转录抑制RAD51系列基因缺氧。（A） Northern blot分析在暴露于常氧（N道）、缺氧（0.01%O2)（通道H）或DFX（250μM）。给出了细胞在每种条件下保持的时间（24或48小时）。血管内皮生长因子显示表达以进行比较，以验证处理后的细胞中存在与生理相关的缺氧水平，并显示28S rRNA的表达以确认相等的样本负荷。（B） Northern印迹分析RAD51系列缺氧24或48小时后A549、SiHa和RKO细胞的mRNA表达（0.01%2).血管内皮生长因子为了进行比较，显示了表达，以验证处理后的细胞中存在与生理相关的缺氧水平。28S rRNA（MCF-7、SiHa和RKO细胞）和β-肌动蛋白mRNA（A549细胞）用于确认样品装载量相等。（C） 评估RAD51系列mRNA，MCF-7细胞未经处理或暴露于DFX（250μM）24小时，然后与ActD（5μg/ml）共培养以阻断转录。在添加ActD后的指定时间采集细胞，并且RAD51系列用Northern印迹法测定mRNA表达。的表达式血管内皮生长因子证实了化学缺氧的诱导和转录的成功取消。此外，28S rRNA水平保持不变，并用作确认相等样品装载量的标准。（D） 分析RAD51系列通过Northern印迹的磷光成像仪分析确定，在加入ActD后的每个时间点，暴露于DFX或未经处理的细胞中的mRNA表达。值是RAD51系列每个时间点DFX处理或未处理细胞中残留的mRNA，误差条基于重复实验计算的标准误差。（E） 5′侧翼区域示意图RAD51系列基因，描述用于荧光素酶报告基因分析的启动子片段（pGL3-Rad51p）。如真核启动子数据库（EPD）中所述，以及使用Genomatix启动子识别算法PromoterInspector通过计算机分析识别的核心启动子区域的大致位置，显示供参考。外显子2上方的弯曲箭头表示ATG翻译起始密码子。（F） 确定缺氧对RAD51系列基因启动子活性，即pGL3-Rad51p荧光素酶（萤火虫）报告质粒在常氧或缺氧暴露前4 h瞬时转染到RKO细胞中（48 h），然后立即测量荧光素酶活性。萤火虫萤光素酶值标准化为雷尼利亚共转染pRL-SV40控制载体的荧光素酶活性和误差条基于重复实验计算的标准误差。荧光素酶报告质粒5X-HRE包含五个HRE，分别连接到人类巨细胞病毒最小启动子，其活性显示为确认生理相关缺氧水平的对照。无启动子荧光素酶报告基因构建物pGL3-Basic的活性也显示为对照。
