除了有氧糖酵解或Warburg效应外，谷氨酰胺水解在癌症中的参与作为开发新的癌症治疗药物的潜在途径受到了越来越多的关注1谷氨酰胺酶通过将谷氨酰胺（Gln）转化为谷氨酸（Glu）来控制谷氨酰胺分解途径的第一步，随后的酶反应产生天冬氨酸、苹果酸、丙酮酸、柠檬酸、丙氨酸和乳酸2人们普遍认为，癌细胞倾向于谷氨酰胺作为能量来源，这一现象在许多癌症中都已观察到三,4因此，各种研究假设，通过阻止这种关键酶的活性来抑制谷氨酰胺分解，将显著阻碍癌细胞的生长和增殖。因此，谷氨酰胺酶已成为开发抗人类癌症药物的一个有趣的靶点5,6,7,8.
迄今为止，已鉴定出三种人类谷氨酰胺酶亚型：肾脏型（KGA/GLS1）、剪接KGA变体（谷氨酰胺酶C或GAC）和肝脏型（LGA/GLS2）9,10Gao等人最近表明，c-Myc通过直接抑制miR23a和miR23b来刺激P493人B淋巴瘤和PC3前列腺癌细胞中KGA的表达6类似地，转化生长因子β（TGF-β）的激活被证明可以刺激KGA的表达11重要的是，小GTPase，Rho，一种前致癌分子，可以上调KGA活性7最近，我们发现KGA活性可以通过Ras/Raf/Mek/Erk信号级联来调节，以响应生长因子刺激8此外，据报道，LGA在能量产生-谷氨酰胺分解途径中受p53调节12,13总的来说，这些观察结果表明，靶向KGA介导的谷氨酰胺分解可能具有控制癌症的高治疗意义。
谷氨酰胺类似物6-重氮-5-氧代-L-去甲露西（DON）通过与活性位点结合抑制KGA及其亚型14.DON是一种重氮化合物，已知会干扰谷氨酰胺作为底物的核苷酸和蛋白质合成途径15然而，DON缺乏选择性，因为它还抑制其他谷氨酰胺利用酶，如酰胺转移酶和谷氨酰胺合成酶16,17以前在不同的动物模型中研究了DON的潜在抗癌活性；然而，对其毒性的担忧阻止了其进入临床试验18,19类似地，谷氨酸类似物CK（L-2-氨基-4-氧代-5-氯戊酸）也曾被报道作用于KGA的活性部位20但也没有进一步探讨。最近对癌症新陈代谢的重新关注增加了DON的优化和系统使用可能对人类癌症产生深远影响的可能性。
谷氨酰胺酶的晶体结构大肠杆菌和枯草杆菌与DON的络合物揭示了丝氨酸残基作为催化亲核剂的关键作用21最近，我们报道了与L-谷氨酰胺和L-谷氨酸络合物中肾脏型谷氨酰胺酶（cKGA）催化结构域的晶体结构，并提出了KGA的催化机理8KGA的催化二元体由Ser286和Lys289组成（286-SCVK-289），证实了先前的发现，Ser286是一种催化亲核剂。此外，我们和其他人已经报道了一种新的变构开关的存在，该开关控制BPTES对KGA和GAC亚型的抑制机制8,22随后，Cassaga等人通过解决GAC亚型与磷酸盐络合物的晶体结构，提出了GAC亚型态的活化机制23.
迄今为止，还没有任何关于人类谷氨酰胺酶亚型（KGA或GAC、LGA）与其活性位点抑制剂复合体的结构研究报告。在这里，我们报道了KGA与几种可能的活性位点抑制剂的活性位点抑制研究以及cKGA与DON配合物的晶体结构。与细菌谷氨酰胺酶类似，我们发现DON与KGA的活性位点Ser286残基形成共价键。此外，使用定点诱变，我们验证了参与这些与DON相互作用的各种关键残基的重要性。综上所述，这些研究构成了优化KGA活性位点抑制剂以改善和选择性抑制这种酶的策略的基础，因此可能为开发针对谷氨酰胺依赖性癌症的治疗干预措施迈出第一步。
结果
底物类似物抑制剂对cKGA的活性位点抑制作用
DON和氮杂丝氨酸是谷氨酰胺类似物，已知其可灭活几种谷氨酰胺利用酶，如谷氨酰胺酶、酰胺转移酶和谷氨酰胺合成酶24此外，另外两种谷氨酸类似物-草铵膦铵和L-蛋氨酸亚砜胺-先前被证明抑制谷氨酸依赖酶的活性25,26。我们首先进行了分析，以确定这四种抑制剂中哪种最能抑制KGA的活性(). 我们发现，DON对cKGA的抑制作用明显优于其他三种抑制剂，且具有IC50约1 mM(). 因此，在随后的实验中使用DON来研究KGA的活性部位抑制机制。
选定的谷氨酰胺/谷氨酸类似物在1mM浓度下对cKGA的相对抑制率的比较（IC50DON约为1 mM）。分析分三次进行，数值为三个独立实验的平均值±SD。
cKGA:DON复合体的结构
分子置换法，使用从阿波罗cKGA（PDB代码3voy）用于解决cKGA:DON复合体。用良好的立体化学参数对最终模型进行了改进(,). cKGA:DON的络合物结构表明，该抑制剂与催化亲核试剂Ser286的侧链羟基（OH）形成共价键。活性位点残基Ser286与抑制剂的连续电子密度证实了这一点(). 这个Ser286残基在所有KGA亚型中都是保守的。使用基于cKGA:DON和阿波罗-cKGA（315个Cα原子的rmsd为0.3º），我们观察到cKGA与DON相互作用时没有显著的结构变化().
cKGA的结构：DON复合体。（A） cKGA:DON复合体的带状表示。二级结构α-螺旋和β-片分别以深绿色和洋红色显示。DON位于活动部位裂隙中，显示为黄色棒状。（B） DON在cKGA催化袋中的相互作用。DON显示为黄色，cKGA残留物显示为灰色。最终2楼-Fc显示了DON及其与cKGA的Ser286共价连接的电子密度图。该地图的等高线为σ水平1.0。此图和本文中报告的其他结构相关图是使用Pymol绘制的39.
晶体结构阿波罗cKGA与cKGA:DON叠加。活性部位残留物阿波罗cKGA和cKGA:DON分别以洋红和灰色显示。
表1
cKGA:DON复合物的结晶数据和精炼统计
| | 数据收集cKGA:DON复合体 |
|---|
| “空间”组 | I4类122 |
| 细胞参数（Å，°） | A=139.27，b=139.26，c=156.50，α=β=γ=90 |
| 分辨率范围（Ω） | 30–2.3 (2.34–2.30) |
| 波长（Ω） | 1 |
| 观察香港特别行政区 | 392469 |
| 独特香港特别行政区 | 34102 |
| 完整性（%） | 99.6 (95.7) |
| 总体我/σ我 | 12.7 |
| 一R（右）sym（对称） | 0.054 (0.392) |
| 模型的细化和质量 |
| *分辨率范围（Å） | 25.7–2.30 |
| b条反射次数（%） | 19.28 (23221) |
| c（c）无反射（%）数量 | 21.08 (1722) |
| 均方根偏差 |
| 粘结长度（Ω） | 0.007 |
| 结合角（°） | 1.02 |
| Ramachandran图（%） |
| 有利地区 | 88.1 |
| 允许的区域 | 11.2 |
| 大面积允许区域 | 0.7 |
| 不允许的区域 | 0 |
| 平均B系数（λ2) |
| 主链原子 | 52.04 |
| 侧链原子 | 57.43 |
| 总蛋白质原子（原子数） | 54.63 (2412) |
| 水（原子数） | 54.63 (89) |
| 配体（原子数） | 53.26 (10) |
cKGA:DON交互
cKGA:DON的复杂结构表明抑制剂结合在催化囊中。DON上Ser286侧链的亲核攻击释放了重氮基团（N2)从复合物中的DON，从而将酶与抑制剂的5-氧代-1-去甲亮氨酸（ON）组分共价连接，形成稳定的cKGA-ON复合物(). 结合抑制剂与cKGA的Tyr249、Gln285、Ser286、Asn335、Glu381、Asn388、Tyr414、Tyr 466和Val484保持若干氢键和疏水相互作用(). 特别是，抑制剂的羰基氧参与了与Ser286和Val484的主链氨基（NH）基团的两个氢键接触，并形成了一个氧阴离子孔。类似地，抑制剂的α-羧基氧参与与酶的Asn335和Tyr414侧链的两个氢键接触。此外，抑制剂的主链NH基团参与了与Gln285和Glu381侧链的氢键接触(). 除这些相互作用外，由Tyr249、Tyr414和Tyr466的侧链形成的疏水簇进一步稳定了cKGA和DON之间的相互作用(). 值得注意的是，Tyr466位于DON（3.2º）附近，也靠近催化Ser286（2.7º），后者负责催化期间的质子转移。之前，我们提出Tyr466与活性中心二元体（Ser286-CV-Lys289）一起在催化机制中起关键作用8cKGA:DON复合物的静电表面电位显示出一个主要带正电荷的活性位区域()，主要来自cKGA活性位点区域的相邻残基（Lys299和Lys491）。
cKGA中的DON装订袋。（A） 显示了cKGA:DON复合体的静电表面电位。DON显示为黄色棒。（B） 静电表面电位的特写镜头显示DON周围有一个带正电荷的口袋。（C） 在活性位点裂中与DON相互作用的残基被标记。
野生型cKGA与结构导向cKGA丙氨酸突变体的活性比较。每个cKGA结构都获得了三个复杂的数据集。数值为三个独立实验的平均值±SD。
提出了KGA的活性部位抑制机制。反应机理如下：（i）Ser286对DON的亲核攻击；（ii）Ser286和DON之间共价键的生成以及随后N的释放2; （iii）乙酰-抑制剂复合物的形成。
表2
DON在cKGA活性部位形成氢键
| DON原子 | cKGA原子 | 距离（Ω） |
|---|
| O5公司 | 序列286N | 2.98 |
| O5公司 | 瓦尔484N | 2.82 |
| O1公司 | Asn335ND2型 | 3.13 |
| O5公司 | 蒂尔466OH | 3.25 |
| 全日空航空公司 | Gln285OE1公司 | 2.79 |
| 全日空航空公司 | Glu381OE2 | 2.85 |
| O5公司 | Tyr249OH公司 | 3.24 |
| O1公司 | Tyr414OH公司 | 2.84 |
cKGA活性位点区域的突变研究
cKGA:DON的复杂结构揭示了cKGA的关键残基，这些残基对其与DON的相互作用至关重要。为了验证KGA的这些关键相互作用残基在其酶活性中的作用，我们生成了几个丙氨酸替代突变体，并使用谷氨酰胺酶分析测定了它们的活性。我们发现，与野生型cKGA相比，cKGA突变体Tyr249A、Ser286A、Lys289A和Tyr466A的活性显著降低()，极大地影响了基底结合。因此，我们的研究证实了推测的催化二元体Ser 289-CV-Lys289和其他残基，如Tyr249和Tyr466，在KGA的活性中起着关键作用。
DON对KGA的抑制作用
cKGA:DON复合物结构表明，DON通过共价修饰Ser286残基与KGA活性位点结合。基于我们的观察和以前的文献，我们提出了DON抑制KGA活性位点的机制(). 首先，来自活性中心Ser286残基的羟基质子被捐赠给DON的重氮酮，从而形成重氮离子。接下来，Ser侧链氧（Oγ）对抑制剂的亲核攻击释放N2来自抑制剂。随后在Ser286和抑制剂之间产生共价键，从而形成稳定的酶-抑制剂复合物。在我们的晶体结构中，我们观察到Ser286的羟基氧位于距离DON的δ碳约1.4Å的位置。基于这种复合结构，可以提出KGA的Lys289作为一种通用碱来辅助催化Ser286残基，这进一步得到了Tyr 466的侧链羟基氧的支持。此外，KGA与其同源物（例如，来自大肠杆菌和B.细目)提出活性位点抑制机制的一种常见模式21.
cKGA:DON与YbgJ:DON（PDB代码：3BRM）的叠加得到285个Cα原子的均方根偏差（RMSD）为1.3º。cKGA与其同源物YbgJ具有36%的序列同源性枯草杆菌这两个复合结构的活性位点残基排列良好，表明人类KGA可能利用与其细菌同源物类似的催化机制(). 此外，cKGA:DON络合物与cKGA:谷氨酰胺（PDB代码：3VPO）的叠加得到312个Cα原子的RMSD为0.3º。虽然两种结构的活性位点是相同的，但可以观察到结合的DON在活性位点中的位置存在细微差异().
结构比较。（A） cKGA:DON（灰色）在上的叠加是来自B.枯草杆菌（PDB代码：3BRM）（洋红色）。显示了cKGA的关键活性位点残基，括号中显示了YbgJ的等效残基。（B） cKGA:DON（灰色）和cKGA:谷氨酰胺（PDB代码：3VPO）（橙色）的叠加。显示了cKGA两种配合物的关键活性位点区域残基。DON显示在决赛中2楼-Fc电子密度图（轮廓为1.0σ）。
讨论
最近的研究强调了KGA作为多种人类癌症有希望的分子靶点的重要性5,6,7,8,22,23值得注意的是，以KGA为靶点的小分子抗癌抑制剂正处于临床试验的早期阶段27; 然而，这些潜在抑制剂的成功将需要清楚地了解KGA抑制的分子机制。目前对癌症新陈代谢的新兴趣增加了用DON或另一种小分子抑制剂进行系统治疗可能对人类癌症有益的可能性。
在我们的研究中，我们发现DON在大约IC处显著抑制KGA50同样，2–10 mM DON可以抑制细菌谷氨酰胺酶（YbaS），尽管它起到共价抑制剂的作用21DAG对人胱硫醚γ-裂解酶的共价抑制也有类似的浓度范围，DAG作用于IC500.2 mM28此外，一些研究报告了DON对谷氨酰胺酶的弱、不可逆和时间依赖性抑制模式14,29,30,31虽然DON已被广泛用于了解KGA和其他谷氨酰胺酶亚型的功能作用，但该化合物的效力和选择性的缺乏阻碍了其在治疗中的应用。因此，有必要优化DON对KGA的特异性，使其成为相关选项。人类cKGA:DON复合体的结构提供了对结合模式及其活性的深入了解，这对于优化、设计和合成一系列新的DON类似物具有重要意义。此外，BPTES和化合物968（一种二苯并菲）最近被鉴定为KGA的变构抑制剂，并显示可以阻止癌细胞生长和增殖5,7,8我们最近阐明了BPTES对KGA的变构抑制机制，表明BPTES在活性位点附近的二聚体界面上与KGA结合，并通过关键环（Glu312-Pro329）中的剧烈构象变化破坏酶的活性8我们进一步表明，与野生型相比，该变构环中的丙氨酸取代导致酶活性降低，这表明BPTES结合环残基对于赋予KGA活性是必不可少的8此外，最近有人提出，关键回路中的赖氨酸（Lys 316）乙酰化对谷氨酰胺酶的调节和激活很重要32.
谷氨酰胺酶在淋巴瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌和肾癌细胞中被发现升高5,6,7,8最近有报道称，与正常细胞相比，Myc刺激谷氨酰胺酶（GAC）的表达，从而直接增加PC3和P493细胞系中谷氨酰胺代谢水平6值得注意的是，作为对Myc的反应，淋巴瘤细胞的谷氨酰胺酶表达增加了约10倍。同样，Rho GTPase也能增强乳腺和转化成纤维细胞癌细胞中谷氨酰胺酶（GAC）的表达7除了这些研究中描述的增加蛋白质表达水平外，我们最近发现Ras/Mek激酶可以通过磷酸化激活转化癌细胞中KGA的内在活性，而不会改变蛋白质表达水平8当在50μM下使用时，BPTES可以抑制细胞内过度表达KGA的几乎所有KGA活性，而不会对细胞产生太多细胞毒性8总之，这些观察结果表明，谷氨酰胺酶活性可以通过替代机制在癌细胞中进行差异调节，研究结果表明迫切需要设计新一代高效低毒的杂交抑制剂，选择性抑制癌细胞中的KGA。
为了开发更好的特异性和有效靶向KGA的抑制剂，我们提出了一种针对KGA变构位点和活性位点的策略。这种潜在的新抑制剂可以结合通过柔性连接体连接的BPTES和DON的优化衍生物，并通过每个抑制剂的机制抑制KGA。这种方法是可行的，因为这两种抑制剂的结合位点大约相隔8度，如我们使用独立的BPTES（变构）和DON（活性位点）生成的抑制模型所示(). 这种杂交抑制剂的优点是保留了BPTES的特异性，同时靶向活性位点和变构位点。此外，这种抑制策略可能有助于改善药效团特性，并导致开发一组新一代谷氨酰胺酶抑制剂（KGA），其对KGA的效力更大，毒性作用更低。
一个拟议的KGA混合抑制模型结合了BPTES和DON的作用。该模型是通过叠加BPTES:cKGA和DON:cKGA的晶体结构而制备的。BPTES与变构位点结合，而DON与活性位点结合。这两个位置相隔约8°，表明了这种方法的可行性。
方法
cKGA的表达与纯化
按照上述程序纯化人cKGA8简单地说，cKGA（Ile221-Leu533）被克隆到Pet-28（b）载体中大肠杆菌用BL21（DE3）-RIL-Codon plus细胞表达该蛋白。使用Ni-NTA亲和柱纯化蛋白质，然后使用凝胶过滤色谱。缓冲条件为20 mM Na-Hepes pH 7.5、200 mM NaCl、10%甘油和2 mM DTT。DON（6-重氮-5-氧代-L-去甲亮氨酸，NSC 7365），氮杂丝氨酸(O（运行）-重氮乙酰-L-精氨酸、NSC 742）、草铵膦铵和L-甲硫氨酸亚砜胺购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。
谷氨酰胺酶测定
使用前面描述的两步分析法进行谷氨酰胺酶分析8,33简而言之，将10μL含有丙氨酸突变的野生型cKGA或cKGA与10μL由20 mM谷氨酰胺、50 mM醋酸三钠（pH 8.6）、100 mM磷酸盐和0.2 mM EDTA组成的分析混合物在37°C下培养10分钟。通过添加2μL的3 M HCl来终止反应。随后，在室温下将反应混合物与200μL第二分析混合物（2.2 U谷氨酸脱氢酶、80 mM Tris·醋酸盐（pH 9.4）、200 mM肼、0.25 mM ADP和2 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）在一起培养30 min。使用微孔板阅读器在340 nm处读取吸光度（SpectraMax 340；Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA）。
结晶和数据收集
结晶筛选是在22°C下通过悬滴蒸汽扩散进行的。结晶之前，通过在4°C下将约20 mg/mL cKGA与10 mM DON（约1:10摩尔比）孵育30分钟来制备复合物。结晶液滴由1μl cKGA:DON络合物和1μl来自储层井的结晶溶液组成。cKGA:DON晶体在含有0.1M双三甲基丙烷（pH 7.2）和1.8M LiSO的溶液存在下2天后生长4在衍射研究中，晶体用添加15%甘油作为防冻剂的储液溶液进行低温保护，并在液氮中进行闪速冷冻。衍射数据是在国家同步辐射研究中心（NSRRC，台湾）的同步辐射束线13B1（波长1.000Å）收集的。使用HKL2000处理和缩放数据集34晶体统计数据见.
结构解决和细化
cKGA-DON复合物的结构是通过分子替换程序MolRep确定的35使用的坐标阿波罗cKGA作为搜索模型（蛋白质数据库，3VOY）8在不对称单元中观察到一个cKGA:DON复合物分子，初始R因子为39%。模型在COOT中进行了检查和构建36随后使用Phenix精炼进行精炼37分别在COOT和Phenix程序中进行抑制剂的安装和改进。最终的结构被细化到2.3º分辨率，R因子为0.19（R自由的0.21) (). 利用程序PROCHECK通过Ramachandran图分析最终模型的整体几何结构38.
cKGA的定点突变
为了创建cKGA的所有结构导向突变体，我们使用Kapa Biosystems，Inc.（美国马萨诸塞州沃本）的试剂盒进行了定点突变。将克隆到PET-28（b）载体中的cKGA用作突变模板。cKGA的关键残基（Tyr249、Ser286、Lys289和Tyr466）突变为Ala作为单点取代。所有突变均通过DNA测序进行验证。含有点突变的质粒被转化为大肠杆菌BL21（DE3）RIL菌株和突变cKGA蛋白按照与野生型cKGA相同的程序进行过表达和纯化。
蛋白质数据库登录代码
cKGA:DON复合物的坐标和结构因子已保存在RCSB蛋白质数据库中，访问码为407D。
