酶体和细胞溶质蛋白结合后对前氧化剂的影响。当我们将百草枯处理大鼠的溶酶体与H处理的成纤维细胞分离的细胞溶质蛋白孵育时2O（运行）2(图3B，左）或使用百草枯(图3B（右），我们发现这些蛋白质降解得更快。我们使用从H分离的溶酶体获得了类似的结果2O（运行）2处理过的成纤维细胞（我们未发表的数据）。基于这种加性效应，我们得出结论，不仅是氧化诱导底物蛋白的变化，而且是溶酶体室的变化，是氧化应激期间CMA发生率较高的原因。

我们通过分别分析从百草枯治疗大鼠分离的溶酶体对未修饰底物蛋白的结合和摄取，进一步分析了氧化应激期间CMA的激活。在这些研究中，为了消除外源蛋白酶清除溶酶体膜细胞溶质侧结合蛋白能力的任何可能差异，我们比较了与溶酶体相关的底物的数量，而不是之前处理过的或未处理过的强混合蛋白酶抑制剂。在没有蛋白酶抑制剂的情况下，溶酶体内腔中易位的底物会被溶酶体蛋白酶迅速降解（溶酶体腔内蛋白质的半衰期为5-7分钟；安尼托等., 1993). 因此，孵育结束时与溶酶体相关的蛋白质代表与溶酶体膜的胞质侧结合的蛋白质(萨尔瓦多等., 2000). 相反，如果溶酶体蛋白酶被抑制，则与溶酶体相关的回收蛋白质对应于结合并内化到溶酶体腔中的蛋白质。如前所述，内化底物的量可以通过从相关蛋白质的量中减去结合的蛋白质来计算(萨尔瓦多等., 2000). 与我们之前的结果一致，在百草枯处理的大鼠的溶酶体中，与溶酶体膜结合的GAPDH和RNase A的量显著增加（增加4至5倍）(图4A). 当按照上述方法计算时，这些溶酶体对这两种底物的摄取量也增加了两到三倍(图4A，底部）。我们之前已经证明CMA在饥饿条件下被激活(库尔沃等., 1995). 当我们比较饥饿和百草枯这两种刺激时，我们发现用促氧化剂处理后CMA的活化更强。与48小时饥饿动物的溶酶体相比，用百草枯处理的喂食大鼠的溶酶体中分离出的两种底物的结合和摄取水平显著升高。为了确定在百草枯治疗期间观察到的CMA增加是否至少部分归因于这组动物的某种程度的饥饿，我们测量了接触百草枯的动物的食物摄入量。然而，我们没有发现百草枯治疗组和未治疗组动物在随意状态下的进食量有显著差异，这表明百草枯处理后CMA的激活不是由于饥饿，而是由于氧化应激。

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轻度氧化应激期间CMA的激活。（A） GAPDH和RNase A与未经处理的喂食大鼠、48小时饥饿大鼠（Strv）或喂食百草枯大鼠（PQ）的完整溶酶体的关联和结合。1–3通道中的溶酶体与凝乳抑素预先孵育，以防止蛋白质降解。孵化在等渗缓冲液中进行，如下所述材料和方法用离心法收集溶酶体，用免疫印迹法测定相关蛋白水平。底部：4-6个免疫印迹的密度定量（平均值+SE），与此处显示的相似。数值表示为饥饿或百草枯处理大鼠溶酶体与未经处理的喂食动物溶酶体的结合和摄取（结合结合）增加的倍数。*，与喂养动物相比的差异；+，与饥饿动物相比的差异(*p<0.1，**p<0.05，***p<0.01）（B）从培养基（血清-）中取出血清或用百草枯处理保存在血清补充培养基中的细胞后，小鼠成纤维细胞中lamp2a（红色）和lamp1（绿色）的免疫荧光。将显示两个荧光通道的合并图像。棒材，50μm。

CMA的激活与CMA活性较高的溶酶体向核周区域的再定位有关（那些具有较高水平的lys-hsc70和lamp2a）(阿格拉贝雷斯等., 1997;Cuervo和Dice，2000年c). 如所示图4B在有血清存在的培养成纤维细胞中，lamp2a与其他溶酶体膜蛋白共定位（此处显示lamp1），显示出典型的泡状点状模式。当从培养基中取出血清时，富含lamp2a的溶酶体优先定位于核周区。百草枯对lamp2a的治疗显示出类似的核周模式，即使细胞保持在血清中(图4B，右侧）。

这些结果与CMA在氧化应激期间在两种实验模型中的组成性激活相一致，在这两种模型中，CMA具有更好的特征，即培养中的大鼠肝脏和成纤维细胞(Terlecky和Dice，1993年;库尔沃等., 1997).

氧化应激诱导的CMA活性溶酶体的变化

几种细胞溶质伴侣与溶酶体膜相关，是CMA底物结合/溶酶体吸收所必需的(Agarraberes and Dice，2001年). 尽管这些耳蜗酮在CMA中的具体功能尚不清楚，但对培养的人成纤维细胞的研究表明，当去除血清激活CMA时，其中一些耳蜗蛋白的水平上调，而另一些则保持不变(琼脂和骰子，2001年). 在饥饿48小时的大鼠肝脏中分离出的溶酶体中，除了先前报道的lys-hsc70增加外，我们还发现与对照动物的溶酶体相比，hsp90和Hip的水平更高，但程度更低(图5A). 与未经处理的动物相比，用百草枯处理（在喂养的大鼠中）导致lyshsc70和Hip的溶酶体含量类似增加，但hsp90的含量仅离散增加。这些治疗都没有改变其他相关伴侣蛋白（hsp40或Bag-1）的水平，也没有导致hsp70家族诱导型hsp72的溶酶体结合，但百草枯治疗后，溶酶体中hsp72升高(图5A). 由于hsp90在溶酶体中的功能尚不清楚，尚不清楚为什么其溶酶体水平的增加不像饥饿时观察到的那样明显，但由于在这些条件下摄取率仍在上调，这表明hsp90对易位复合体的作用是无限的。

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轻度氧化应激期间溶酶体相关伴侣的变化。（A） 从正常喂食、48小时饥饿大鼠（Stv）或喂食百草枯（PQ）的大鼠（标记为百草枯）中分离出的细胞溶胶和溶酶体（75μg蛋白质），对所示蛋白质进行SDS-PAGE和免疫印迹。右，四个免疫印迹中溶酶体部分伴侣蛋白的密度定量（平均值+SE），与此处显示的相似。喂食动物的溶酶体中的水平被赋予任意值1（虚线）。*，与喂食动物的差异(*p<0.1，**p<0.05，***p<0.01）。（B） CMA高（CMA+）和低（CMA-）活性溶酶体(库尔沃等., 1997)从A中详述的同一组动物中分离。低张休克和离心后，分离膜和基质（50μg蛋白质），并进行SDS-PAGE和hsc90（顶部）或hsc70（底部）免疫印迹。

溶酶体对CMA底物的摄取有两种速率限制成分：溶酶体腔中的伴侣蛋白（lys-hsc70）(库尔沃等., 1997;琼脂等., 1997)以及溶酶体膜上的受体（lamp2a）（Cuervo和Dice，2000亿,c（c）). 我们以前曾报道过在大鼠肝脏中存在两种溶酶体种群，它们具有相似的形态和酶特性，但CMA活性不同(库尔沃等., 1997). 到目前为止，这两组溶酶体之间的主要区别是溶酶体内腔中溶酶体hsc70的富集，CMA活性较高(库尔沃等., 1997). 这两组溶酶体通常一起纯化（它们对我们在这些研究中使用的部分分别贡献了75%和25%的高活性和低活性），但可以通过进一步密度和差速离心进行物理分离(库尔沃等., 1997). CMA活性较低的溶酶体在特定条件下会变得更为活跃，例如长期饥饿或衰老（88小时），这与溶酶体的溶菌体hsc70内腔水平增加有关(库尔沃等., 1997;Cuervo和Dice，2000a). 因为我们在百草枯处理动物的溶酶体中发现了较高水平的溶血酶体70，所以我们分离了这两个溶酶体亚群，以确定是每个溶酶体的溶血酶hsc70净增加，还是由于溶酶体hsc70中活性较低的溶菌体富集所致。如所示图5B百草枯处理后，低活性组细胞膜或基质中lys-hsc70的含量没有显著变化。因此，在百草枯处理的大鼠中，这组溶酶体选择性摄取CMA底物的能力没有改变（我们未公布的数据）。在未经治疗和百草枯治疗的大鼠中，hsc70富集溶酶体的百分比（作为该组分中己糖胺酶活性的恢复）相似（我们未公布的数据）。对于更活跃的溶酶体组，如饥饿期间所观察到的，溶酶体膜上的lys-hsc70水平保持不变，而溶酶体腔中的lys-hc70水平大约增加了四倍。溶酶体膜和基质的分离还表明，饥饿期间和百草枯治疗后，两个隔间中的hsp90都增加了(图5B但百草枯处理大鼠溶酶体腔的增加量小于饥饿动物。hsp90管腔内容物的这些差异可以解释为什么在使用总溶酶体时(图5A)，我们发现百草枯诱导溶酶体hsp90水平的增加低于饥饿。溶酶体腔中的hsp90是否具有功能，或者它是否仅被内化以被降解（hsc90的氨基酸序列分析显示存在两个KFERQ相关基序）仍然未知。

溶酶体膜上的lamp2a水平与CMA活性直接相关(Cuervo和Dice，2000年b). 用H处理小鼠成纤维细胞分离的溶酶体2O（运行）2(图6A)或百草枯染毒大鼠肝脏(图6B)与从相应的未经处理的对照组中分离的溶酶体相比，其膜上的lamp2a水平更高。这种增加似乎对lamp2a有选择性，因为其他溶酶体膜蛋白（此处显示的lamp1）的水平保持不变。与约束和吸收数据一致(图4A)百草枯诱导溶酶体膜中lamp2a的增加高于饥饿诱导的增加(图6C). 对于所分析的另外两种溶酶体膜蛋白，在两种条件下lamp1的水平保持不变，lamp2c的水平不受百草枯处理的影响，但在饥饿期间显著降低。目前正在调查lamp2c含量的减少是否与lamp2a的增加有关，或者是独立发生的。

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在轻度氧化应激期间，溶酶体膜上的Lamp2a水平增加。（A和B）从培养的小鼠成纤维细胞分离的匀浆（50μg蛋白质）、溶酶体膜（L.Memb）和溶酶体基质（L.Matrix）（10μg蛋白）的lamp2a和lamp1的免疫印迹，暴露或不暴露于100μM H2O（运行）2（A） 或取自百草枯（PQ）治疗或未治疗的大鼠肝脏。（C） Imunbolot检测从喂食大鼠、48小时饥饿（Strv）大鼠或喂食百草枯（PQ）大鼠肝脏分离的溶酶体膜的lamp2a、lamp2c和lamp1。对，这里显示的六到八个免疫印迹的密度定量。数值表示为喂食未经处理的动物数值的倍数，是六个不同实验的平均值+SE。喂食动物的溶酶体水平被赋予1的任意值。*，与喂食动物的差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

氧化应激中CMA活化的新机制

我们之前已经证明，CMA活性可以通过溶酶体膜上lamp2a水平的变化进行调节(Cuervo and Dice，2000年b). 事实上，lamp2a的过度表达导致CMA的高比率与受体蛋白的增加成比例（Cuervo和Dice，1996,2000摄氏度). 饥饿是CMA研究最广泛的刺激因素，在饥饿期间，溶酶体膜上lamp2a的增加并不是蛋白质从头合成的结果。相反，lamp2a降解率的降低，以及溶酶体腔中部分lamp2a向溶酶体膜的迁移，是膜中lamp2b增加的主要原因（Cuervo和Dice，1996,2000摄氏度). 为了确定在氧化应激期间lamp2a水平增加是否与类似的机制有关，我们首先比较了喂食、饥饿或服用百草枯的大鼠溶酶体膜中lamp2a的降解速率。与饥饿导致的lamp2a降解显著降低相比，百草枯处理组大鼠的lamp2a降解仅略慢于未处理的喂养组大鼠(图7A). 同样，百草枯处理对lamp2a在细胞膜和基质之间的分布没有显著影响，这表明细胞膜中lamp2a水平的增加并不是正常存在于细胞腔中的lamp2o补充的结果(图7B).

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轻度氧化应激期间CMA活化的新机制。（A） 正常喂食大鼠、48小时饥饿大鼠或喂食百草枯（PQ）大鼠的隔离膜中lamp2a的降解，如下所示材料和方法lamp2a降解后，在孵育的不同时间用一种针对其细胞溶质尾部的抗体对溶酶体膜进行免疫印迹。数值是来自四个不同实验的免疫印迹密度定量的平均值+SD。顶部插图中显示了具有代表性的免疫印迹。（B） lamp2a在正常喂养大鼠（经PQ治疗或未经PQ处理）分离的溶酶体中溶酶体膜和基质之间的分布。数值为四个免疫印迹密度定量的平均值+SE，类似于图6B（C）通过PCR，从从正常喂养、48小时饥饿或百草枯处理的喂养大鼠的肝脏中分离的总mRNA的浓度增加中扩增lamp2a的120核苷酸片段和肌动蛋白的108核苷酸片段。显示了产品在2%琼脂糖凝胶中的电泳模式。（D） 半定量实时PCR用于比较C中详述的相同样品中lamp2a的mRNA表达水平。校正每个样品中的肌动蛋白扩增值，并将其表达为与喂食未经处理的大鼠中的mRNA lamp2a值相比的倍数增加（任意值为1）。四个不同实验的值为平均值+SD。*，与喂食动物的差异(**p<0.01，***p<0.001）。

与饥饿动物相反，百草枯处理的大鼠肝脏中lamp2a mRNA的水平显著高于未处理的大白鼠。我们使用了基于稀释的定量PCR方法(图7C)和实时PCR(图7D)比较喂食、饥饿或百草枯（fed）处理大鼠肝脏中lamp2a mRNA的水平。百草枯处理导致喂食动物的lamp2a mRNA水平增加约六倍，而饥饿导致lamp2amRNA水平略有下降。因此，与饥饿相反，在饥饿中，lamp2a水平的增加并不需要合成新的蛋白质，百草枯处理动物中检测到的lamp2a水平的增加大多是蛋白质从头合成的结果。

我们的结论是，CMA的激活是正常氧化应激反应的一部分，它有助于选择性地清除细胞液中的氧化蛋白。在这些条件下观察到较高的CMA发生率是由于蛋白质被溶酶体吸收和降解的敏感性增加，以及溶酶体摄取底物的能力增强。出乎意料的是，在轻度氧化应激期间，CMA的激活是由一种新的机制介导的，这种机制不同于先前描述的营养应激期间CMA的活化。

讨论

我们的结果首次提供了溶酶体参与通过CMA在轻度氧化应激期间清除氧化蛋白的证据。CMA的这种新作用得到以下事实的支持：1）氧化蛋白可以在对CMA有活性的溶酶体内腔中检测到(图1); 2） 在CMA下降的情况下，如老化，转移到溶酶体中的氧化蛋白数量减少(图1B); 3） 与未修饰的形式相比，氧化的CMA底物结合并被分离的溶酶体更有效地吸收(图2); 4） 暴露于促氧化剂的细胞或大鼠的溶酶体显示出较高的CMA底物蛋白结合和摄取率（图​（图3三和​和4）；4); 和5）在培养细胞中阻断CMA会增加其对促氧化剂化合物的敏感性，并降低其活性（Massey、Kiffin和Cuervo，未发表的数据）。氧化应激期间CMA的激活是通过上调溶酶体易位复合物的特定成分（溶酶体伴侣和溶酶体膜受体）实现的（图​（图55和​和6）。6). 有趣的是，尽管这些变化与营养应激激活CMA时描述的变化相似，但上调的机制不同。因此，这一发现表明，压力介导的CMA激活因压力的性质而异。

以前关于氧化应激期间溶酶体作用的大多数研究都集中于该亚细胞室对氧化损伤的贡献，而不是可能的保护作用。事实上，严重氧化应激（>350μM过氧化氢）对溶酶体的失稳作用已被充分证明(Brunk酒等., 1995;Ollinger和Brunk，1995年)表明溶酶体酶的释放在这些条件下的细胞内损伤和细胞死亡中起主要作用。尽管溶酶体损伤是可逆的，但较低浓度的过氧化氢（250μM持续30分钟）仍会导致一些溶酶体酶的泄漏(Brunk酒等., 1995;Ollinger和Brunk，1995年). 在我们的研究中，我们没有发现溶酶体膜稳定性的变化，这些变化是通过特定酶的释放或更敏感的蛋白水解酶方法进行检测的。我们研究中使用的低剂量过氧化氢和百草枯（分别为100μM和40 mg/100 g体重）可能足以引起细胞溶质蛋白损伤，但它们不会改变溶酶体室。另一种可能性是，最初的溶酶体损伤仍在发生。但由于其在这些条件下的可逆性(布伦克等., 1995;Ollinger和Brunk，1995年)，在分离溶酶体时（第二次注射后24小时）不再可检测到。此外，由于大多数关于溶酶体稳定性和氧化应激的研究都是在完整细胞中进行的，分析了荧光探针从溶酶体室的泄漏，我们不能放弃不同溶酶体群体可能会受到促氧化剂的不同影响。在我们的分析中，所用的细胞分馏方法已被优化，以分离出对CMA有活性的细胞内溶酶体子集（占总数的10-15%）(库尔沃等., 1997). CMA活性溶酶体的特殊特性，例如其内腔中铁的浓度较低，可以解释其对促氧化剂的较高抵抗力。我们对老年动物中CMA活性溶酶体的研究也支持其独特的特性。因此，尽管脂褐素在溶酶体中的积累是一种常用的衰老生物标志物，但来自老年大鼠肝脏的CMA活性溶酶体很少积累这种色素(Cuervo和Dice，2000a).

蛋白酶体降解氧化蛋白质的能力以前在体外已有很好的记录(里维特，1985年;戴维斯，2001)，最近在体内(格鲁内等2002年;霍斯勒等., 2003;Shringarpure公司等., 2003). 大多数评估氧化诱导的溶酶体蛋白水解行为变化的研究都集中在分析组织蛋白酶（溶酶体蛋白酶）的酶活性。中度氧化应激不会显著改变大多数组织蛋白酶的活性，而更严重的氧化条件会导致组织蛋白酶活性的增加或减少，这取决于细胞条件（Sitte等.,2000年,b条). 氧化蛋白的细胞内积累和溶酶体酶活性之间缺乏相关性，这为反对溶酶体参与去除氧化蛋白的论点奠定了基础(Sitte公司等2000年). 然而，溶酶体蛋白酶的活性对于任何形式的自噬都是无限的。组织蛋白酶在溶酶体内的浓度是这样的，一旦底物到达溶酶体腔，它们就会迅速降解。这使得基板的交付成为限制步骤。Bergamini及其同事是第一批指出，如果考虑溶酶体降解蛋白质而不是溶酶体蛋白酶的酶活性，那么溶酶体蛋白质水解与氧化蛋白质胞内含量之间存在良好的负相关关系的研究小组之一(维多里尼等., 1999). 我们目前的研究还支持氧化蛋白的细胞内含量与通过CMA（结合/摄取）向溶酶体传递底物之间的良好相关性。我们之前已经证明，在对CMA有活性的溶酶体组中，大多数溶酶体酶的活性不会随着年龄的增长而发生显著变化，但在老化细胞中CMA的比率较低(Cuervo和Dice，2000a). 这组溶酶体吸收老年动物底物的能力受损，这可以解释为什么尽管细胞溶质中的氧化蛋白含量较高，但其管腔中的氧化蛋白质含量较低(图1B). 老年大鼠溶酶体腔中检测到的较低水平的氧化蛋白不太可能是由于溶酶体内这些蛋白的快速降解造成的，因为即使我们抑制了大鼠的溶酶体降解，在溶酶体分离之前（通过注射leupeptin；我们未发表的结果），我们仍然发现最古老动物的溶酶体中氧化蛋白含量较低。

通过分析蛋白酶体在氧化蛋白去除中阻碍其催化活性的后果，证明了蛋白酶体对体内氧化蛋白去除的贡献(格鲁内等2002年;霍斯勒等., 2003;Shringarpure公司等., 2003). 然而，这种方法不能用来评估自噬在这一过程中的作用。即使溶酶体蛋白酶受到抑制（使用特定蛋白酶抑制剂或通过提高溶酶体内pH值），我们也不希望发现氧化蛋白质的细胞溶质含量发生变化，因为只会阻止其蛋白水解，而不会阻止其转移到溶酶体腔中。溶酶体内腔中未降解产物的积累可以长期耐受，而不会影响其易位能力。另一种方法是直接抑制底物的传递。没有化学抑制剂可用于阻断CMA。我们最近通过对培养的成纤维细胞中溶酶体受体的RNA干扰成功地阻断了底物移位（Massey、Kiffin和Cuervo，未发表的数据）。如前所述，这些细胞对氧化应激的抵抗力较低。然而，即使在这个系统中，也很难评估溶酶体与蛋白酶体的贡献，因为阻断CMA会导致20S/26S蛋白酶体的组成发生变化，从而导致其蛋白水解活性发生变化（Massey、Kiffin和Cuervo，未发表的数据）。同样，蛋白酶体的慢性抑制，类似于衰老过程中的蛋白酶体抑制，会改变细胞激活自噬以应对压力的能力(丁等., 2003). 尽管这是一个实验挑战，但不同蛋白水解酶系统之间的相互对话可能提供了一个更为生理学的观点，来了解氧化应激期间细胞中真正发生的事情。同样，蛋白酶体和溶酶体对总蛋白质降解的相对贡献也因细胞类型和细胞条件而异(富尔特斯等., 2003)，这两个系统在去除氧化蛋白中的参与可能也是动态的。事实上，现在有许多蛋白质可以通过一种以上的蛋白水解途径降解(库尔沃等., 1998;伦克等., 1999). 未来的研究应着眼于了解这些波动是如何调节的，并确定刺激一个系统以补偿另一个系统的失败的可能方法。

然而，在严重氧化应激期间，蛋白质聚集和交联是常见的事件，轻度氧化应激已被证明能产生优良的蛋白水解底物(格鲁内等., 1995;Gomes Marcondes和Tisdale，2002年). 我们的工作支持，在CMA的情况下，CMA底物的轻度氧化不仅有助于溶酶体蛋白酶降解它们，而且有助于它们在溶酶体膜上的结合/移位(图4A). 虽然这种促进吸收的确切机制尚不清楚，但我们推测蛋白质的去折叠可能发生在氧化过程中(今井等., 2003)，可以通过减少移位前底物展开所需的时间来加速吸收。即使我们没有在易位混合物中添加细胞溶质hsc70，溶酶体也能更快地吸收氧化底物（我们的未发表数据）。然而，由于分离的溶酶体在膜的细胞溶质侧含有大量hsc70，我们不能放弃部分去折叠可能使KFERQ基序更容易与hsc70相互作用，并以这种方式促进底物的去折叠/移位。我们未发表的数据表明，操作，如CMA底物的部分变性或广泛截短，增加了它们通过CMA进入溶酶体的速率（萨尔瓦多、阿瓜多、库韦沃和克内赫特，未发表的资料），也支持在温和氧化条件下部分蛋白去折叠的拟议促进作用。在这些条件下，CMA的激活是对这些部分未折叠蛋白在胞浆中存在的反应，还是由氧化应激期间产生的其他胞浆成分介导，尚待阐明。

剩下的一个有趣的问题是，细胞如何决定氧化蛋白是被蛋白酶体降解还是在溶酶体室中降解。大约30%的细胞溶质蛋白质含有KFERQ基序，这表明，理论上，这可能是轻度氧化应激期间通过CMA降解的蛋白质子集(图1A). 然而，由格雷西等., 1998是一些氨基酸修饰，如脱酰胺和氧化，可能导致在以前缺乏该序列的蛋白质中产生类似KFERQ的基序。与其他靶向基序一样，类KFERQ基序是退化的，由碱性、疏水性和酸性残基与第四碱性或疏水性残基结合而成，两侧各有谷氨酰胺。例如，将组氨酸氧化为天冬氨酸可以提供完成KFERQ样基序所需的酸残基。另一方面，相同的过程可以消除蛋白质中通常作为该途径底物的KFERQ样基序，导致其在老化等条件下受损降解。靶向基序的这种修饰，加上CMA活性随年龄而降低的事实，可以解释老年大鼠CMA活性溶酶体内腔中氧化蛋白含量较低的原因，尽管其胞浆中氧化蛋白水平较高。我们的实验室目前正在尝试使用鸟粪蛋白质组学方法来确定CMA底物的靶向基序随年龄的变化。

特别令人兴奋的是，尽管氧化应激和营养应激期间CMA的激活对溶酶体易位成分的水平具有相同的影响，但上调，至少对溶酶体受体来说，遵循不同的机制。在饥饿期间，CMA被激活，为细胞提供合成必需蛋白质所需的氨基酸。在这些条件下，由于氨基酸短缺，从头合成lamp2a以提高CMA率可能不是一个合理的选择。相反，采用了更保守的机制（lamp2a降解下调和溶酶体内重新定位）(Cuervo和Dice，2000年b). 如果在正常营养条件下发生氧化损伤，由于氨基酸的供应不会受到影响，lamp2a的从头合成会上调以激活CMA(图7C). 在这些条件下，从头合成可能是有利的，因为它为CMA活化提供了更快的机制。

总之，我们首次确定了CMA在氧化应激反应中的作用。由于CMA活性在衰老过程中严重受损，我们推测，在老生物体中观察到的氧化蛋白的部分积累可能是由于CMA功能失常所致。未来旨在恢复老细胞中正常CMA活性的努力将有助于理解不同蛋白水解酶途径之间的串扰相关性，以及当一个或多个这些途径的活性受到损害时激活的补偿机制。

补充材料

【补充图】

致谢

我们感谢Fernando Macian博士和我们实验室的其他成员提出的宝贵建议和意见。这项工作得到了国家卫生研究院/国家老龄研究所AG-021904拨款、埃里森医学基金会研究奖（授予A.M.C.）的支持，以及西班牙国家技术部（Ministerio de Ciencia y TecnologiaíA）BMC2001-0816和SAF2002-00206拨款以及卫生研究基金会（授予E.K.）RGDMG03121拨款的支持。R.K.是美国国立卫生研究院/美国国家老龄研究所的学士后研究员。

笔记

文章在印刷前在线发布。Mol.Biol。单元格10.1091/mbc。E04–06–0477。文章和出版日期可在www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc。E04–06–0477.

缩写：CMA，伴侣介导的自噬；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；hsc70，热休克同源蛋白70kDa；lamp，溶酶体相关膜蛋白；拖把，3-(N个-吗啉）丙基磺酸；核糖核酸酶A。

D⃞本文的在线版本包含可通过以下途径访问的补充材料http://www.molbiolcell.org.

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来自的文章细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会