生物学报。作者手稿；2017年5月1日PMC提供。
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基于透明质酸的近红外荧光纳米粒子：自组装、光学特性和细胞相互作用
,a、，b条 ,c（c） ,日期：，e（电子）和c、，f、，*
Sneha S.Kelkar公司
一维克森林（Wake Forest）——北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆市医学中心大道维克森林大学健康科学分校弗吉尼亚生物医学工程与科学技术学院，邮编：27157
b条北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆市医学中心大道维克森林大学健康科学系整形与重建外科，邮编：27157
坦纳·K·希尔
c（c）内布拉斯加州大学医学中心药学系，奥马哈，NE 68198
弗兰克·C·马里尼
d日维克森林再生医学研究所，维克森林大学健康科学，医学中心大道，温斯顿-塞勒姆，北卡罗来纳州27157
d日北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆市医学中心大道威克森林大学健康科学学院癌症生物学系，邮编：27157
亚伦·M·莫斯
c（c）内布拉斯加州大学医学中心药学系，奥马哈，NE 68198
（f）弗雷德和帕梅拉·巴菲特癌症中心，内布拉斯加州大学医学中心，奥马哈，NE 68198
一维克森林（Wake Forest）——北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆市医学中心大道维克森林大学健康科学分校弗吉尼亚生物医学工程与科学技术学院（邮编：27157）
b条北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆市医学中心大道维克森林大学健康科学系整形与重建外科，邮编：27157
c（c）内布拉斯加州大学医学中心药学系，奥马哈，NE 68198
d日维克森林再生医学研究所，维克森林大学健康科学，医学中心大道，温斯顿-塞勒姆，北卡罗来纳州27157
d日北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆市医学中心大道威克森林大学健康科学学院癌症生物学系，邮编：27157
（f）弗雷德和帕梅拉·巴菲特癌症中心，内布拉斯加州大学医学中心，奥马哈，NE 68198
- 补充资料
GUID:A367CC5C-E505-41BA-8AC2-14E205750A60
摘要
可以特异性突出肿瘤细胞的荧光成像剂可能对图像引导的肿瘤切除产生重大影响。在这里，研究了从透明质酸（HA）衍生的荧光纳米粒子（NP）。HA是受体CD44的配体，CD44是许多原发性肿瘤细胞、致癌细胞和肿瘤相关成纤维细胞上常见的生物标记物。此外，一种降解HA的酶家族，称为透明质酸酶（HYAL），在许多肿瘤中也过度表达，活性增加。我们报道了一组使用近红外（NIR）染料Cy7.5的靶向成像剂的设计和开发，该染料直接与疏水改性HA偶联。利用两种不同的HA分子量（10 kDa和100 kDa）和三种不同程度的疏水部分共轭（0、10和30 mol%）来开发一组大小不等的NP，其流体动力学直径（HD）范围为50至400 nm，取决于HA分子量、荧光猝灭程度（25–50%）、，细胞摄取动力学，靶向CD44+细胞。乳腺癌和前列腺癌细胞系MDA-MB 231和PC-3细胞的细胞摄取动力学和能量依赖性分别表明，随着孵育时间的延长（4小时和8小时，而不是1小时），摄取增加，并且在37°C但不是4°C时摄取增加，这表明存在能量依赖性内吞作用。在存在过量游离HA的情况下进行的NP摄取研究表明，用过量的不含高分子量HA的细胞进行预处理可使NP摄取减少50%，而在低分子量HA中则没有观察到这种趋势。这些数据为图像引导手术中选择优化的HA衍生NP奠定了基础。
关键词：透明质酸、图像引导手术、术中成像、近红外荧光、Cy7.5
1.简介
手术是50%以上癌症患者的主要治疗方法[1]. 目前的诊断成像技术主要基于计算机断层扫描、正电子发射断层扫描、磁共振成像和超声波。它们区分良性和恶性病变的能力可能有限，尤其是对于小肿瘤[2]. 发现小的恶性病变和残留在手术边缘的癌细胞会影响肿瘤复发、后续治疗，最终影响患者生存。
在癌症手术中使用NIR荧光成像可能会改变模式，从而降低医疗成本，提高患者生存率。近红外光可以穿透毫米级的组织，而可见光只能穿透微米级的组织。与UV-Vis染料相比，NIR荧光团具有几个优点，例如，由于血红蛋白和水的吸收和散射较低，组织渗透较深，内源性荧光团的自荧光降低，对自然组织的光损伤最小[2–4]. 术中NIR成像能够显示浅表肿瘤（组织表面以下<8mm）和局部转移病灶，对患者和外科医生来说相对安全，并且具有特异性靶向性的潜力[5]. 近红外染料已被用于探索有关体外和体内成像的各种应用，包括pH值变化、生物分子、活性氧和活性氮物种信号、金属离子和酶[三]. 目前可用的FDA批准的NIR染料，吲哚菁绿（ICG）和亚甲基蓝是非特异性的[6,7]. 下一代特定靶向NIR荧光生物共轭物需要具有更高光稳定性、量子产率、斯托克位移和易于修饰的新探针，以满足各种应用的需求。例如，IR800-CW（LI-COR Biosciences，Lincoln，NE）与贝伐单抗（抗血管内皮生长因子）结合，目前正在患者中进行一期临床试验研究[8].
NP最近在生物医学成像领域，特别是在图像引导手术中受到了关注[9–11]. 已证明嵌入纳米材料核心的荧光染料和药物具有较高的化学稳定性（抗酶或ROS）和光稳定性，改善了水溶性和靶向性。此外，由于血管通透性增强和淋巴引流不良，包括NP在内的一般大分子可以优先在肿瘤中积聚[12]. 通过结合靶向配体可以增强特异性，以改善肿瘤内积累、药物疗效和降低非靶向毒性[13,14]. 为此，HA是一种由交替（1–3）-β连接的二糖重复单元组成的非硫酸糖胺聚糖N个-乙酰-D-葡萄糖胺和（1-4）-β连接的D-葡萄糖醛酸是一种生物聚合物，特别适合生物医学应用。HA具有生物相容性，可被HYAL生物降解，HYAL在许多肿瘤中过表达[15–17]. 值得注意的是，HA是CD44的配体，CD44是许多原发性肿瘤细胞、致癌细胞和肿瘤相关成纤维细胞上常见的受体[18,19].
一些研究小组试图利用CD44的内源性配体HA来开发针对多种癌症的NP，用于药物和/或显像剂的输送[20–22]. 使用HA形成NP的一种常见方法是用疏水配体和聚合物进行修饰。例如，神经酰胺、胆汁酸或聚合物，例如聚[丙交酯-（共聚乙醇酸）]（PLGA）、聚（-氨基酯）已共轭或接枝到HA，以驱动自组装成纳米粒子，以靶向递送治疗部分。[20,21,23–28]. 同样，我们最近描述了HA-衍生NP，其包埋ICG，称为NanoICG，用于在小鼠中使用人类乳腺肿瘤异种移植进行图像引导手术[28]. 在这种情况下，HA被不同的疏水配体修饰，形成自组装胶束状结构，可以包埋ICG。尽管与单独ICG相比，NanoICG与噪声的对比度明显更高，但ICG的物理包封在确定两亲性HA的作用和分布方面具有固有的局限性，因为ICG也可以与血清蛋白相关[7,29].
此外，研究表明，对于聚合物来说，分子量在基本NP性质中起着很大作用，如尺寸、毒性和体内行为[30,31]. 本工作对HA分子量和疏水配体含量对NP性质的影响进行了初步分析。因此，我们使用直接与HA偶联的NIR染料Cy7.5设计并开发了一组HA衍生纳米粒子。我们在这里报告了HA分子量、疏水配体含量和直接染料结合对体外HA衍生纳米粒子的物理、化学、光学和生物特性的影响。这些研究为下一代基于HA的近红外成像剂用于图像引导手术奠定了基础。
2.材料和方法
2.1. 材料
HA（10和100 kg/mol）购自LifeCore Biomedical（明尼苏达州查斯卡）。1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺（EDC），N个-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和N，N-二甲基甲酰胺（DMF）购自Fisher Scientific。5-β-胆酰胺（5CA）是由5-β-胆酸（Fisher Scientific）按照先前公布的程序合成的[22,28]. 除非另有规定，否则所有试剂均未经进一步纯化。Cy7.5-胺从Lumiprobe公司（佛罗里达州哈兰代尔海滩）获得。脱盐PD10柱和透析膜（3500 MWCO和6000–8000 MWCO）分别从GE healthcare和Fisher Scientific购买。在室温下使用5 mm探针在500 MHz Bruker或600 MHz Varian系统上进行核磁共振。尺寸排阻色谱法（SEC）在含有0.1M磷酸钠（NaH2人事军官4)在流速为0.45 mL/min的水中加入250 ppm叠氮化钠，使用Ultrahydrogel™250和1000柱分离流动相中溶解的HA结合物（Waters Corporation）。SEC系统配备了Waters 2998光电二极管阵列、2414折射率检测器和Wyatt miniDAWN TREOS多角度激光散射检测器。使用ASTRA（6.1版）软件记录和分析数据。
DMEM、胎牛血清和青霉素/链霉素来自威克森林健康科学公司的细胞和病毒载体实验室。PBS来自Hyclone™Laboratories Inc.（GE Healthcare）。人类乳腺癌（MDA-MB 231）和前列腺癌（PC-3）细胞系取自ATCC（弗吉尼亚州马纳萨斯）。
2.2. 5-β-胆酰胺与透明质酸结合的一般程序
将透明质酸钠（100 mg 10或100 kg/mol）溶解于12.5 mL纳米纯水中。10kDa HA衍生的HA聚合物共轭物或纳米粒子用下标“10”标识，而100kDa HA衍生的HA高分子共轭物或纳米颗粒用下标”100”标识。接下来，将EDC和NHS（各78–154 mmol）溶解到HA/纳米纯水溶液中，得到十倍摩尔过量的偶联剂。在室温下将HA溶液搅拌30分钟，以便在进一步功能化之前活化羧酸基团，然后将12.5 mL DMF缓慢添加到该溶液中。在搅拌和低热条件下，将0（无配体，下标Ø）、10（低含量，下标L）或25–30（高含量，下划线H）mol%5 CA溶解于12.5 ml DMF中。冷却至室温后，向5 CA/DMF溶液中添加12.5 ml纳米纯水。最后，在室温下将5 CA溶液添加到活化的HA混合物中，并搅拌12–15 h。用1:1乙醇对反应混合物进行透析：使用3500 Da（对于10 kg/mol HA衍生物）或6000–8000 Da（针对100 kg/mol HA衍生物）对超纯水进行一天的透析，然后使用超纯水透析两天MWCO透析管，用于去除多余的小分子反应物和DMF。然后将该产品冷冻干燥以获得白色蓬松聚合物(). 如前所述，核磁共振积分用于确定5 CA与HA的共轭比率[28]. 产量：HA10-5βCAL（左）（收率=83.0%），HA10-5βCAH（H）（收率=66.5%），HA100-5βCAL（左）（产率=98.0%）和HA100-5βCAH（H）（收益率=68.5%）。5βCA与HA的结合效率总结如下.
表1
通过核磁共振和紫外-可见光谱测定用5βCA和Cy7.5功能化的NP的化学组成。
| 姓名一 | 聚合物
结合 | 理论
5βCA
内容
（摩尔%） | 实际
5βCA
内容
（摩尔%） | 理论
Cy7.5周期
负载（摩尔
%) | 实际
周期7.5
加载
（摩尔%） | 齐塔
潜力
（毫伏） |
|---|
| 纳米Cy7.510-Ø | 哈10-Cy7.5周期 | 0 | 0 | 2 | 0.23 | −34.4 ± 2.1 |
| 纳米Cy7.510升 | 哈10-5βCAL（左）-Cy7.5周期 | 10.4 | 9 | 3.2 | 0.42 | −34.2 ± 1.9 |
| 纳米Cy7.510小时 | 哈10-5βCAH（H）-Cy7.5周期 | 25.7 | 22.5 | 2.5 | 1.21 | −33.5 ± 0.4 |
| 纳米Cy7.5100-Ø | 哈100-Cy7.5周期 | 0 | 0 | 1.8 | 0.2 | −39.8 ± 1.0 |
| 纳米Cy7.5100升 | 哈100-5βCAL（左）-Cy7.5周期 | 10.4 | 8.6 | 3.9 | 0.4 | −32.1 ± 0.4 |
| 纳米Cy7.5100小时 | 哈100-5βCAH（H）-Cy7.5周期 | 32.1 | 29 | 3.05 | 1.25 | −31.9 ± 0.3 |
SEC用于测定HA经疏水部分改性后的HYAL降解率。简单地说，HA（100 kDa）或HA100-5βCAH（H）（2 mg/ml）溶解在含有0.5 mg/ml（200–500单位）HYAL（来自牛睾丸，Sigma Aldrich）的PBS（pH 7）中，并在37°C下培养24小时。然后使用上述参数对每个样品（包括HYAL）进行SEC。HA（100 kDa）和HA之间保留时间和色谱形状的变化100-5βCAH（H）然后进行比较。
2.3. Cy7.5-胺与透明质酸和HA-5 CA结合的一般程序
将23.8 mg（54.0µmol）HA-5 CA共轭物溶解在2.8 mL超纯水中。将EDC（0.7mg，4.0µmol）和NHS（0.4 mg，4.0μmol）溶解在100µL超纯水中，并将其添加到相应的HA-5 CA溶液中。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，以使HA上的羧酸基团活化。接下来，制备Cy7.5-胺（1.1 mg，1.34µmol）在二甲基亚砜（DMSO）（3.0 mL）中的溶液。将该溶液在持续搅拌下逐滴添加到上述HA混合物中。允许反应混合物在室温下搅拌12 h。反应瓶用箔纸覆盖以避免光线照射。将反应混合物搅拌至少12 h后，使用透析从多余反应物、二甲基亚砜和其他杂质中纯化产物。将反应混合物放置在含有3500（10kDa HA-5 CA衍生物）或6000–8000 Da（100kDa HA-5 CA衍生品）MWCO的透析袋中，并用水透析24小时，换4–6次水。以超纯水为流动相，通过PD10脱盐柱从HA结合物中去除残留的未结合Cy7.5染料。将产品部分冷冻干燥，以获得蓬松的浅绿色产品（NanoCy7.510-Ø，纳米Cy7.510-L，纳米Cy7.510-H，纳米Cy7.5100-Ø,纳米Cy7.5100升和NanoCy7.5100-H型). 产量：NanoCy7.510-Ø（产率=56%），NanoCy7.510升（产率=48%），NanoCy7.510小时（产率=52.3%），NanoCy7.5100-Ø（产率=64.2%），NanoCy7.5100升（产率=44%），NanoCy7.5100-H型（收益率=53.3%）。
2.4. 纳米粒子表征
所有NP的粒径和流体动力学直径（HD）是通过使用ZetaPlus系统（布鲁克海文仪器公司；纽约州霍尔茨维尔）的动态光散射（DLS）获得的。使用ZetaSizer纳米ZS90（英国马尔文；马尔文）获得所有NP的Zeta电位。NP样品通过溶于超纯水（1mg/mL）制备，并通过0.45µm注射器过滤器过滤。使用UV-2600光谱仪（岛津科学仪器公司；哥伦比亚MD）在水和1:1水混合物DMSO中获得NP的吸收光谱，以研究NP组装。荧光光谱在FluoroMax-4荧光光谱仪上获得，该荧光光谱仪配备有NIR增程PMT（Horiba Jobin-Yvon；Edison，NJ，USA）和Pearl Impulse动物成像系统（LI-COR；Lincoln，NE）。使用为Cy7.5染料在1:1水：二甲基亚砜中绘制的标准曲线，测定Cy7.5染色剂与HA的结合比。
2.5. 纳米粒子细胞毒性
使用CCK-8试验（日本道津道）研究NP毒性。在NP治疗前一天，使用含有10%FBS和1%P/S的DMEM培养基，将人乳腺癌（MDA-MB-231）或前列腺癌（PC-3）细胞以25000个细胞/孔的密度接种在96周板中。将NP溶解在几种浓度（0、0.01、0.05、0.1 mg/mL）的无血清培养基中，并向每个孔中添加200µL NP溶液。用NP处理细胞24小时，然后用PBS洗涤两次。然后，向每个孔中添加100µL 10%CCK-8试剂溶液，并在37°C下培养1小时。1小时后，将90µL CCK-8溶液转移到新的96 well板中，以准备进行吸光度测定。使用Spectramax M5分光光度计（加利福尼亚州森尼维尔的分子器件）在450 nm处测量每个溶液的吸光度。比较NP处理细胞和未处理对照细胞的活性。
2.6. NP摄取的流式细胞术表征
使用流式细胞术（FACSAria II，BD Bioscience，San Jose，CA，USA）研究了37°C和4°C下人类乳腺癌和前列腺癌细胞系的NP摄取。细胞于10时接种在12孔板中5NP处理前24小时，使用含有10%FBS和1%P/S的DMEM培养基培养细胞/孔。接下来，1 mL DMEM（无血清）培养基，含有10 kDa和100 kDa NP，配体含量可变（NanoCy7.510-Ø纳米Cy7.510升，纳米Cy7.510-H，纳米Cy7.5100-Ø，纳米Cy7.5100升和NanoCy7.5100-H型)在等摩尔Cy7.5下，向每个孔中添加1.5 mM的染料浓度，并在37°C和4°C下培养4 h。孵育时间基于分别对10kDa和100kDa MW NP进行的动力学研究，并在超过95%的细胞群体对NP荧光呈阳性的情况下进行选择。NP培养后，用PBS洗涤细胞，胰蛋白酶化并重新悬浮在400µL FACS缓冲液中（PBS中的3%FBS）。添加CD44（PE小鼠抗人CD44，BD Pharmingen）或同种（PE小鼠IgG1k同种对照，BD Farmingen）抗体（20µL用于106细胞）培养至细胞悬浮液，并在4°C的黑暗中培养30分钟。接下来，在室温下用10%中性缓冲福尔马林（300µL）固定细胞15分钟。在FACS分析之前，将细胞储存在4°C的FACS缓冲液（200µL）中，并通过70µm细胞过滤器过滤。使用FlowJo软件分析所有流式细胞术数据。
2.7. 共焦显微镜
接种MDA-MB-231细胞（105电池/孔）安装在12孔板内的盖玻片上。电镀24小时后，用浓度为3 mM的NanoCy7.5在无血清培养基中处理细胞，并在37°C或4°C下培养。培养后，用PBS洗涤细胞两次（每次5分钟），然后用中性缓冲福尔马林（NBF）固定15分钟，然后用三次PBS洗涤。接下来，用0.25%Triton在PBS中清洗细胞以使细胞膜渗透，然后用1%BSA在PBS内封闭。接下来，将早期内胚体标记物Rab 5（兔多克隆IgG，Santa Cruz Biotechnology Inc.，Dallas，TX）的一级抗体添加到1%BSA溶液中，并与细胞在4°C下培养过夜。将稀释在1%BSA中的二级抗体与未处理的对照孔一起添加到每个孔中，并在室温下孵育30分钟。用PBS洗涤三次后，用NucBlue®固定细胞染色法对细胞进行染色（Molecular Probes，Life Technologies，Carlsbad，CA）并将盖玻片安装在装有Extend®Gold防褪色试剂（Molecular probes，Life Technologies，Carlsbad，CA）的载玻片上。幻灯片在4°C下保存，直到成像。
使用Olympus Fluoview FV10i显微镜（60X）和1µm细胞切片拍摄共聚焦图像。DAPI、Alexa Flour 488和Alexa Fluor 647过滤器用于检测来自细胞的蓝色、绿色和NIR信号。图像通过ImageJ软件进行分析（国立卫生研究院；马里兰州贝塞斯达）。
2.8. 过量HA存在下的纳米粒子吸收
在MDA-MB-231细胞中存在过量HA的情况下评估NanoCy7.5靶向性；在这种情况下，HA是CD44的内源性配体，可以作为NP摄取的抑制剂[27]. 流式细胞术（FACSAria II，BD Bioscience，San Jose，CA，USA）和共聚焦显微镜（Olympus Fluoview FV10i）在NanoCy7.5和HA培养后进行，如下所示：细胞在37°C的无血清DMEM培养基中与未改性HA预培养1h。1小时后，取出培养基，将NP与游离HA一起添加到预处理细胞中，并进一步培养1小时。NP培养后，按照上述方法处理细胞。在相同的孵育时间内，将HA预处理细胞的Cy7.5荧光与未处理细胞的荧光进行比较。
3.结果
3.1. 两亲性透明质酸共轭物和自组装纳米粒子的合成
HA被疏水配体5CA功能化，形成两亲性共轭物，可在水中自组装。5 CA由市售5-β-胆酸通过前面描述的两步工艺合成[22,28]. 5 CA功能化的程度通过NMR通过积分来表征N个-如前所述，HA上的乙酰质子（2.03 ppm）与5 CA上的甲基质子（0.65 ppm）[22,28]. 对于HA的高和低5 CA进料比，获得了80–90%的偶联效率(). Cy7.5共轭，也通过EDC/NHS，随着HA上5βCA含量的增加，效率显著提高。当Cy7.5直接偶联到HA时，共轭效率为～11%，对于30%配体共轭的NP，其平均效率增加到～35%(). 因此，我们推测HA疏水性的增加可能为疏水染料功能化创造了更有利的条件。
3.2. HYAL降解
HA（100 kDa）和HA100-5 CA（加利福尼亚州）H（H）HYAL降解24小时，并使用SEC分析MW的变化(). HA的色谱图100HYAL治疗前()在HA的左边100-5 CA（加利福尼亚州）H（H）即使两亲性共轭物的分子量较高。这可能是由于HA的结构更紧凑100-5 CA（加利福尼亚州）H（H）与游离HA在流动相中通过尺寸排除柱洗脱时的随机线圈和扩张形态进行比较。HA的两个色谱图100和HA100-5 CA（加利福尼亚州）H（H）用HYAL处理后右移，表明MW降低。HYAL在每个色谱图中的峰很容易识别。哈100-5 CA（加利福尼亚州）H（H）之所以选择进行此分析，是因为100kDa可以很容易地与HYAL区分，高疏水含量代表HA改性的最高程度。HA在用疏水部分进行合成修饰后仍可生物降解，如HA所示100-5 CA（加利福尼亚州）H（H）与HYAL孵育时降解。
HA降解100和HA100-5 CA（加利福尼亚州）H（H）在HYAL酶存在下，使用疏水配体进行化学修饰（A）和（B）后，使用尺寸排除色谱进行研究。随着时间的增加，光散射色谱图向右移动，表明纯HA和HA衍生物因HYAL酶而降解。添加了相同条件下HYAL酶的SEC色谱图（C）作为参考。
3.3. 粒度和Zeta电位测定
通过DLS和TEM测定NanoCy7.5的直径(). NP的大小高度依赖于HA主干的分子量。基于10kDa HA的NanoCy7.5的有效直径范围为100~130nm，而基于100kDa HA的NanoC Cy7.5则明显更大，范围为300~600nm(). 总的来说，自NanoCy7.5以来，我们观察到HA与疏水部分结合后的粒径增加10升，纳米Cy7.510小时，纳米Cy7.5100-L，和NanoCy7.5100-H型与不含5βCA、NanoCy7.5的类似物相比，具有更高的粒径10-Ø和NanoCy7.5100-Ø.对于NanoCy7.510-Ø和NanoCy7.5100-Ø即，当不存在疏水部分时，少量～0.2 mol%的Cy7.5不足以驱动HA聚合物链的稳定自组装。这可以通过光学特性来证明()其中，与NanoCy7.5相比，不含5βCA的NP对荧光猝灭的影响较小10升，纳米Cy7.510小时，纳米Cy7.5100-L之间，和NanoCy7.5100-H型随着5βCA的引入，形成了更明确的疏水区域，导致粒径增大和荧光猝灭，如下文第3.4节所述。
在水中对使用5 CA和Cy7.5染料功能化的10 kDa和100 kDa HA NP进行DLS分析，以确定粒径（A）。不同疏水配体含量形成的HA NP的平均粒径分布曲线：无配体、10%和30%（理论上）。B） NanoCy7.5的TEM10小时和NanoCy7.5100-H型粒径显著减小（NanoCy7.5为40nm10小时NanoCy7.5和～200 nm100-H型)与DLS相比。比例尺为500纳米。
NPs自组装后的吸收和荧光特性（单位：H2O） 和拆卸（1:1 H2O： DMSO）。纳米Cy7.5100-Ø（A） 和NanoCy7.5100升（B） 显示为说明最低（猝灭）和最高（活化）荧光猝灭NP的光学性质。在活化（H2O） 和淬火状态（1:1 H2O： DMSO）使用LI-COR近红外成像系统，800 nm通道。不同NPs配方中Cy7.5在水和1:1 H中的荧光活化和猝灭2O： 对二甲基亚砜进行了研究，以推断其淬火活化特性随疏水配体（C）数量的变化规律。
由于TEM样品制备过程中NP的HA组分脱水，TEM测定的粒径小于DLS[32,33]. 例如，在，纳米Cy7.510小时与DLS测定的HD相比，直径小80%（～20 nm）；纳米Cy7.5100-H型经TEM测量，直径约小75%。
正如预期的那样，由于HA上的羧酸基团，每个NP的Zeta电位为负值(). NanoCy7.5的Zeta电位值范围为−39.8 mV100-ØNanoCy7.5至−31.9 mV100-H型对于基于100kDa HA或10kDa HA的NP系列，zeta电位随疏水部分含量的增加而增加；然而，这一趋势在统计上并不显著。
3.4. 光学特性
研究了NanoCy7.5纳米颗粒在氢的1:1溶液中的近红外吸收和荧光2O： 研究二甲基亚砜的自组装和拆卸对光学性能的影响。所有NP均在0.2 mg/mL浓度下进行研究，未观察到聚集行为（由DLS测定，数据未显示）。NanoCy7.5纳米颗粒在水中表现出广泛的消光光谱(). 在H中2O： 二甲基亚砜溶液的吸收光谱恢复了Cy7.5的形状特征。相应地，Cy7.5荧光在H中被不同程度地猝灭2O与H中的强荧光相比2O： 二甲基亚砜(). 水中宽消光光谱和猝灭荧光的联合观察表明，荧光团紧密包裹在纳米颗粒自组装过程中[28,34].
还比较了疏水部分含量和HA分子量对消光和荧光性能的影响(). Cy7.5与HA（10和100 kDa）的结合导致荧光信号减弱，可能是由于染料的相对疏水性。Mok等人在ICG与HA直接偶联时观察到类似的猝灭[34]. 纳米Cy7.510升和NanoCy7.5100升几乎完全淬火。出乎意料的是，5βCA含量较高的NanoCy7.5荧光猝灭程度较低。我们假设，较高的5βCA含量为Cy7.5创造了“可溶性”结构域，导致自聚集和自猝灭减少。NanoCy7.5的NIR成像进一步证实了这一点100-Ø和NanoCy7.5100升在800 nm信道中使用近红外成像系统(插图）。
3.5. 纳米粒子细胞毒性
使用CCK-8分析测试NanoCy7.5 NPs的细胞毒性。NP组归一化为未处理的细胞。总的来说，用NanoCy7.5处理的所有MDA-MB-231和PC-3细胞的存活率>80%(). 没有观察到依赖于分子量或配体结合程度的NP之间的明显关系。
用文库10kDa和100kDa HA NPs培养MDA-MB-231（A）和PC-3（B）细胞24小时，进行CCK-8分析。
3.6. 流式细胞术测定纳米粒子摄取
利用流式细胞术研究了纳米Cy7.5纳米粒在乳腺癌和前列腺癌细胞系MDA-MB 231和PC-3中的摄取。经抗CD44-PE流式细胞术证实，这两种细胞系均呈CD44阳性。我们首先通过监测在1、4、8和24小时时Cy7.5荧光阳性细胞的百分比来检测每个NP的摄取动力学。对于基于10kDa和100kDa HA的NP，摄取在8小时内增加。接下来，在37°C与4°C下进行NanoCy7.5摄取，以确定NP是否通过能量依赖性过程（例如，在37℃时普遍存在的内吞作用）被内吞()而不是4°C。我们观察到，与37°C相比，4°C时MDA-MB 231细胞中Cy7.5荧光阳性细胞减少了35–50%。对于PC-3细胞，我们观察到在4°C时NP摄取显著降低的类似趋势。总的来说，对于每个测试的NanoCy7.5，Cy7.5阳性细胞减少了50-90%().
NanoCy7.5摄取的动力学和热力学（A–E）。NanoCy7.5进展的FACS数据10-ØMDA-MB 231细胞在1、4和8小时时间点（A）以及37°C与4°C温度（B）下的NP摄取。在37°C（C）下对MDA-MB 231细胞进行共聚焦显微镜检查，并使用4°C（D）和NucBlue®（蓝色，细胞核）和Rab5（绿色，早期内体）染色来观察NPs的摄取（红色，Cy7.5）。与37°C相比，在4°C时摄取量最小（红色荧光）。比例尺表示所有图像上的20µm。使用FACS分析（E）研究了37°C和4°C下MDA-MB 231（黑条）和PC-3细胞（绿条）中具有可变配体含量（0-30 mol%）功能化的NanoCy7.5的NP摄取。结果以Cy7.5荧光阳性细胞百分比表示。
使用共焦显微镜可视化NanoCy7.5在细胞内的定位。在37°C下，NanoCy7.5荧光（红色）与内体标记Rab 5（绿色）共同定位，主要定位在细胞核附近（蓝色），。使用10 kDa或100 kDa HA制备的NP在定位方面没有差异（数据未显示）。与37°C相比，NPs荧光（Cy7.5，红色）在4°C时显著减弱，而核染色和Rab5信号在4°C时保持一致，这表明由于4°C下能量依赖性内吞作用受到抑制，NP摄取减少。
3.7. 过量透明质酸存在下纳米粒子的摄取
在存在过量HA的情况下，在MDA-MB 231细胞中摄取NanoCy7.5 NP。HA是CD44和RHAMM受体的内源性配体，在几种癌症类型上过度表达。因此，我们假设NanoCy7.5细胞摄取可以通过预处理过量HA来阻止，并作为NanoCy7.5靶向CD44的一种措施。在有和无HA预处理的细胞中培养1 h后，通过流式细胞仪测定NanoCy7.5的摄取。出乎意料的是，当NanoCy7.510-Ø，纳米Cy7.510升和NanoCy7.510小时与10kDa HA（对应于这些NP中的MW）预孵育，没有观察到Cy7.5信号的显著降低。相比之下，含有100 kDa HA的细胞预培养抑制了NanoCy7.5的摄取（以Cy7.5阳性细胞的百分比衡量）100-Ø，纳米Cy7.5100升和NanoCy7.5100-H型()取决于5种CA含量。纳米Cy7.5100-H型与NanoCy7.5相比，具有最高的摄取抑制（高达50%）100升和NanoCy7.5100-Ø这些结果表明，HA MW对NP靶向性有很大贡献。值得注意的是，较长的培养时间，例如8小时和24小时，将NP与预先用HA处理过的细胞一起培养，会导致高百分比的细胞对Cy7.5呈阳性，这表明游离HA只能在相对较短的时间内阻止NanoCy7.5的摄取，这可能归因于NP和HA通过胞内和胞外循环，并与受体达到平衡。
使用FACS在MDA-MB 231细胞（A–C）和共聚焦显微镜（D和E）中研究了NanoCy7.5 NPs对CD44阳性细胞的靶向性。通过在NP处理前用10kDa或100kDa HA预处理MDA-MB 231细胞1h来研究NanoCy7.5的摄取。纳米Cy7.510-Ø，纳米Cy7.510-L，纳米Cy7.510小时用10kDa HA和NanoCy7.5预处理100-Ø，纳米Cy7.5100-L，纳米Cy7.5100-H型用100 kDa HA预处理。NanoCy7.5治疗后NP摄取（A）没有显著变化10小时10kDa MW HA。然而，经NanoCy7.5预处理后，NP摄取量显著降低100-H型100 kDa HA（B）。
所有NP类型的综合FACS结果如（C）所示。使用共焦显微镜分析，与对照组（E）相比，100kDa HA预处理导致NP荧光（D）显著降低。对于所有显微镜图像，比例尺代表20µm。
4.讨论
我们在温和的水性反应条件下，用疏水配体5 CA和NIR染料Cy7.5，用常规的EDC/NHS化学依次修饰天然HA。根据NMR积分测定，疏水配体对两种分子量HA的官能团化效率接近90%。Cy7.5结合程度主要通过NanoCy7.5在水：二甲基亚砜混合物中的UV-Vis吸收进行量化，最高可达1.25 mol%。DLS和TEM测定的NP粒径取决于HA的分子量，与10 kDa（～50–100 nm）相比，产生了100 kDa HA的较大颗粒（～300–400 nm）。以前曾报道过类似NP的临界胶束浓度在25–170µg/ml之间，具体取决于取代度[25].
文献中使用其他HA-衍生NP制剂报道了由于疏水荧光分子在水溶剂条件下聚集而观察到的NanoCy7.5 NP的荧光猝灭。例如，Wang等人使用新开发的NIR荧光标记以不同摩尔比1–17%修改HA[35]. 他们的研究表明，近红外荧光团含量增加了荧光猝灭的程度。这是因为染料分子之间的聚集和能量传递增加。在另一项研究中，Mok等人开发了ICG封装的HA基纳米凝胶，用于肿瘤和淋巴结的NIR成像[34]. 由于染料分子之间的自组装和能量传递非常接近，ICG荧光信号在没有HYAL的水溶液条件下被猝灭。然而，随着透明质酸酶的增加，荧光信号显著增加，透明质酸酶类可降解ICG纳米凝胶并破坏自组装。这些共轭物的量子产率可能与非共轭Cy7.5的量子产率相似，估计其量子产率与吲哚菁绿和IR800的量子产率类似，介于5-10%之间[36,37].
CD44的细胞毒性研究+乳腺癌和前列腺癌细胞系。使用CCK-8活性测定法在生理浓度下测试的浓度下，发现NanoCy7.5 NP无毒，与先前开发的HA NP配方一致[22,28]. 与MDA-MB 231和PC-3细胞系的37°C相比，4°C时细胞NP摄取显著降低。NP荧光在整个细胞中都能观察到，并且在核周区域周围显著可见。这与Choi等人使用与Cy5.5染料共轭的HA基NP获得的结果类似[25]他通过CD44受体介导的内吞作用，通过NP摄取，在癌细胞中观察到Cy5.5荧光。在另一项研究中，Li等人开发了基于HA-脱氧胆酸的胶束，用于肿瘤细胞液中紫杉醇的氧化还原敏感释放[38]. 他们通过共焦显微镜将尼罗河红染料加载到NP胶束中，研究了这些药物载体在MDA-MB 231细胞中的定位。结果表明，NP胶束遍布胞浆，尤其是细胞核周围；然而，没有一个被原子核占据。我们还观察到NP与Rab5的共同定位，表明这些NP存在于早期内体中。这些机制信息对于进一步设计和开发这些NP以基于内溶酶体环境调节荧光团或治疗释放具有重要意义。
用游离HA预处理MDA-MB-231细胞，研究HA衍生NPs的靶向性。发现NP的靶向能力取决于其MW，这与文献一致[39–41]. Wolny等人研究了分子量对HA靶向CD44的影响[40]. 他们发现，1–20 kDa HA与CD44受体的相互作用比高分子量生物聚合物更可逆，因为高分子量HA（100 kDa或500 kDa）形成多价且持续时间更长的相互作用。例如，Choi等人在与HA-衍生NP孵育之前用250 kDa MW HA预处理SCC7癌细胞，并观察到NP摄取显著减少在体外，结果类似体内[25]. 本文报道的研究表明，NP中的HA分子量和HA分子量作为抑制剂都可以显著影响细胞靶向性和摄取。我们假设，含100kDa HA的细胞预培养会导致多价、与受体紧密结合，从而阻止通过受体介导的内吞作用进一步摄取NPs。有趣的是，摄取抑制与100kDa HA NP、NanoCy7.5中存在的疏水配体数量相关100-H型与NanoCy7.5相比，具有最高的抑制作用（50%的细胞对Cy7.5呈阳性）100升（60%Cy7.5阳性）和NanoCy7.5100-∅︀（90%Cy7.5阳性）。在10 kDa HA NP的情况下，随着疏水含量的增加，NP摄取量没有变化。因此，除了CD44或RHAMM受体介导的内吞作用外，基于10kDa HA NP的NanoCy7.5还可能通过其他机制被内吞。然而，对于基于100kDa HA的NanoCy7.5，细胞摄取的主要途径是依赖HA-受体相互作用，例如CD44或RHAMM，因为自由HA抑制了摄取。然而，游离HA并不能完全抑制摄取，这表明5βCA和Cy7.5对100kDa HA的修饰会影响细胞间的相互作用。出乎意料的是，修饰度最高的100 kDA，NanoCy7.5100-H型游离HA对其抑制作用最大。另一个解释是NP大小和摄取之间的关系。基于10kDa HA的每个NP都表现出较强的吸收能力()并且每个都低于120nm（流体动力学直径）。纳米Cy7.5100-H型和NanoCy7.5100升明显更大（>400nm），并且被抑制到Cy7.5阳性细胞的50%或60%。另一方面，NanoCy7.5100-Ø与其他100kDa HA衍生NP相比，其具有较强的吸收能力，但其HD约为100nm，这与基于10kDa的NP一致。较小的纳米粒子（例如<50 nm）具有最高的内吞率，而大于100 nm的纳米粒子随着NP的增大而逐渐变慢[42]. 很可能NanoCy7.5的大小、特异性和非特异性受体的相互作用以及疏水结合程度都会对基于HA的NP细胞相互作用产生影响。
本报告中开发的一组NanoCy7.5纳米颗粒在其大小、荧光激活猝灭以及CD44靶向能力方面表现出有趣的特性。这些纳米粒子结合物的多功能性可以为成像和治疗提供多种剂型。可以选择不同NP的组合以实现高靶向能力、NP尺寸和光学特性与低靶向能力、NP尺寸和光学特性的对比。
5.结论
我们基于低分子量（10kDa）和高分子量（100kDa）HA开发了新的可生物降解NIR荧光NP显像剂。这是可变分子量HA NP显像剂用于研究癌细胞靶向能力和光学特性的初步研究。我们观察到不同的粒径（50–400 nm直径）和靶向性，这都取决于HA的分子量。MDA-MB 231和PC-3细胞通过能量依赖性途径内吞高和低分子量HA NP，并显示出低细胞毒性（细胞存活率超过80%）。与低分子量HA不同，高分子量HA能够抑制NP摄取（抑制率高达50%），这可能是由于与受体的多价相互作用和不太可逆的结合。我们期待未来体内研究证明这些NP在生物分布、肿瘤摄取和停留时间方面的差异取决于HA MW。目前正在进行一项严格的体内研究，以测试这些NP作为图像引导手术对比剂的效率。
重要性声明
在这里，透明质酸（HA）是一种研究得很好的生物大分子，用近红外荧光团和疏水性部分进行了修饰。这项工作的意义，特别是在成像应用中，是可以预测HA分子量和疏水部分共轭程度对荧光和细胞相互作用的影响。根据现有文献，这些基于HA的NP的最终用途是图像引导手术；因此，我们将重点放在共轭染料Cy7.5上，这比大多数现有HA文献的近红外光谱更高。此外，HA是CD44的配体，CD44与癌症和肿瘤微环境细胞有关。这项工作中的系统研究强调，HA可以被调节以最大化或最小化CD44结合。
致谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院的部分支持；P30 CA012197（威克森林大学综合癌症中心）、P30 CA036727（弗雷德和帕梅拉·巴菲特癌症中心，UNMC）、R00 CA153916（AMM）和R01 EB019449（AM）。我们感谢David Horita博士在核磁共振方面的专业知识和帮助，感谢Kenneth Gyabaah在显微镜方面的帮助，感谢Mary Beth Laughridge在FACS分析方面的帮助。
脚注
出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
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