萝卜硫烷诱导2期基因保护视网膜色素上皮细胞免受光氧化损伤

摘要

由于氧化损伤被广泛认为与许多与年龄相关的慢性退行性疾病的病因和进展有关，因此开发抗氧化保护方法是一个优先事项，并可能与疾病预防广泛相关(1). 在这里，我们描述了一种保护视网膜色素上皮细胞（RPE细胞）免受光氧化损伤的策略，该策略通过协调提升（诱导）保护细胞免受氧化剂和电泳物损伤的第2相基因家族的活性(2–5). 本研究补充并扩展了我们最近的证明，莱菔硫烷是一种有效的2期基因诱导剂，可保护人类成年RPE细胞免受以下氧化剂的细胞毒性：叔丁基-过氧化氢丁酯、甲萘醌、4-羟基壬醛和过氧亚硝酸盐(6). 这种保护作用的大小与第2相基因和谷胱甘肽（GSH）水平的升高定量相关(6). Jones、Sternberg和同事(7,8)也证明了通过提高谷胱甘肽水平和诱导第2阶段反应来保护RPE细胞免受氧化损伤。

氧化损伤与老年性黄斑变性（AMD）的病因有关，AMD是老年人失明的主要原因。AMD导致黄斑感光细胞和相关RPE细胞进行性退化。人们普遍认为，这种光感受器的丢失在一定程度上是RPE层退行性改变的继发因素。AMD的两个重要风险指标是水肿的形成和RPE细胞内脂褐素的积累。Drusen和脂褐素是脂类和蛋白质氧化产物的复杂混合物，由正常的氧化代谢和视觉光化学反应产生。RPE细胞吞噬保护功能的下降与AMD的病因有关（参见参考文献。9–11用于审查）。因此，保护RPE细胞免受光氧化损伤的策略在延缓AMD方面可能特别重要。

视网膜和视网膜色素上皮的光氧化损伤主要归因于以下两种光敏剂：视紫红质和脂褐素。视紫红质是发色团11的复合体-顺式-视黄醛和载脂蛋白视蛋白。11的光电转换-顺式-视黄醛至所有-反式-视黄醛（以下简称视黄醛）是视紫红质的光漂白过程，是视觉不可或缺的组成部分。视网膜醛与视网膜的光依赖性变性有关。因此，视网膜第65页^–/–合成视蛋白但不含11的小鼠-顺式-视黄醛也不是全部-反式-视黄醛对光毒性具有抵抗力，因为缺乏一种必需的视黄醇结合蛋白RPE65(12,13). 视网膜醛在细胞内的转运由位于感光细胞内膜的ABCR（ATP-结合盒转运蛋白）介导。脂褐素在视网膜和视网膜色素上皮细胞中积聚美国广播公司^+/–光漂白后，这些动物的视网膜醛水平升高(14,15). 视黄醛在光感受器和视网膜色素上皮细胞中合成并积累，光诱导的眼睛损伤可能涉及这两种细胞的破坏(16,17). 总之，这些研究提供了证据，证明视网膜的发色团，如视黄醛或其他类视黄酸，在光感受器和RPE细胞的光诱导损伤中起着重要作用。一些研究调查了视黄醛介导的蛋白质、脂质和DNA的光氧化损伤(15,18,19). 然而，据我们所知，与广泛研究的脂褐素和A2E相比，目前还没有关于视网膜醛对RPE细胞光敏细胞毒性的信息(10,20,21).

通过饮食直接作用的抗氧化微量营养素，人们在对抗导致AMD的氧化损伤方面付出了大量努力(22). 在最近的一次大规模临床试验中(23)在高危人群中，β-胡萝卜素、生育酚和抗坏血酸联合锌显著延缓了晚期AMD的进展。相比之下，提高固有细胞抗氧化剂第2阶段防御系统活性的可行性，该系统目前被公认为对氧化应激和亲电应激提供主要细胞保护(三,5)，在很大程度上被忽视了。

多种化合物可以很容易地增强2期基因的转录，其中许多化合物已经在人类饮食中被消耗(三,5)例如萝卜硫素，它存在于花椰菜、花椰菜芽和其他常见的十字花科蔬菜中。虽然萝卜硫烷不是一种直接抗氧化剂，但它能激活第2阶段基因的转录，其产物具有化学上的多功能性，通常具有催化作用，并能延长“间接”抗氧化保护期(6,24). 保护免受氧化和电泳损伤的第2相蛋白质包括谷胱甘肽S公司-转移酶、NAD（P）H：醌氧化还原酶（NQO1）、UDP-葡萄糖醛酸转移酶、谷氨酰半胱氨酸连接酶（GSH合成中的速率限制酶）、环氧化物水解酶、血红素氧化酶1（HO-1）、硫氧还蛋白还原酶1、硫氧还原酶和铁蛋白(三,5).

2期基因的转录依赖于上游调节性抗氧化反应元件（ARE）的激活(4,25). 转录因子Nrf2与ARE的相互作用（与Maf小家族成员的异二聚体结合）激活第2相基因的表达(26). 锚定在肌动蛋白细胞骨架上的细胞质阻遏物Keap1与Nrf2紧密结合，限制其向细胞核的移位，并阻止ARE的激活(27). 诱导子破坏Keap1–Nrf2复合体并允许Nrf2迁移到细胞核，在那里它与ARE序列结合并增强2期基因的转录。因此，编号2基因敲除小鼠是评估第二阶段基因在抵抗电泳和氧化应激中的作用的有用模型。纯合子中第2相基因的转录诱导基本上被取消编号2^–/–突变小鼠(26)由第2阶段基因编码的mRNA和蛋白质水平较低，并且比WT对应物更容易受到致癌物和氧化剂的影响(28–30).

在这里，我们通过检测保护效果与诱导剂的结构和效力之间的关系，报告了2期基因诱导如何保护RPE细胞免受视网膜醛介导的光氧化损伤。通过量化转基因小鼠成纤维细胞的光氧化损伤，提供了保护依赖于2期基因诱导调节的额外证据，其中基普1和/或编号2基因功能失调。

实验程序

化学制品。维甲酸；异硫氰酸己酯（ITC）；丁硫氨酸亚砜胺（BSO）；和3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-三苯基四唑溴化铵（MTT）购自Sigma。合成萝卜硫烷[1-异硫氰酸基-（4-R、 S公司)-（甲基亚砜基）丁烷]来自LKT实验室（明尼苏达州圣保罗）。我们实验室合成了2-羟基-双（亚苄基）丙酮和4-羟基-双-亚苄基丙酮(31).

细胞。成人RPE细胞（ARPE-19；目录号CRL-2302）取自美国类型培养物收集。细胞在5%CO的气氛中生长₂/37°C下95%的空气，在含有等量DMEM和Hanks的F12培养基（补充10%FBS）的培养基中，用1%（wt/vol）的活性炭在55°C下加热90分钟，然后过滤。

来自13.5天大的胚胎的稳定成纤维细胞系编号2^–/–,基普1^–/–、和keap1型^–/–::编号2^–/–Wakabayashi建立了双敲除小鼠等. (32,33). 所有成纤维细胞系均保持在37°C、5%CO的环境中₂/95%空气，在Iscove改良Dulbecco培养基中加10%FBS。

细胞治疗和光照。将ARPE-19细胞（50000个细胞/孔）置于24孔板（Falcon）中并培养24小时。丢弃培养基，用含有2相酶诱导剂系列稀释液的培养基替换。在孵育指定时间后，在无血清培养基中用维甲酸在黑暗中处理细胞2小时。然后用PBS替换培养基，并将细胞暴露于320–400 nm的紫外线（UVA光）或装有四个UVA灯（F20T12/BL/HO 2ft；National Biological，Twinsburg，OH）的盒子中的荧光灯下或四个商用25W荧光灯，电池和光源之间的距离为20cm。UVA灯主要在320–400 nm区域发射，峰值在350 nm，但也发射少量UVB（<310 nm）和可见辐射。为了排除短波紫外线，所有平板都盖上盖子（截止波长≈310 nm）。紫外线强度为310 mJ/cm²/最小值。光照后，细胞在无血清培养基中黑暗培养18小时，并测定细胞活力。将小鼠胚胎成纤维细胞以每孔150000个细胞的速度置于24孔板中，并用视黄醛和光照对其进行相同的处理。

细胞活力。指定处理后丢弃培养基，用PBS清洗细胞三次。然后每个孔在无血清培养基中接受500μl MTT（0.5 mg/ml）。将平板在37°C下培养2小时；丢弃MTT溶液；向每个孔中添加500μl DMSO；将平板在轨道振动筛上以200 rpm的速度摇晃5 min。在555 nm处测定DMSO溶液的吸光度，并将其与不含视黄醛处理的对照细胞的吸光度相关联。细胞毒性表示为基于555nm处处理细胞与对照细胞的吸光度之比的“存活分数”。在没有光照的情况下，视黄醛对ARPE-19细胞和小鼠胚胎成纤维细胞的活性影响微乎其微。

细胞裂解液的制备。将RPE细胞或小鼠成纤维细胞与0.08%洋地黄素混合（96孔板60μl/孔，24孔板200μl/孔），在37°C下培养15分钟，在振动台上以150 rpm轻轻搅拌15分钟，并在1500×克将上清液用于GSH和NQO1分析。

谷胱甘肽分析。总GSH（氧化和还原）通过偶联的GSH还原酶循环测定中5,5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）的还原率来测定(34,35).

NQO1分析。NQO1的比活性是通过测量在含有细胞裂解物上清液组分、甲萘醌、NADPH生成系统和四氮唑染料MTT的反应混合物中蓝棕色甲氧基氮的形成（在610 nm处吸收）来确定的(36,37).

脂质过氧化分析：硫代巴比妥酸（TBA）活性物质（TBARS）分析。在24孔板中，ARPE-19细胞以50000个细胞/孔的速度进行培养。培养指定时间后，在无血清培养基中用维甲酸在黑暗中处理细胞2小时。然后用PBS替换培养基，并将细胞暴露在UVA光下20分钟。用0.5 ml PBS清洗细胞两次，并添加0.2 ml 0.05%胰蛋白酶溶液5分钟，将细胞分离。将细胞悬浮液（200μl）与400μl 0.44 M H混合_三人事军官₄/300μl 0.6%TBA/25μl 0.2%3,5-di-叔丁基-丁基-4-羟基茴香醚，90°C孵育45分钟，10000×离心克将等分（50μl）加载到Spherisorb 5 ODS（C18150×4.6 mm；Waters）HPLC柱上，用于丙二醛定量。流动相为50 mM KH₂人事军官₄/甲醇（65:35，体积），流速为1ml/min。积分532nm处的丙二醛峰面积，并与标准品进行比较。

ITC的细胞内积累。这些测定是通过与1,2-苯二硫醇的环缩合进行的，该环缩合可检测游离ITC及其二硫代氨基甲酸酯（DTC）衍生物。描述了细胞接触ITC、细胞采集、裂解物制备以及裂解物中ITC和DTC定量的程序(38–40).

双（亚苄基）丙酮衍生物细胞内积累的测量。细胞处理和收获的所有程序均与细胞内ITC的测量相同，只是将细胞颗粒重新悬浮在200μl甲醇中，超声破碎4个15 s周期，并在10000×克持续10分钟。通过HPLC分析上清液部分，以测定双（亚苄基）丙酮衍生物的含量。将裂解产物提取物注入Sil LC8柱（150×4.6 mm；Supelco），并以1 ml/min的流速用甲醇/水（80:20，按体积计）等比例洗脱。获得馏分的紫外光谱（250–450 nm），以确定其2-羟基-双（亚苄基）丙酮和4-羟基-双-亚苄基丙酮的含量，在368和320 nm处具有最大吸收(一_米=36000万^–1·厘米^–1)分别是。

结果

类维生素A的光毒性。维甲酸是维生素A的代谢物，对从视觉到胚胎发育的多种生理过程至关重要。视黄醇及其醛，视黄醛，是视觉周期的主要参与者。视网膜在适当的光照下产生单线态氧，导致自身结构和脂质及其他细胞成分的损伤(1). 为了阐明维甲酸介导的光毒性的效力和特异性，用25或50μM all处理ARPE-19细胞-反式-雷纳醛，全部-反式-视黄醇或全部-反式-维甲酸在黑暗中放置2小时，然后分别在PBS中暴露于紫外线或荧光灯下20分钟或2小时。在无血清培养基中在黑暗中进一步培养18小时后，测定细胞存活率。这三种维甲酸均导致剂量依赖性细胞死亡-反式-在这些视黄醇类化合物中，视黄醇是最强的光毒性剂(图1). 因此，在50μM浓度的维甲酸和20分钟的紫外线照射下-反式-视黄醛、视黄醇和视黄酸分别杀死91.1%、71.2%和38.6%的细胞。对于所有三种类视黄醇，暴露在UVA光下20分钟(图1 左侧)和荧光灯2小时(图1 赖特)导致了类似的细胞毒性。这一发现与视黄醛比相应的醇或酸产生单线态或其他活性氧的倾向大得多一致。然而，这三种类视黄醇也有一些不同的吸收光谱，这也可能导致光氧化损伤的差异。为了将光照期间温度升高的潜在混淆效应降至最低，所有后续实验均使用视黄醛进行，并暴露于紫外线下20分钟。该系统用于评估视黄醛的光毒性，具有高度的重复性。

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图1。

类维生素A的光敏细胞毒性。ARPE-19细胞在黑暗中用25或50μM视黄醛、相应的视黄醇或视黄酸处理2小时；暴露于PBS中的UVA(左侧)或荧光灯(赖特)分别持续20分钟或2小时；并在无血清培养基中培养18小时。将部分存活率与不含维甲酸的相同处理细胞进行比较。误差条指示SD(n个= 6;P（P）< 0.001).

光毒性的氧依赖性。视黄醛介导的蛋白质和脂质损伤是氧依赖性的(15,19). 为了确定视黄醛的光毒性是否也是氧依赖性的，将ARPE-19细胞在PBS中暴露于一系列浓度的视黄醛2小时，转移到充满100%氧气、空气或氦气的密封室中，并在PBS中暴露于UVA 20分钟。然后将细胞在5%CO的无血清培养基中生长18小时₂/95%空气，测定细胞存活率。在所有测试浓度下，氧气都会增加视黄醛的光毒性，并且细胞对氦或空气中的这种毒性更具抵抗力(图2).

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图2。

视黄醛光敏细胞毒性的氧依赖性。ARPE-19细胞在黑暗中用25、50或100μM视黄醛处理2 h；在PBS中暴露于UVA光下20分钟；并在无血清培养基中培养18小时。在100%氦气、100%氧气或空气中进行光照。将分数存活率与不含视黄醛的相同处理细胞进行比较。误差条指示SD(n个= 6;P（P）< 0.001).

细胞毒性和脂质过氧化。研究表明，脂质过氧化可能在光感受器和RPE细胞的退化中起重要作用(10,41). 因此，我们研究了视网膜醛诱导的光氧化毒性是否导致ARPE-19细胞的脂质过氧化，以及脂质过氧化程度是否与细胞毒性相关。在RPE细胞加载一系列浓度（6.12–100μM）的-反式-视网膜和光照下，一组样品通过TBARS分析进行脂质过氧化反应分析，一组重复样品通过细胞活性分析。结果表明，细胞活力的丧失与脂质过氧化的增加呈负相关，两者均依赖于视黄醛的浓度(图3).

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图3。

存活分数与脂质过氧化产物（TBARS）积累的关系。将ARPE-19细胞在黑暗中用一系列浓度的视黄醛处理2 h，在PBS中暴露于UVA光下20 min，并在无血清培养基中生长18 h。将每种视黄醛浓度和TBARS含量（通过HPLC测定）下的部分存活率与无视黄醛的细胞进行比较。误差条指示SD。

萝卜硫烷的保护作用。在早期的一项研究中，我们表明，莱菔硫烷的预先治疗为RPE细胞提供了强大的长期保护，使其免受各种氧化剂的毒性，保护程度与莱菔硫烷的剂量有关，并与诱导第2相反应定量相关(6). 萝卜硫烷治疗还能保护RPE细胞免受视黄醛的光氧化毒性。先前用莱菔硫烷（1.25–5.0μM）处理ARPE-19细胞24小时后，对视网膜醛和光照的暴露具有明显的浓度依赖性保护作用，并且随着莱菔硫烷浓度的升高，ARPE-19细胞的存活率提高(图4 左侧). 例如，在50μM视网膜下，只有9.4%的细胞存活下来，而之前用萝卜硫烷治疗的细胞存活率提高了约3倍，达到27.4%。

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图4。

第2相诱导剂对视网膜醛光敏细胞毒性的保护作用。将ARPE-19细胞在黑暗中用视黄醛（25-100μM）处理2 h，然后在PBS中暴露于UVA中20 min，并在无血清培养基中生长18 h。将部分存活率与未经视黄醛处理的细胞进行比较。显示了六个样本的平均值（变异系数<10%）。(左侧)25μM（后栅）、50μM（中栅）或200μM（前栅）视黄醛对光氧化的保护，方法是事先与萝卜硫烷（0-5μM）孵育24小时(赖特)通过预先与一系列浓度的2-HBA和4-HBA孵育24小时，25μM视黄醛可防止光氧化。

诱导剂的化学结构和保护效力之间的关系。第2相酶诱导剂的效力取决于其结构以及与细胞中蛋白质传感器巯基的反应性(35,42). 例如，双（2-羟基亚苄基）丙酮（2-HBA）和双（4-羟基亚苄基）丙酮(图4 赖特). 然而，2-HBA作为诱导剂的效力几乎是4-HBA的100倍（在小鼠肝癌细胞中使NQO1加倍所需的浓度分别为0.15和14μM）(31,35,42). 因此，2-HBA对视网膜醛光敏氧化的保护作用比4-HBA强得多(图4 赖特). 这一观察结果提供了另一个例子，说明诱导剂的效力与其抵抗氧化应激的能力密切相关。

由于2-HBA的紫外线吸收光谱（最大值在368 nm）与视黄醛的光活化光谱（最大值在≈380 nm）部分重叠，2-BHA的保护作用可能归因于减少光氧化损伤的光过滤。发现2-HBA迅速转化为不在光谱光活化区吸收的代谢物，排除了这种可能性。因此，当融合的ARPE-19细胞与2-HBA（20μM）孵育0、2或24小时，并通过HPLC测定2-HBA的细胞内含量时，可归因于2-HBA的368nm处的吸收在2小时内显著降低，并且在光氧化开始前24小时不再可检测到。

谷胱甘肽合成在防止光氧化中的作用。谷胱甘肽是最丰富的细胞非蛋白巯基。它的合成和还原状态下的维持对于细胞防御损坏的电泳物和活性氧化剂至关重要。GSH水平和氧化状态在保护RPE细胞免受氧化损伤方面的重要性已被广泛记录(43). 第2相蛋白质的诱导总是伴随着组织水平和GSH合成速率的平行增加，这是由谷胱甘肽连接酶的调节亚基和催化亚基的转录上调引起的，谷胱甘苷连接酶是催化GSH合成中速率限制步骤的酶(2,44). 这种酶被蛋氨酸类似物BSO抑制，导致细胞谷胱甘肽水平严重降低(45). 当在BSO存在下用萝卜硫烷处理ARPE-19细胞24小时，然后进行视网膜醛光敏氧化时，萝卜硫素的保护作用部分被取消。这种影响的大小取决于BSO的浓度（100–500μM；表1). 由于BSO是一种相对特异的谷胱甘肽合成抑制剂，这些结果强烈表明，合成和提高谷胱甘苷水平是萝卜硫烷对光氧化的整体保护作用的重要组成部分。

ITC在RPE细胞中的保护作用和积累。ITC的细胞积累水平决定了其诱导2期反应的效力(38,40). 选择两个具有相关结构的ITC，萝卜硫烷和己基ITC，研究其保护作用、第2相酶诱导和细胞内积累之间的关系。与己基ITC相比，莱菔硫烷是RPE细胞更有效的保护剂，可对抗视网膜醛光敏细胞毒性(图5). 值得注意的是，保护程度与诱导2期反应的效力和两个ITC的细胞内积累有关。

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图5。

部分存活率(左侧)，NQO1诱导(居中)，以及萝卜硫素和己基ITC代谢产物的积累(赖特)ARPE-19小区。在用一系列浓度（0-2.5μM莱菔硫烷或己基ITC）孵育24小时后，在黑暗中用25μM视黄醛处理细胞2小时，在PBS中暴露于UVA光下20分钟，并在无血清培养基中生长18小时。将部分存活率与不使用视黄醛的细胞进行比较。将10 cm平板中的汇合细胞与萝卜硫烷（5μM）或己基ITC（5μM）孵育，并在指定时间收获。NQO1的特异性活性在细胞裂解液中测定，并表示为未接触ITCs的处理（T）细胞与对照（C）细胞的比率。ITCs（及其结合物）的细胞内积累由环缩合试验测定，并表示为每毫克蛋白质的环缩合产物（ccp）纳米。误差条指示SD(n个= 6).

Keap1–Nrf2复合物在第2相酶对光氧化损伤的保护作用中的重要性。现在有充分证据表明编号2该基因已被破坏，在许多组织中都有低水平且通常不可诱导的第2相蛋白质，这些动物更容易受到致癌物的影响，并且不能像野生动物那样受到第2相诱导物的保护(29,30). 这些转基因动物对高氧也更加敏感。因此，在暴露于高氧、肺过度通透性、巨噬细胞炎症和上皮损伤后72小时编号2^–/–小鼠分别比对照组大7.6倍、47%和43%编号2^+/+老鼠(46).

Keap1–Nrf2复合物在调节第2相基因对光氧化损伤的保护作用中的重要性通过编号2^–/–[N0]中，基普1^–/–[K0]，和基普1^–/–::编号2^–/–转基因小鼠建立的[K0N0]双敲除胚胎成纤维细胞系。我们首先测量了这些敲除细胞中的NQO1和GSH水平。NQO1和GSH的基础水平在编号2^–/–细胞。相反，基普1^–/–由于Nrf2没有被抑制，细胞中NQO1和GSH水平极高(图6). 这些级别位于基普1^–/–细胞不仅比编号2^–/–单元格和中基普1^–/–::编号2^–/–双敲除细胞，但也高于WT细胞(图6).

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图6。

基本NQO1特定活动(左侧)和谷胱甘肽水平(赖特)来源于WT小鼠的胚胎成纤维细胞，以及小木桶1（K0），编号2（N0），或基普1和编号2（K0N0）基因被破坏。错误条指示SD(n个= 8). 不同细胞类型的NQO1（μmol/min/mg蛋白）和GSH（μmol/mg蛋白）的平均值±SD分别为：K0，1260±13.8和314±10.0；重量，80.0±8.66和173±19.5；K0N0，19.9±1.38和80.0±4.63；和N0分别为28.0±2.71和58.5±1.11。

当来自三种转基因动物的成纤维细胞受到视黄醛和UVA光的攻击时，它们对光氧化损伤的抵抗力显著不同，并且与这些细胞中相应的基础2相表达水平定量相关。因此，编号2^–/–细胞对光氧化损伤最敏感，而基普1^–/–细胞是最具抵抗力的。WT成纤维细胞比编号2^–/–和keap1型^–/–::编号2^–/–双敲除细胞，但比keap1型^–/–单元格(图7). 视网膜醛（6.25–25μM）诱导光氧化损伤后，细胞存活顺序为keap1型^–/–>重量>基普1^–/–::编号2^–/–双淘汰赛>编号2^–/–在所有测试浓度的视黄醛下(图8). 细胞存活分数与内源性GSH和NQO1水平密切相关(图8).

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图7。

视黄醛对来自WT小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞的光敏细胞毒性，以及基普1（K0），编号2（N0），或基普1和编号2（K0N0）基因被破坏。将这些小鼠的胚胎成纤维细胞以每孔150000个细胞的速度接种在24孔板中；6.25μM（后栅）、12.5μM（中栅）和25μM（前栅）视黄醛在黑暗中处理2 h，然后在PBS中暴露于UVA中20 min；并在无血清培养基中培养18小时。将部分存活率与不含视黄醛的相同处理细胞进行比较。结果以平均值给出(n个= 6).

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图8。

小鼠胚胎成纤维细胞对视网膜醛的氧化光敏性。WT小鼠胚胎成纤维细胞GSH基础水平与NQO1特异性活性的相关性基普1（K0），编号2（N0）或两者基普1和编号2（K0N0）基因被破坏。小鼠胚胎成纤维细胞生长24小时，然后在黑暗中用3.2、6.3、12.5和25μM的视黄醛处理2小时；在PBS中暴露于UVA中20分钟；并在无血清培养基中培养18小时。将部分存活率与不含视黄醛的相同处理细胞进行比较。

讨论

许多证据表明，氧化和光氧化损伤在慢性退化性眼病（如AMD）中起着核心作用。因此，制定简单的长期战略来打击这种损害十分重要。虽然通过频繁服用直接作用的抗氧化剂补充剂可以减缓AMD的进展，但增强内源性第2阶段反应的策略很有吸引力，因为它可以通过饮食方式实现，并且不依赖于在保护过程中消耗的小分子的直接抗氧化作用。第2阶段基因的诱导导致蛋白质水平的提高，这些蛋白质具有一系列抗氧化活性，包括谷胱甘肽的合成及其还原形式的维持。这些保护作用主要是催化作用和持久性。

在这些实验中，我们将重点放在人类成年RPE细胞上，因为人们认为它们在保护感光器免受视觉过程中氧化和光氧化副产物的毒性方面发挥着重要作用。大量证据支持这样的观点，即视网膜醛对ARPE-19细胞的光氧化损伤是慢性退化过程的相关模型。我们提供了实验证据，支持这样的结论，即诱导第2阶段反应在很大程度上（如果不是唯一的话）负责观察到的对在紫外光存在下由视网膜醛介导的光氧化损伤的保护。有效的诱导剂，如萝卜硫烷或某些迈克尔反应受体，比化学关系密切但效力较低的类似物更有效的保护剂。此外，来自诱导剂机制失调或有缺陷的转基因小鼠的成纤维细胞显示出与2期成分水平定量相关的保护作用，如其GSH浓度和NQO1活性所反映的。

尽管本文报道的大多数实验都是在RPE细胞上进行的，但所描述的现象并非这些细胞所独有。在小鼠胚胎成纤维细胞中也观察到了对视黄醛光氧化损伤的保护作用。使用WT和转基因小鼠的成纤维细胞是因为它们比这些动物的RPE细胞更容易获得。此外，我们在参考文献中展示了。62期反应的诱导不仅保护了人RPE细胞，还保护了小鼠L1210白血病细胞和人角质形成细胞免受各种氧化剂的影响。因此，我们认为本文中描述的现象对许多细胞类型具有更广泛的意义。ITC萝卜硫烷源自其天然存在的硫代葡萄糖苷前体葡糖苷，在防止光氧化应激方面非常有效，这一发现非常有趣，因为萝卜硫素已经是人类饮食的组成部分，因此长期服用可能相对安全。

致谢

笔记

缩写：AMD，年龄相关性黄斑变性；BSO，丁硫氨酸亚砜胺；谷胱甘肽；2-HBA，双（2-羟基亚苄基）丙酮；4-HBA，双（4-羟基亚苄基）丙酮；ITC，异硫氰酸盐；MTT，3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-三苯基四唑溴化铵；NQO1，NAD（P）H：醌氧化还原酶；PBS、Dulbecco的PBS；视网膜色素上皮细胞；TBA，硫代巴比妥酸；TBARS、TBA活性物质；萝卜硫烷，1-异硫氰基-4-（甲基亚砜基）丁烷。

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