细胞宿主微生物。2016年1月13日；19(1): 114–126.
高通量检测和发现阻断疟疾传播的小分子
,1,7 ,2,7 ,2 ,2 ,三 ,三 ,三 ,2,8 ,2 ,4 ,1 ,4 ,1 ,1 ,1 ,5 ,4,6 ,4 ,三和2,∗
大卫·M·。普劳夫
1诺华研究基金会基因组研究所，10675 John J.Hopkins Drive，San Diego，CA 92121，USA
梅兰妮·雷伊
2加利福尼亚大学圣地亚哥医学院儿科药理学和药物发现科，美国加利福尼亚州拉霍拉市吉尔曼大道9500号，邮编：92093
艾伦·Y。杜
2加利福尼亚大学圣地亚哥医学院儿科药理学和药物发现科，美国加利福尼亚州拉霍拉市吉尔曼大道9500号，邮编：92093
斯蒂芬·梅斯特
2加利福尼亚大学圣地亚哥医学院儿科药理学和药物发现科，美国加利福尼亚州拉霍拉市吉尔曼大道9500号，邮编：92093
李凤武
三加利福尼亚大学圣地亚哥医学院医学系传染病科，地址：9500 Gilman Drive，La Jolla，CA 92093，USA
凯拉什·帕特拉
三加利福尼亚大学圣地亚哥医学院医学系传染病科，地址：9500 Gilman Drive，La Jolla，CA 92093，USA
阿里斯塔·卢巴尔
三加利福尼亚大学圣地亚哥医学院医学系传染病科，9500 Gilman Drive，La Jolla，CA 92093，美国
Shinji L.公司。奥基苏
2加利福尼亚大学圣地亚哥医学院儿科药理学和药物发现科，美国加利福尼亚州拉霍拉市吉尔曼大道9500号，邮编：92093
埃里卡·L·。弗兰纳里
2加利福尼亚大学圣地亚哥医学院儿科药理学和药物发现科，美国加利福尼亚州拉霍拉市吉尔曼大道9500号，邮编：92093
加藤信孝
4马萨诸塞州剑桥市主街415号布罗德学院，邮编02142
奥尔加·塔纳塞克
1诺华研究基金会基因组研究所，10675 John J.Hopkins Drive，San Diego，CA 92121，USA
Eamon Comer公司
4马萨诸塞州剑桥市主街415号布罗德学院，邮编02142
周斌
1诺华研究基金会基因组研究所，10675 John J.Hopkins Drive，San Diego，CA 92121，USA
凯利·库亨
1诺华研究基金会基因组研究所，10675 John J.Hopkins Drive，San Diego，CA 92121，USA
周英耀
1诺华研究基金会基因组研究所，10675 John J.Hopkins Drive，San Diego，CA 92121，USA
勒罗伊
5疟疾药物公司（MMV），邮政信箱1826，地址：瑞士日内瓦15号1215 Route de Pré-Bois 20号
斯图亚特·L。施赖伯
4马萨诸塞州剑桥市主街415号布罗德学院，邮编02142
6美国马萨诸塞州剑桥市剑桥中心7号哈佛大学化学与化学生物学系，邮编02142
克里斯蒂娜A。策划人
4马萨诸塞州剑桥市主街415号布罗德学院，邮编02142
约瑟夫·维内茨
三加利福尼亚大学圣地亚哥医学院医学系传染病科，地址：9500 Gilman Drive，La Jolla，CA 92093，USA
伊丽莎白A。温策勒
2加利福尼亚大学圣地亚哥医学院儿科药理学和药物发现科，美国加利福尼亚州拉霍拉市吉尔曼大道9500号，邮编：92093
1诺华研究基金会基因组研究所，10675 John J.Hopkins Drive，San Diego，CA 92121，美国
2加利福尼亚大学圣地亚哥医学院儿科药理学和药物发现科，美国加利福尼亚州拉霍拉市吉尔曼大道9500号，邮编：92093
三加利福尼亚大学圣地亚哥医学院医学系传染病科，地址：9500 Gilman Drive，La Jolla，CA 92093，USA
4马萨诸塞州剑桥市主街415号布罗德学院，邮编02142
5疟疾药物公司（MMV），邮政信箱1826，地址：瑞士日内瓦15号1215 Route de Pré-Bois 20号
6美国马萨诸塞州剑桥市剑桥中心7号哈佛大学化学与化学生物学系，邮编02142
7第一作者
8现住址：美国马萨诸塞州比勒里卡市EMD Serono研究开发所，邮编02370
2015年9月4日收到；2015年11月13日修订；2015年12月11日验收。
这是一篇CC BY许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
- 补充资料
文件S1。图S1-S3、表S5和补充实验程序
GUID:FE8A738C-8ACC-41D6-8308-5F3741F7733C
表S1。MMV对照化合物和已知的抗疟疾药物
GUID:CABF2EDA-7EA8-4C98-8C6E-D3AE1558A6D0
表S2。MMV疟疾盒化合物
GUID:E29620C1-0F54-4753-A0B0-376A4424F281
表S3。GNF疟疾箱化合物
指南：3B72D518-9041-4BF4-A95E-9B0E56A60F59
表S4。广泛的DOS化合物
GUID:53D273F0-98C8-4C9C-81E8-927F11B92EC1
文件S2。文章和补充信息
GUID:BF72DA44-4E6F-4294-A06A-F091D67BE07E
总结
预防传播是疟疾控制的重要内容。然而，目前大多数可用的疟疾传播阻断检测方法吞吐量相对较低，无法应用于大型化学库。我们开发了一种高通量且具有成本效益的分析方法，即皂苷裂解性阶段分析（SaLSSA），用于识别具有阻断传播能力的小分子。SaLSSA对13983种独特化合物的分析发现，当寄生虫发育为代谢静止的V期配子细胞时，90%以上的特征良好的抗疟药物，包括内过氧化物和4-氨基喹啉，以及对无性血液阶段有活性的化合物，失去了大部分杀疟活性。另一方面，我们发现化合物具有一致的低纳米摩尔传输阻断活性，其中一些对无性血液和肝脏阶段表现出交叉反应。这些数据清楚地强调了有性和无性寄生虫之间的巨大生理差异，并为发现和开发阻断传播药物提供了工具和起点。
关键词：传播、疟疾、化疗、配子细胞、，疟原虫
预防人类蚊子传播对控制疟疾很重要。Plouffe等人。开发了SaLSSA，一种一步高通量检测方法，用于筛查疟疾传播阻断活性。SaLSSA分析了大量已知和新的小分子。这为发现和开发阻断传播药物提供了起点。
介绍
疟疾是一种由该属顶复合体真核原生动物引起的媒介传播疾病疟原虫这种寄生虫有一个复杂的生命周期，包括脊椎动物和按蚊。它们的无性繁殖和红细胞的破坏会引起疟疾的症状，包括发烧和寒战。作为对尚不清楚的线索的反应，一部分无性寄生虫分化为雄性和雌性配子体(辛登，1983年)，这个过程需要大约8-12天恶性疟原虫(辛登，2009年). 在此期间，寄生虫代谢宿主红细胞血红蛋白(Hanssen等人。，2012)，同时通过光学显微镜可以识别的五个形态不同的阶段(卡特和米勒，1979年). 性发育的承诺早在寄生虫表现出形态变化之前就发生了，雄性和雌性配子体的产生比例为1比3–5(Gbotosho等人。，2011,Robert等人。，2003)雌性成熟稍晚(Bounkeua等人。，2010). 在人体中，未成熟配子细胞在不同的宿主组织中隔离(罗杰斯等人。，2000)只有完全成熟后才会出现。感染者可能携带配子细胞长达55天(Bousema等人。，2010)成熟配子细胞是唯一能在蚊子中肠中存活、交配、减数分裂并产生下一代寄生虫并传播给新的人类宿主的细胞。
当前一线治疗恶性疟原虫疟疾是青蒿素联合疗法(世界卫生组织，2015年)，不会阻止传输。需要用8-氨基喹啉类药物如伯氨喹或他非喹啉进行后续治疗以阻断传播(Eziefula等人。，2014). 然而，8-氨基喹啉对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者有毒性，这是一种在疟疾流行地区发病率很高的遗传病(卢萨托，1979年).
即使可以通过分析检测具有阻断传播潜力的化合物(Adjalley等人。，2011,Almela等人。，2015,D’Alessandro等人。，2013,Delves等人。，2012年b,达菲和艾弗里，2012年,Lelièvre等人。，2012,Lucantoni等人。，2013,Miguel-Blanco等人。，2015,Ruecker等人。，2014,Sun等人。，2014,田中等人。，2013)，由于多个纯化步骤或吞吐量较低的格式，它们大多不适用于非常大的化学库。此外，一些检测依赖于配子体报告子的使用，这可能会限制其对转基因寄生虫的使用(Adjalley等人。，2011,Peatey等人。，2011). 这里我们描述了克服这些问题的高通量分析。我们将分析应用于特征化和非特征化的化学库。我们的分析揭示了可能阻断疟疾传播的化学化合物的特征，并可能作为独特的阻断传播药物的起点。
结果
开发一种鉴定具有传递阻断活性的化合物的分析方法
同种配子细胞群体的产生
为了创建一个同质的、特定阶段的配子细胞群体，我们优化了前面描述的协议(Fivelman等人。，2007)以及诱导无性、三重同步的配子细胞生成恶性疟原虫高寄生虫血症和部分废培养基引起的NF54寄生虫(A；实验程序). 根据卡特和米勒（1979）每个阶段纯度超过75%(C） 在筛查期间，可复制的寄生虫血症为1.2%–1.6%（数据未显示）。
纯、阶段特异性配子细胞的诱导和发育
（A） 配子细胞生产协议。为了创建阶段I–IV，执行了所有步骤，但为了仅创建阶段V，省略了红色方框指示的步骤。
（B） SaLSSA配子体分析的简化示意流程图。
（C） I-V期配子细胞的Giemsa涂片，以及基于形态的每个阶段的配子细胞计数和百分比（从多个周期汇总的数字）。
（D）Z不同配子体阶段和检测方案的基本值。1384-井TSSA，I-V阶段，2384-油井SaLSSA，I-V阶段，三1536井SaLSSA，第五阶段。
（E） 显示的是稀释序列中活的V期配子体细胞数随时间的变化（0.5小时到6小时）。这些数据是使用V期配子细胞和1536孔SaLSSA（R2> 0.99).
测量非复制寄生虫的生存能力
为了检测存活率，我们使用了染色剂MitoTracker Red CMXRos（MTR Red），它在线粒体膜电位完整的寄生虫中在～600 nm处发出荧光(Pendergrass等人。，2004,Poot等人。，1996) (B） ●●●●。使用自动显微镜检测寄生虫，并显示出良好的相关性（R2=0.99）在每孔添加的活寄生虫数量和MitoTracker Red CMXRos阳性物数量之间(E） ●●●●。
减少液体输送步骤
为了减少液体转移步骤的数量，并使分析更可靠，使用大型无偏见的文库成本更低，我们试验了皂苷的使用，皂苷是一种在红细胞膜双层中产生孔隙的两亲性糖苷，可导致红细胞溶解(Baumann等人。，2000). 我们发现，用0.13%的皂苷处理配子细胞培养物会导致无血清培养基中的红细胞溶解，从而简化了用自动显微镜鉴定寄生虫的过程。在0.5%至0.75%的寄生虫血症和1.25%的血细胞比容下，配子细胞在井底形成单层。MTR红色染色后，每个DMSO对照孔可计数1000个物体（1536）(E） ●●●●。这允许在同一个平板上进行复合曝光和成像，而无需额外的转移步骤。我们将此无血清一步方案称为皂苷溶出性阶段检测（SaLSSA）。我们发现SaLSSA对氨基醇等少数化合物更敏感（见下文）。因此，在某些情况下使用了较旧的含血清检测（两步性阶段检测或TSSA）。
化验评估
实验发现，该检测的质量在所有配子体阶段都很稳定：Z一步方案中，用感染的、二甲基亚砜处理的红细胞和未感染的红细胞计算的主得分范围为0.71至0.80(D） ●●●●。我们评估了荧光强度随时间的变化，在30分钟和360分钟之间没有观察到显著差异（数据未显示）。
对已知抗疟药物的评估表明，只有少数化合物具有抗晚期配子细胞的活性
为了进一步对SaLSSA进行基准测试，我们评估了50种目前用作抗疟药物或抗疟工具化合物的化合物(Delves等人。，2012年a)对单个配子细胞阶段的剂量反应。欧盟委员会50不同化学类别的值显示了不同配子体阶段的不同活性模式，总结如下(和S1（第一阶段）). 大多数化合物产生较高的EC50对抗V期配子体。
表1
针对五个配子细胞阶段的剂量反应测试中针对无性血阶段有效的特征良好的抗疟药物
| 化合物 | 化学类别 | 欧盟委员会50（μM）±标准
| 卵囊缩小术 |
|---|
| 第一阶段 | 第二阶段 | 第三阶段 | 第四阶段 | 第五阶段 |
|---|
| 青蒿素 | 内过氧化物 | 0.024 ± 0.001 | 0.020 ± 0.010 | 0.012 ± 0.002 | 0.037 ± 0.003 | >12.500 ± 0.000 | |
| 青蒿酮 | 内过氧化物 | 0.003 ± 0.000 | 0.002 ± 0.000 | 0.003 ± 0.000 | 0.004 ± 0.001 | >12.500 ± 0.000 | |
| 蒿甲醚 | 内过氧化物 | 0.016 ± 0.006 | 0.005 ± 0.001 | 0.006 ± 0.002 | 0.019 ± 0.004 | >12.500 ± 0.000 | 10μM：75%–99%三 |
| 青蒿素（二氢青蒿素） | 内过氧化物 | 0.006 ± 0.001 | 0.003 ± 0.001 | 0.007 ± 0.000 | 0.021 ± 0.008 | >12.500 ± 0.000 | 1μM：～90%1 |
| 青蒿琥酯 | 内过氧化物 | 0.008 ± 0.002 | 0.004 ± 0.000 | 0.013 ± 0.003 | 0.049 ± 0.013 | >10.601 ± 2.686 | 1μM：～55%1 |
| 甲磺酸OZ439 | 内过氧化物 | 0.011 ± 0.001 | 0.005 ± 0.000 | 0.003 ± 0.000 | 0.002 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | 1μM:100%1 |
| OZ277（RBX-11160） | 内过氧化物 | 0.008 ± 0.001 | 0.004 ± 0.000 | 0.002 ± 0.000 | 0.008 ± 0.003 | >12.500 ± 0.000 | 10μM：75%–99%三 |
| 阿莫地喹 | 4-氨基喹啉 | 0.012 ± 0.001 | 0.006 ± 0.001 | 0.096 ± 0.013 | 2.456 ± 0.757 | 1.783 ± 0.119 | 10μM：50%–74%三 |
| AQ-13型 | 4-氨基喹啉 | 0.043 ± 0.002 | 0.033 ± 0.000 | 0.484 ± 0.159 | 6.471 ± 0.888 | 6.051 ± 1.091 | 10μM：25%–49%三 |
| 氯喹 | 4-氨基喹啉 | 0.096 ± 0.007 | 0.098 ± 0.005 | >6.250 ± 0.000 | >6.250 ± 0.000 | >6.25 ± 0.000 | 10μM：25%–49%三 |
| 羟基氯喹 | 4-氨基喹啉 | 0.107 ± 0.011 | 0.131 ± 0.005 | >4.489 ± 2.490 | >6.250 ± 0.000 | >6.25 ± 0.000 | 10μM：25%–49%三 |
| 萘酚喹 | 4-氨基喹啉 | 0.025 ± 0.003 | 0.014 ± 0.000 | 0.296 ± 0.078 | >4.167 ± 0.000 | >4.167 ± 0.000 | |
| 磷酸哌喹 | 4-氨基喹啉 | 0.018 ± 0.002 | 0.014 ± 0.003 | 0.031 ± 0.007 | >4.167 ± 0.000 | >4.167 ± 0.000 | 1μM：～25%1 |
| 磷酸氢吡啶 | 4-氨基喹啉 | 0.013 ± 0.001 | 0.010 ± 0.002 | 0.125 ± 0.079 | 2.579 ± 0.811 | 2.075 ± 0.031 | 1μM：～80%1 |
| 伯喹啉 | 8-氨基喹啉 | 2.467 ± 0.168 | 2.254 ± 0.236 | 5.400 ± 1.471 | 5.151 ± 0.253 | 6.500 ± 0.955 | |
| NPC-1161B型 | 8-氨基喹啉 | 2.002 ± 0.188 | 2.023 ± 0.288 | 3.510 ± 0.013 | 3.599 ± 0.182 | 2.865 ± 0.031 | 10μM：100%三 |
| 帕马奎因（二氢氯喹） | 8-氨基喹啉 | 1.682 ± 0.318 | 1.404 ± 0.000 | 2.411 ± 0.672 | 2.824 ± 0.250 | 2.529 ± 1.033 | |
| 塔非诺奎因 | 8-氨基喹啉 | 4.560 ± 0.942 | 3.682 ± 0.871 | 3.738 ± 0.210 | 3.484 ± 0.300 | 2.449 ± 0.262 | |
| 甲氟喹（+RS） | 氨基乙醇∗ | 0.038 ± 0.001 | 0.039 ± 0.005 | 0.078 ± 0.013 | 0.579 ± 0.600 | 0.158 ± 0.007 | 10μM：100%三 |
| 卤代芳trine | 氨基乙醇∗ | 0.002 ± 0.001 | 0.001 ± 0.000 | 0.023 ± 0.039 | 1.50946 ± 2.072 | 0.007 ± 0.002 | 10μM：75%–99%三 |
| 卢梅凡特林 | 氨基乙醇∗ | 0.013 ± 0.002 | 0.013 ± 0.002 | 0.015 ± 0.006 | 0.599 ± 0.188 | 0.052 ± 0.016 | 1μM：～60%1 |
| 甲基氟喹（种族） | 氨基乙醇∗ | 0.044 ± 0.001 | 0.052 ± 0.006 | 0.143 ± 0.059 | 0.818 ± 0.005 | 0.132 ± 0.003 | |
| 奎尼丁 | 氨基乙醇∗ | 0.138 ± 0.034 | 0.208 ± 0.007 | >9.167 ± 4.714 | >12.500 ± 0.000 | >11.832 ± 0.945 | |
| 二水合硫酸奎宁 | 氨基乙醇∗ | 0.440 ± 0.039 | 0.496 ± 0.115 | >8.775 ± 5.268 | >12.500 ± 0.000 | >8.865 ± 5.141 | |
| 亚甲基蓝三水合物 | 芳香的 | 0.020 ± 0.008 | 0.015 ± 0.005 | 0.013 ± 0.001 | 0.012 ± 0.002 | 0.258 ± 0.029 | 38毫微米：99%2 |
| Thiostrepton公司 | 抗生素 | 3.405 ± 0.157 | 3.373 ± 0.262 | 2.837 ± 0.232 | 1.820 ± 0.419 | 3.261 ± 0.461 | |
| 阿奇霉素 | 抗生素 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.236 ± 0.374 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | 10μM:0%三 |
| 多西环素 | 抗生素 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | 10μM:0%三 |
| 甲氧苄啶 | 抗生素 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| 顺式米林卡霉素（HCl） | 抗生素 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| 反马利霉素（HCl） | 抗生素 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| 磷霉素单钠 | 抗生素 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| 克林霉素 | 抗生素 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| 四环素类 | 抗生素 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| 盐酸氯丙胍 | 抗叶酸 | 9.350 ± 1.506 | 7.794 ± 0.287 | 7.869 ± 0.177 | 5.209 ± 1.107 | 4.798 ± 0.758 | |
| Dapsone公司 | 抗叶酸 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| 嘧啶胺 | 抗叶酸 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| 环鸟苷 | 抗叶酸 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| 盐酸丙胍 | 抗叶酸 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| P218.盐酸 | 抗叶酸 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| 磺胺嘧啶 | 磺胺 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| 磺胺甲恶唑 | 磺胺 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| 磺胺嘧啶 | 磺胺 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| 环己酰亚胺 | 其他 | 1.917 ± 0.060 | 0.640 ± 0.028 | 0.913 ± 0.027 | 0.477 ± 0.402 | 2.692 ± 0.080 | |
| 戊脒 | 其他 | 0.397 ± 0.040 | 0.591 ± 0.027 | 0.697 ± 0.016 | 0.813 ± 0.177 | 2.143 ± 0.189 | |
| 脱氢表雄酮硫酸酯 | 其他 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| 黄素单核苷酸（核黄素） | 其他 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| N-乙酰-D-尼基胺 | 其他 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| 甲磺酸去甲氧基胺盐 | 其他 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
| 嘌呤霉素 | 控制 | 0.123 ± 0.069 | 0.122 ± 0.045 | 0.103 ± 0.039 | 0.110 ± 0.038 | 0.122 ± 0.048 | |
| 阿托瓦孔内 | 萘 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | 2.373 ± 1.995 | >12.500 ± 0.000 | |
| 全球179 | 咪唑并哌嗪 | 0.341 ± 0.090 | 0.064 ± 0.017 | 0.020 ± 0.000 | 0.009 ± 0.005 | 0.003 ± 0.001 | 15毫微米：100%5 |
| KAI407公司 | 咪唑嗪 | 0.593 ± 0.079 | 0.636 ± 0.057 | 0.415 ± 0.073 | 0.329 ± 0.043 | 0.156 ± 0.026 | |
| KDU691型 | 咪唑嗪 | 0.532 ± 0.024 | 0.565 ± 0.009 | 0.354 ± 0.071 | 0.237 ± 0.057 | 0.150 ± 0.001 | 1μM:100%4 |
| KAF246型 | 螺环酮 | 0.001 ± 0.000 | 0.002 ± 0.000 | 0.002 ± 0.000 | 0.002 ± 0.001 | 0.002 ± 0.001 | |
| 107498荷兰盾 | 喹啉-4-甲酰胺 | 0.003 ± 0.000 | 0.005 ± 0.002 | 0.005 ± 0.001 | 0.002 ± 0.000 | 0.009 ± 0.002 | 欧盟委员会50：1.8纳米6 |
| 二甲基亚砜 | 控制 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | >12.500 ± 0.000 | |
4-氨基喹啉类
4-氨基喹啉（氯喹、哌喹、咯萘啶、萘喹、羟基氯喹和AQ13）表现出低nM EC50I期和II期的数值，但从III期开始活性下降，对V期无效。一般认为4-氨基喹啉类药物干扰了血殖素的形成，导致寄生虫死亡，以前的报告表明，氯喹只对早期配子体有效(辛登，1982年)符合SMFA的低活性(Bolscher等人。，2015).
8-氨基喹啉类
8-氨基喹啉显示出一致但高（μM）的EC50所有配子体阶段的值。Primaquine是唯一批准用于阻断传播的药物，其EC为6.5μM50体外对抗V期配子细胞。他非诺喹是一种伯氨喹衍生物，具有EC50针对V期配子细胞的2.4μM。EC显著提高50比ED50这些值是预期值，因为8-氨基喹啉需要代谢才能产生活性。伯氨喹的作用机制以及活性代谢物的特性尚不清楚。
氨基醇
氨基醇不是用来防止传播的，但一些氨基醇（羽扇豆碱、甲氟喹和卤扇豆碱，但不是奎尼丁和奎宁）在使用SaLSSA的所有阶段都表现出活性。然而，我们注意到，在使用TSSA进行复合培养期间，向培养物中添加人血清可以完全逆转这种敏感性。甲氟喹仅在高浓度（10μM）下显示SMFA活性，高于无性生长抑制值（50 nM）约20倍。在人血清中测试某些化合物有望获得更高的准确性并消除假阳性，但这将以牺牲效率为代价。
其他临床相关化合物
抗叶酸药和磺胺类药物干扰核酸合成，包括二氢蝶酸合成酶（DHPS）和二氢叶酸还原酶（DHFR）抑制剂（乙胺嘧啶、P218和氯丙胍），在配子细胞的所有阶段都不起作用，但氯丙胍除外，其EC为μM50针对所有阶段的值。用于治疗疟疾的抗生素，如多西环素和阿奇霉素，对apicoplast起作用，也没有活性。如预期(Fleck等人。，1996)，atovaquone处于非活动状态(). 反复接触后，该化合物在动物体内具有某种传播阻断活性的证据(Blagborough等人。，2013)可能是因为它抑制了ookinete的形成(Delves等人。，2012年a).
具有V期活性的抗疟疾化合物
在我们的测试中，一些未用于人类的抗疟化合物确实显示出对抗V期配子细胞的活性(). 硫硫蛋白是一种抑制原核翻译的大环硫肽抗生素(Harms等人。，2008)并被报道以蛋白酶体和顶端浆体为双重靶点(Aminake等人。，2011). 硫硫蛋白具有μM EC50所有阶段的值。亚甲基蓝的作用方式仍有争议，但它可能抑制谷胱甘肽还原酶(Buchholz等人。，2008)或血佐素形成(Adjalley等人。，2011). 显示低nM EC50第一阶段至第四阶段的数值，第五阶段的活性略有下降，这与亚甲基蓝在38 nM的SMFA中减少99%的传播的报告一致。戊脒，临床上用于治疗和预防卡氏肺孢子虫肺炎（PCP）和昏睡病（而非疟疾）通过EC抑制了所有阶段的配子细胞500.39至2.14μM之间。它的作用机制尚不清楚，尽管有报道称它可以抑制血液佐菌素的形成疟原虫通过与铁原卟啉IX的相互作用(Bray等人。，2003,Stead等人。，2001).
临床开发中的化合物
正在开发的新一类化合物，包括螺吲哚酮(Rottmann等人。，2010)，咪唑哌嗪类(Meister等人。，2011)，咪唑吡嗪类(麦克纳马拉等人。，2013)和喹啉-4-甲酰胺(Baragaña等人。，2015)，都报告了阻断传播的活性，并且这些化合物类别的成员使用SaLSSA进行了测试(). KAF246，一种与临床候选药物KAE609（也称为cipargamin或NITD609）密切相关的螺环酮，对质膜ATP酶PfATP4起作用(Rottmann等人。，2010)，显示预期活性（EC50=1至2 nM）。GNF179，一种与临床候选KAF156密切相关的咪唑哌嗪(Kuhen等人。，2014)在生理相关浓度为15 nM时，SaLSSA中的预期低纳米活性和SMFA中的完全阻断传递活性(A–2C）。PI（4）K抑制剂KDU691在SMFA中抑制1μM的传递(麦克纳马拉等人。，2013)，具有亚微摩尔EC50所有五个配子体阶段的值，与血液阶段的值相似（~200 nM）。这个恶性疟原虫翻译延伸因子2（eEF2）抑制剂DDD107498同样显示出强大的活性，与其他细胞和标准膜喂养试验中报告的活性一致(Baragaña等人。，2015).
MMV疟疾盒与GNF179的比较筛选
（A） MMV665941和GNF179的结构。
（B） MMV665941和GNF179对V期配子细胞的剂量反应体外活性（1536孔格式，SaLSSA一式两份）。
（C） 与二甲基亚砜、GNF179（5×EC）孵育配子细胞的中肠平均卵囊数50)和MMV665941（5×EC50). 实验重复进行。
（D） 所有42个EC的比较50当针对配子细胞阶段I、III和V进行筛选时，MMV疟疾盒化合物的值低于12.5μM。平均EC50与I期配子体相比，V期配子细胞测试的化合物数量显著增加（p<0.05，方差分析，Prism 6）。
文库1:MMV疟疾盒含有阻断传播的化合物
为了确定抗V期疟原虫活性的丧失是典型的还是反映了对奎宁和青蒿素衍生化合物的历史关注，对MMV疟疾箱中的400种化合物进行了检测(Spangenberg等人。，2013). 这些化合物都是在无性血液阶段筛查中鉴定出来的，首先用TSSA对每个配子细胞阶段进行12.5μM的单剂量检测。正如预期的那样，抗早期配子细胞活性最高的化合物数量：216种化合物抑制第一阶段配子细胞活力70%以上，78种化合物抑制第三阶段配子，79种化合物抑制V阶段配子(表S2).
针对I、III和V期配子体进行的50种最活跃化合物的剂量反应分析证实，在50种TSSA化合物中，28种活性<5μM。欧盟委员会5050种化合物中有42种化合物的V期配子体的值明显高于I期配子体的值(D） ●●●●。一些化合物显示EC50TSSA和SaLSSA中V期配子细胞的值≤1.5μM(表S2)，包括MMV665941（V阶段EC501.04μM，SaLSSA，B） 其次是MMV019918（第五阶段EC501.46μM，SaLSSA）。SMFA使用MMV665941进行研究，使用GNF179作为对照，浓度为EC的五倍和十倍50根据上述第五阶段配子体测定计算，以暴露于复合物的配子体为食的蚊子的中肠中没有卵囊，而二甲基亚砜对照组则有(C） ，很可能是因为复合处理的配子细胞没有鞭毛（数据未显示）。
我们进一步研究了18种化合物的子集()报告有抗配子细胞活性(鲍曼等人。，2014,达菲和艾弗里，2013年,Ruecker等人。，2014,Sun等人。，2014)以及使用1536孔SaLSSA针对配子细胞阶段I、III和V的可用荧光素酶-SMFA数据。在这个对照组中，18个中的14个在SaLSSA的至少一个阶段中激活，并且具有EC50小于10μM，其中13个在SMFA中活性(图S3;表S5). 一种可能的假阴性化合物是MMV665882(图S3G） 在SaLSSA中显示出不完整的曲线，但在SMFA中几乎没有活性。该化合物在其他人的活性读数中显示出一些活性(达菲和艾弗里，2013年,Sun等人。，2014). 四个潜在的假阳性包括MMV020492(图S3A） 之前有报道称其对雄性配子的活性较低(Ruecker等人。，2014)但在SMFAs中没有抑制作用，在SaLSSA中没有活性。另外两个假阳性为MMV665827(图S3C） 和MMV007116(图S3D） ，它被证明可逆地抑制雄性配子的形成(Ruecker等人。，2014). 第四种化合物MMV666021(图S3B） 在荧光素酶测定中，晚期配子体中有活性(达菲和艾弗里，2013年)，在单点研究中显示出一些抑制作用，但在剂量反应中未得到证实。该化合物在基于荧光素酶的SMFA中活性较弱（10μM时完全抑制，1.6时部分抑制）。这种化合物差异的原因尚不清楚，但化合物来源、溶解度或寄生虫遗传背景可能会起作用，尤其是当文献报告的血型值（3D7）在90 nM到2μM之间变化时。
表2
| 化合物 | 可行性指数
| 欧盟委员会50（μM）
|
|---|
| 第一阶段 | 第二阶段 | 第三阶段 | 第四阶段 | 第五阶段 | 阶段Asex | 第一阶段 | 第三阶段 | 第五阶段 |
|---|
| 毫米v000442 | 0.120 | 0.192 | 0.385 | 0.633 | 0.442 | 0.362一 | 0.553 ± 0.041 | >10.000 ±0.000 | >10.000 ±0.000 |
| MMV665971年 | 0.056 | 0.097 | 0.137 | 0.171 | 0.416 | 0.489一 | 0.746 ± 0.116 | >10.000 ±0.000 | >10.000 ±0.000 |
| MMV011438型 | 0.005 | 0.005 | 0.015 | 0 | 0 | 0.327一, 0.332b条 | 1.120 ± 0.116 | 2.428 ±0.620 | 4.225 ±0.609 |
| MMV000248型 | 0.006 | 0.057 | 0.061 | 0.085 | 0.121 | 0.719一 | 1.058 ± 0.026 | 3.074 ±0.533 | 3.700 ±0.173 |
| MMV666125型 | 0.006 | 0.002 | 0.071 | 0.196 | 0.234 | 0.381一, 2.844b条 | 0.094 ± 0.068 | 1.342 ±0.259 | 6.154 ±0.569 |
| MMV019918年 | 0.017 | 0.014 | 0.010 | 0.015 | 0.033 | 0.800一 | 1.264 ± 0.145 | 0.576 ±0.069 | 1.463 ±0.296 |
| MMV019266号 | 0.028 | 0.014 | 0.035 | 0.082 | 0.066 | 0.615一 | 0.935 ± 0.214 | 1.372 ±0.210 | 1.743 ±0.206 |
| 396797毫米 | 0.034 | 0.007 | 0.033 | 0.094 | 0.077 | 0.477一 | 5.435 ± 0.470 | 2.094 ±0.424 | 3.477 ±0.175 |
| MMV667491型 | 0.037 | 0.048 | 0.034 | 0.032 | 0 | 1.230一 | 0.980 ± 0.069 | 0.667 ±0.101 | 0.596 ±0.085 |
| MMV019881号 | 0.063 | 0.065 | 0.039 | 0.047 | 0.013 | 0.646一 | 3.048 ± 3.278 | 8.408 ±1.577 | 0.721 ±0.141 |
| MMV000448号 | 0.066 | 0.016 | 0.083 | 0.201 | 0.231 | 0.235一, 0.033b条 | 1.195 ± 0.113 | 5.356 ±0.612 | 4.652 ±0.394 |
| MMV665882型 | 0.116 | 0.092 | 0.122 | 0.168 | 0.130 | 0.466一 | 0.180 ± 0.036 | 1.477 ±0.136 | 0.984 ±0.022 |
| 毫米665941 | 0.157 | 0.020 | 0.095 | 0.061 | 0.110 | 0.255一 | 0.388 ± 0.035 | 2.271 ±0.751 | 1.044 ±0.040 |
| MMV665980型 | 0.240 | 0.184 | 0.087 | 0.108 | 0.247 | 0.211b条 | >10.000 ± 0.000 | 9.350 ±3.237 | 6.612 ±1.100 |
| MMV007116型 | 0.377 | 0.505 | 0.734 | 0.733 | 0.846 | 0.351一, 0.716b条 | >10.000 ± 0.000 | >10.000 ±0.000 | >10.000 ±0.000 |
| MMV665827年 | 0.592 | 0.900 | 0.810 | 0.769 | 0.791 | 0.119一, 0.166b条 | >10.000 ± 0.000 | >10.000 ±0.000 | >10.000 ±0.000 |
| MMV666021型 | 0.610 | 0.871 | 0.740 | 0.897 | 1.055 | 0.094一, 1.998b条 | >10.000 ± 0.000 | >10.000 ±0.000 | >10.000 ±0.000 |
| MMV020492型 | 0.768 | 0.756 | 0.970 | 0.912 | 0.989 | 0.026一 | >10.000 ± 0.000 | >10.000 ±0.000 | >10.000 ±0.000 |
图书馆2：GNF疟疾箱
进一步研究在具有已知血型活性（EC）的化合物组中识别阻断传播化合物的速率50s小于10μM），我们研究了GNF疟疾盒(Plouffe等人。，2008). 这组3558种化合物是在筛选最终浓度为1.25μM的增殖无性寄生虫后产生的。用384孔SaLSSA在1.25μM的单一浓度下对V期配子细胞进行筛选。其中，145种化合物（4.07%）对V期配子细胞的抑制率高于72.3%(图S1A） ●●●●。剂量反应分析表明，145种化合物中有108种被再次确认活性小于1μM，其中22种化合物具有EC50值低于100 nm，与第V阶段配子体相比。不像临床抗疟药()，其中大多数与成熟配子体的活性急剧下降，这些支架几乎都对无性血液阶段和V期配子体具有同等效力。一些最活跃的脚手架(图S1B） 是卡巴肼硫脲(Klayman等人。，1979)以及萘醌类化合物，一种已知对配子细胞具有活性的化合物(田中等人。，2015). 其中一些脚手架也能有效抵抗约埃利P肝细胞发育和侵袭试验(Meister等人。，2011)预测因果预防活动(图S1C类；表S3).
图书馆3：面向多元化的综合图书馆
为了确定在没有预先选择用于对抗无性寄生虫活性的大型文库中发现的活性化合物的比例，我们测试了来自多样性定向合成（DOS）文库的化合物(丹达帕尼和马考雷尔，2010年). 该库的设计目的是用具有骨架和立体化学多样性的小分子广泛填充化学空间(施赖伯，2000年).
使用1536孔SaLSSA在2.5μM下对DOS化合物库中的两组化合物进行V期筛选，共两组(图S2A） ●●●●。第一个是“信息者集”，其中包括9886个化合物，这些化合物被选择来代表所有DOS支架的结构多样性采样，同时还捕获了初步的结构-活性关系（SAR）和立体化学结构-活性关联（SSAR）。25种化合物对两次复制的V期配子体细胞的抑制率均大于30%(表S4，命中率0.25%），17个无结论（在两个重复中的一个中有效）。为了再次确认和研究严重急性呼吸系统综合征和严重急性呼吸系统综合征，对41种化合物以及37种立体异构体和7种选定化合物的类似物进行了剂量反应重新测试。其中13个点击和一个无结论显示EC50在重新测试时，s<5μM，导致重新测试率为23%（或仅命中率为54%）。
第二组化合物包括89种化合物（代表17种支架），之前在血型试验中证明这些化合物对恶性疟原虫Dd2（欧共体50<2μM；N.K.，未公布数据）。这些化合物的作用机制或额外的阶段特异性活性尚未得到进一步评估疟原虫在本研究之前。血液阶段活性化合物使用相同的筛选管道；在这种情况下，15种化合物被鉴定为hits（命中率16.9%）。在剂量反应下，重新测试了这些撞击和两个额外的立体异构体，其中10个化合物表现出EC50s<5μM（复验率67%）。
总的来说，这35首歌包括了12个不同的脚手架，其中有5个单曲，7个脚手架有两个或更多的代表。其中六个脚手架的代表如所示图S2C类；由于在打击中缺乏SSAR和SAR，一个脚手架被拆除。虽然活性需要用重新合成的化合物进行验证，但其中一些确实显示出有趣的活性模式，包括一种对配子细胞具有更强活性的化合物（BRD0608）、四种在所有三个寄生虫阶段都具有活性的化合物和一种化合物（BRD1260）仅对配子细胞和无性血液阶段具有活性(图S2B） ●●●●。其他研究将有助于验证这些数据并研究这些化合物的作用机制。
化学信息化合物聚类
为了进一步验证筛选结果，并确定可作为开发阻断传播药物起点的化合物，所有筛选出的化合物都根据其支架相似性进行了分层聚类。然后，我们确定了结构相关的化合物簇，这些化合物在性活跃组中的富集率高于预期(). 例如，具有最高浓缩分数（浓缩日志）的集群10p=−16.11）由13种与GNF-Pf-3202和GNF-Pf-3600（二氧萘乙酰胺）相关的化合物组成，13种化合物中有10种在配子体分析中具有活性。另一富集簇包含21个结构类似于GNF-Pf-5511和GNF-Pf-5386的化合物（与PfATP4抑制剂相关的四氢异喹啉-4-甲酰胺支架，（+）-二氢异喹诺酮类，（+10p=−7.01）。这并不意外，因为其他PfATP4抑制剂对晚期配子细胞具有活性，并且（+）-SJ733能有效阻止传播(Jiménez-Díaz等人。，2014). 最后一个过度表达的支架族包含库中五种2-呋喃甲酰胺中的四种（GNF-Pf-1329、GNF-Pf-3542、GNF-P-783、GNF-P1696和GNF-Pf 2740）（log10p=−7.35），所有这些药物对V期配子体均表现出中等活性（0.61至0.484 nM），但对无性血液期寄生虫的活性较弱（1.72至>10μM）。据我们所知，这个复合类以前没有与阻塞传输相关。这些数据表明，筛选非常大的文库可能会为发现阻断传播药物提供起点。
阻断传播药物的起点
本研究中的所有化合物均根据其亚结构相似性进行聚类。具有相同亚结构的所有化合物（Tanimoto平均化合物相似性≥0.85）被分配到不同的支架家族（用不同的颜色表示）。非活性化合物显示为圆形节点，配子体活性化合物表示为钻石。LogP是V期配子细胞活性集中相对于每个支架家族的预期概率的对数富集概率。欧盟委员会50值为第五阶段配子体SaLSSA 1536孔格式。
讨论
目前的数据与其他一些实验室报告的数据不同。一些测试表明，蒿甲醚和OZ439等化合物具有小于1μM的晚期配子杀细胞活性(Bolscher等人。，2015,达菲和艾弗里，2013年). 普遍认为成熟配子细胞对内过氧化物具有抵抗力(Delves，2012年,Peatey等人。，2011). 大多数以前的报告将配子细胞阶段结合起来用于晚期配子细胞测试（阶段III-V或IV-V），这可能解释了相互矛盾的复合活性(达菲和艾弗里，2013年,Lelièvre等人。，2012,Peatey等人。，2011,Sun等人。，2014). 另一个考虑是，不同杀配子试验的读数可能因某些药物的作用模式而异，这取决于特定试验干扰的生物途径(Reader等人。，2015).
总的来说，我们的数据表明，与可用的SMFA数据相比，低成本SaLSSA给出的假阳性（如果有的话）很少。另一方面，SaLSSA分析可能会给出一些假阴性结果，并且可能会遗漏配子形成的可逆抑制剂。
在大多数情况下，我们的数据显示，V期配子体细胞对化合物的敏感性低于I期配子体内的配子体，这表明它们在成熟过程中代谢活性降低，为蚊子中肠的后续发育做准备。所获得的标准膜喂养数据仍然是阻断传播活动的金标准，表明抑制V期配子细胞的化合物也可以阻断传播。另一方面，SMFA也可能发现我们的细胞测定会遗漏的化合物，包括具有避孕作用的化合物。考虑到受精发生在蚊子中肠的时间超过几分钟，而晚期配子细胞可以在人体内持续数天，V期配子细胞可能是更具吸引力的治疗靶点。
这项研究的数据表明，哪些蛋白质和通路可能是传播阻断药物的靶点(). 干扰血红蛋白消化的化合物不适合用于阻断传播药物，尽管它们可能会导致配子细胞数量减少，因为早期配子细胞可能会被杀死。此外，DNA复制过程可能不应作为靶点，也不应作为根尖细胞功能（阿奇霉素和强力霉素）的靶点。对成熟配子细胞起作用的化合物的靶点包括在蛋白质翻译（嘌呤霉素、DDD107498、环己酰亚胺、硫链球菌素的靶点）和加工中起作用的蛋白质，包括蛋白质分泌（GNF179）以及蛋白质降解（例如，环氧霉素；Czesny等人。，2009). 有趣的是，功能基因组研究先前表明，配子细胞获取并存储RNA转录物，这些转录物在配子形成过程中迅速转化为蛋白质(Mair等人。，2006)，创建了一个特定的漏洞。参与维持离子内稳态的靶点，如PfATP4和脂质激酶（如PI4K），是传播阻断靶点和无性阶段靶点。
配子细胞中的可药性器官和过程
感染的红细胞（红色）带有成熟配子体（蓝色）和寄生液泡（白色）以及被称为恶性疟原虫药物靶点。上（左）部分显示了对V期配子体（SaLSSA）和无性血液期寄生虫具有类似活性的化合物及其假定的作用模式。下（右）部分列出了与无性血液期寄生虫相比，对V期配子体不起作用的化合物。
Ery：红细胞；Gam：配子体；PPM：寄生虫质膜；PV：寄生液泡；PVM：寄生液泡膜。
应该注意的是，所有这些靶点对无性寄生虫也是必不可少的。通过抑制翻译抑制、自噬、精子功能以及减数分裂，可以实现只针对配子细胞。预计抑制这些过程的化合物将在大型图书馆中以较低的速度被发现，这强调了超高通量筛选的必要性。一个例子是BRD0608，其EC50抗无性血期的配子体比抗V期配子体高15倍，通过药物化学可以提高其对性期的选择性。
BRD0608等化合物的优点是降低了出现耐药性的可能性。感染者体内有数十亿无性繁殖寄生虫，每一种寄生虫都有能力产生耐药性突变并将其传给后代。这是疟疾控制如此困难的一个主要原因。
一个悬而未决的伦理问题是，不能缓解疟疾症状但对整个社区有益的药物是否应该获得许可。可以接种对个人几乎没有益处的疫苗，例如男孩的风疹疫苗，主要推荐给联合保护孕妇，以预防新生儿先天性风疹综合征。疫苗也并非没有风险，人们可能会争辩说，消灭疟疾对人类的益处将超过风险。
实验程序
配子细胞培养
无性恋恶性疟原虫寄生虫（NF54）在含有血清的完整培养基中，以5%的红细胞压积在O+人红细胞中生长（RPMI 1640，庆大霉素0.05 mg/ml，次黄嘌呤0.014 mg/ml，HEPES 38.4 mM，碳酸氢钠0.2%[w/v]，D-葡萄糖0.2%[w/v]，氢氧化钠3.4 mM，4.3%[w/v]热灭活人血清[O+]和0.2%[w/v]AlbuMAX II）37°C，低氧条件下（3%O2，5%一氧化碳2和92%N2)寄生虫病在0.5%和3%之间。环期寄生虫与5%（w/v）d-山梨醇三重同步（d-8，d-6，d-4），培养物从T25扩大到T225培养瓶。在第−4天之前，红细胞压积调整为5%。在第−2天，只有50%的新鲜培养基在7%–10%的高寄生虫血症期间被替换。从第一天开始，每天都会交换媒体。对于I–IV期，在第0天进行磁激活细胞分选（MACS），在第1天同步培养山梨醇。在第0-9天用50 mM NAG处理所有配子细胞。请参见补充实验程序了解更多详细信息。
化合物分析
将I–V期配子细胞稀释至0.50%配子体血症和1.25%红细胞压积，放入两步方案（TSSA）的完整培养基中，或将0.5%–0.75%配子体症和1.25%血细胞压积稀释至无血清SALSSA筛选培养基中（RPMI 1640、庆大霉素0.05 mg/ml、次黄嘌呤0.014 mg/ml、HEPES 38.4 mM、碳酸氢钠0.2%[w/V]，D-葡萄糖0.2%[w/v]，氢氧化钠3.4mM和0.4%[w/v]AlbuMAX II）。使用MultiFlo分配器将培养物（40μl对10μl）分配到含有50 nl或2.5 nl化合物（最终浓度为1.25至12.5μM）的384或1536孔板中。将平板在37°C的低氧条件下培养72小时。对于SaLSSA，向每个孔中添加3μl（1536孔）或10μl（384孔）2.5μM MitoTracker Red CMXRos和0.13%皂苷溶液（w/v），并在37°C下培养板60–120分钟。对于384孔TSSA，向每个孔中添加筛选介质中的5μl MitoTracker Red CMXRos（5μM）。在37°C下20分钟后，将5μl从分析板转移到新的384孔成像板，该板在无血清筛选介质中已经含有40μl MitoTracker Red CMXRos（500nm）。对于TSSA和SaLSSA，培养30分钟后对平板进行成像。
高内容成像和分析
使用高含量成像系统（Operetta、Perkin Elmer）和Harmony软件对384或1536孔板进行图像分析。通过将每个化合物处理孔的颗粒数除以每个板上DMSO孔的平均颗粒数，计算活性指数，范围为0（活性化合物）到>1（非活性化合物）。Z用DMSO处理的配子体细胞作为阳性细胞，未感染的红细胞作为阴性细胞计算值。
SMFA传统
恶性疟原虫NF54寄生虫在0.5%的寄生虫血症和5%的红细胞压积下生长，并在每天更换培养基的情况下持续培养，直到达到V期(格雷戈里等人。，2012). 在与二甲基亚砜中的化合物孵育24小时后，进行SMFA(格雷戈里等人。，2012). 简言之，4-6日龄雌性A.斯蒂芬西使用膜式喂食装置将处理过的配子细胞喂食STE2蚊子15分钟。8天后解剖中肠，计算卵囊数。
SMFA萤光素酶
恶性疟原虫将NF54-L1（hsp70-luc报告子）V期配子体细胞与六倍稀释液的化合物预先孵育24小时。DMSO作为阴性对照，DHA作为阳性对照。化合物被冲走，配子细胞被喂给斯蒂芬斯按蚊蚊子。在感染后第8天，测定每个笼子24只蚊子的发光信号。欧盟委员会50采用四参数logistic回归模型测定s。SMFA由包括该实验室在内的实验室联盟组织，已存放在ChEMBL NTD(https://www.ebi.ac.uk/chemblntd)由TropIQ在荷兰奈梅亨演出。
P.berghei博士肝期浸润试验
如前所述进行肝分期分析(Baragaña等人。，2015). 简单地说，10三
P.berghei博士利用荧光素酶表达的子孢子（纽约大学昆虫）感染HepG2-A16-CD81EGFP公司细胞（用1.25μM化合物预处理）置于1536孔板中。培养48小时后，添加2μl BrightGlo（Promega），并通过Envision Multilabel Reader（PerkinElmer）上的生物发光对EEF生长进行量化。
复合聚类
使用脚手架树算法对13844个测试化合物进行聚类(Schuffenhauer等人。，2007). 然后给每个支架节点分配一个富集分数，以反映活性化合物（V期配子细胞抑制剂）过度表达的程度。我们计算了累积超几何p值，作为在每个支架内观察到的命中次数至少与我们观察到的次数相同的概率。然后修剪树木，以便只保留p值<0.001的支架。中的最终结果树使用Cytoscape（版本3.2.0）渲染。为了关注那些节点的支架可以合理地类似于所有相关化合物成员的完整结构的节点，基于ChemAxon拓扑指纹计算每个支架节点及其相关化合物之间的平均Tanimoto相似性得分（ChemAxon，Kft），这些树节点和树叶的Tanimoto得分至少为0.85分，点击次数至少为三次，在.
作者贡献
D.M.P.和M.W.设计实验，进行筛选和剂量反应分析，分析数据，并撰写手稿；A.Y.D.制备的寄生虫材料；执行的S.MP.berghei博士肝期测定；F.L.、K.P.和A.L.执行标准的膜供给分析；S.L.O.设计实验；E.L.F.分析数据；O.T.和Y.Z.进行复合聚类；E.C.进行数据分析；N.K.进行了Dd2血期分析；C.A.S.协助实验设计分析数据；S.L.S.和D.L.进行了数据分析；E.A.W.设计了实验，分析了数据，并撰写了手稿。所有作者都编辑了手稿，并为写作作出了贡献。
致谢
我们要感谢Irwin Sherman和Jeremy Burrows的有益评论，Omar Vandal的支持，Paul Willis的化学分析，以及TropIQ的SMFA分析。这项工作得到了比尔和梅琳达·盖茨基金会（向E.A.W.提供的OPP10040406和向S.L.S.提供的OPP1035218）和疟疾药物合资公司的支持。E.A.W.得到NIAID拨款R01AI103058和R01AI090141的支持。
工具书类
Adjalle S.H.、Johnston G.L.、Li T.、Eastman R.T.、Ekland E.H.、Eappen A.G.、Richman A.、Sim B.K.、Lee M.C.、Hoffman S.L.、Fidock D.A.对恶性疟原虫性发育的定量评估表明，亚甲基蓝具有强大的传播阻断活性。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2011;108：E1214–E1223。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Almela M.J.、Lozano S.、Lelièvre J.、Colmenarejo G.、Coterón J.M.、Rodrigues J.、Gonzalez C.、Herreros E.一组具有恶性疟原虫传播阻断潜力的新化学起点，用于发现抗疟药物。《公共科学图书馆·综合》。2015;10：e03135139。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Aminake M.N.、Schoof S.、Sologub L.、Leubner M.、Kirschner M.，Arndt H.D.、Pradel G.Thiostrepton及其衍生物通过双重靶向寄生虫蛋白酶体和顶端体表现出抗疟和杀配子活性。抗微生物。代理Chemother。2011;55:1338–1348. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Baragaña B.、Hallyburton I.、Lee M.C.、Norcross N.R.、Grimaldi R.、Otto T.D.、Proto W.R.、Blagborough a.M.、Meister S.、Wirjanata G.一种抑制蛋白质合成的新型多阶段抗疟药。自然。2015;522:315–320. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Baumann E.、Stoya G.、Völkner A.、Richter W.、Lemke C.、Linss W.用皂苷溶血人红细胞会影响膜结构。《组织化学学报》。2000;102:21–35.[公共医学][谷歌学者] Blagborough A.M.、Churcher T.S.、Upton L.M.、Ghani A.C.、Gething P.W.、Sinden R.E.阻断传播干预措施可消除实验室人群中的疟疾。国家公社。2013;4:1812. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Bolscher J.M.、Koolen K.M.、van Gemert G.J、van de Vegte-Bolmer M.G.、Bousema T.、Leroy D.、Sauerwein R.W.、Dechering K.J.。一种新的筛选分析组合，用于确定阻断传播的抗疟药的优先级，揭示了市场和实验药物的不同动态。J.抗微生物。Chemother公司。2015;70:1357–1366.[公共医学][谷歌学者] Bounkeua V.，Li F.，Vinetz J.M.恶性疟原虫体外生成。美国J.特罗普。医学Hyg。2010;83:1187–1194. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Bousema T.、Okell L.、Shekalaghe S.、Griffin J.T.、Omar S.、Sawa P.、Sutherland C.、Sauerwein R.、Ghani A.C.、Drakeley C.《恶性疟原虫配子体循环时间的再探讨：估计配子体携带持续时间和杀配子药物作用的分子检测方法》。马拉尔。J。2010;9:136. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Bowman J.D.、Merino E.F.、Brooks C.F.、Striepen B.、Carlier P.R.、Cassera M.B.抗尖细胞体和杀配子细胞筛选，以确定疟疾箱中化合物的作用机制。抗微生物。代理Chemother。2014;58:811–819. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Bray P.G.，Barrett M.P.，Ward S.A.，de Koning H.P.病原原生动物对戊胺的摄取和耐药性：过去、现在和未来。寄生虫趋势。2003;19:232–239.[公共医学][谷歌学者] Buchholz K.、Schirmer R.H.、Eubel J.K.、Akoacher M.B.、Dandekar T.、Becker K.、Gromer S.亚甲基蓝与人类二硫还原酶及其恶性疟原虫同源物的相互作用。抗微生物。代理Chemother。2008;52:183–191. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Carter R.，Miller L.H.连续培养中恶性疟原虫配子细胞生成的环境调节证据。牛市。世界卫生组织。1979;57（补充1）：37–52。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Czesny B.、Goshu S.、Cook J.L.、Williamson K.C.蛋白酶体抑制剂环氧化合物具有强大的恶性疟原虫配子杀伤活性。抗微生物。代理Chemother。2009;53:4080–4085. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] D'Alessandro S.、Silvestrini F.、Dechering K.、Corbett Y.、Parapini S.、Timmerman M.、Galastri L.、Basilico N.、Sauerwein R.、Alano P.、Taramelli D.基于寄生虫乳酸脱氢酶检测的恶性疟原虫抗配子细胞药物筛选试验。J.抗微生物。Chemother公司。2013;68:2048–2058.[公共医学][谷歌学者] Dandapani S.，Marcaurelle L.A.大挑战评论：为“无法探测”的目标进入新的化学空间。自然化学。生物。2010;6:861–863.[公共医学][谷歌学者] Delves M.J.疟原虫细胞生物学应为开发抗疟疾传播阻断药物的策略提供信息。未来医学化学。2012;4:2251–2263.[公共医学][谷歌学者] Delves M.、Plouffe D.、Scheurer C.、Meister S.、Wittlin S.、Winzeler E.A.、Sinden R.E.、Leroy D.当前抗疟药物在疟原虫生命周期阶段的活性：与人类和啮齿动物寄生虫的比较研究。公共科学图书馆-医学。2012;9：e1001169。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Delves M.J.、Ramakrishnan C.、Blagborough A.M.、Leroy D.、Wells T.N.、Sinden R.E.鉴定疟疾传播阻断药物和疫苗的高通量分析。国际寄生虫学杂志。2012;42:999–1006.[公共医学][谷歌学者] Duffy S.，Avery V.M.开发和优化一种新型384孔抗疟成像分析，用于高通量筛选。美国J.特罗普。医学Hyg。2012;86:84–92. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Duffy S.，Avery V.M.恶性疟原虫配子细胞发育抑制剂的鉴定。马拉尔。J。2013;12:408. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Eziefula A.C.、Bousema T.、Yeung S.、Kamya M.、Owaraganise A.、Gabagaya G.、Bradley J.、Grignard L.、Lanke K.H.、Wanzira H.乌干达无并发症疟疾儿童体内清除恶性疟原虫配子细胞的单剂量伯喹：一项随机、对照、双盲、剂量范围试验。柳叶刀感染。数字化信息系统。2014;14:130–139.[公共医学][谷歌学者] Fivelman Q.L.、McRobert L.、Sharp S.、Taylor C.J.、Saeed M.、Swales C.A.、Sutherland C.J.和Baker D.A.改进了体外恶性疟原虫配子细胞的同步生成。分子生物化学。寄生虫醇。2007;154:119–123.[公共医学][谷歌学者] Fleck S.L.、Pudney M.、Sinden R.E.阿托伐醌（566C80）对体外恶性疟原虫配子细胞成熟和存活的影响。事务处理。R.Soc.Trop公司。医学卫生。1996;90:309–312.[公共医学][谷歌学者] Gbotosho G.O.、Sowunmi A.、Happi C.T.、Okuboyejo T.M.尼日利亚儿童恶性疟原虫配子体携带率、性别比和无性寄生虫率在采用基于青蒿素的联合疗法的治疗方案政策变更前后。内存。奥斯瓦尔多·克鲁兹学院。2011;106:685–690.[公共医学][谷歌学者] Gregory J.A.、Li F.、Tomosada L.M.、Cox C.J.、Topol A.B.、Vinetz J.M.、Mayfield S.Algae生产的Pfs25引发抑制疟疾传播的抗体。《公共科学图书馆·综合》。2012;7：e37179。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Hanssen E.、Knoechel C.、Dearnley M.、Dixon M.W.、Le Gros M.、Larabell C.、Tilley L.对感染恶性疟原虫无性期和有性期的红细胞的细胞体积和血红蛋白含量进行软X射线显微镜分析。J.结构。生物。2012;177:224–232. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Harms J.M.、Wilson D.N.、Schlunezen F.、Connell S.R.、Stachelhaus T.、Zaborowska Z.、Spahn C.M.、Fucini P.。通过L11的翻译调控：硫代链球菌素和微球菌素打开和关闭核糖体上的分子开关。分子细胞。2008;30:26–38.[公共医学][谷歌学者] Hayward R.E.恶性疟原虫磷酸烯醇丙酮酸羧激酶在配子细胞中受发育调控。分子生物化学。寄生虫醇。2000;107:227–240.[公共医学][谷歌学者] Jiménez-Díaz M.B.、Ebert D.、Salinas Y.、Pradhan A.、Lehane A.M.、Myrand-Lapierre M.E.、O'Loughlin K.G.、Shackleford D.M.、Justino de Almeida M.、Carrillo A.K.（+）-SJ733是疟疾的临床候选者，通过ATP4发挥作用，诱导快速清除宿主介导的疟原虫。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2014;111：E5455–E5462。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Klayman D.L.、Bartosevich J.F.、Griffin T.S.、Mason C.J.、Scovill J.P.2-乙酰吡啶缩氨基硫脲。1.一类新的潜在抗疟药物。医学杂志。化学。1979;22:855–862.[公共医学][谷歌学者] Klonis N.、Crespo-Ortiz M.P.、Bottova I.、Abu-Bakar N.、Kenny S.、Rosenthal P.J.、Tilley L.青蒿素对抗恶性疟原虫的活性需要吸收和消化血红蛋白。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2011;108:11405–11410. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Kuhen K.L.、Chatterjee A.K.、Rottmann M.、Gagaring K.、Borboa R.、Buenviaje J.、Chen Z.、Francek C.、Wu T.、Nagle A.KAF156是一种抗疟临床候选药物，有可能用于预防、治疗和预防疾病传播。抗微生物。代理Chemother。2014;58:5060–5067. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Lang-Unnasch N.，Murphy A.D.疟疾寄生虫从人类向蚊子宿主过渡期间的代谢变化。每年。微生物评论。1998;52:561–590.[公共医学][谷歌学者] Lelièvre J.、Almela M.J.、Lozano S.、Miguel C.、Franco V.、Leroy D.、Herreros E.在ATP生物发光“传递阻断”分析中临床相关抗疟药物对恶性疟原虫成熟配子细胞的活性。《公共科学图书馆·综合》。2012;7：e35019。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Lucantoni L.，Duffy S.，Adjalle S.H.，Fidock D.A.，Avery V.M.使用基于荧光素酶的高通量分析鉴定恶性疟原虫早期配子细胞的MMV疟疾盒抑制剂。抗微生物。代理Chemother。2013;57:6050–6062. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Luzzatto L.红细胞遗传学与疟疾易感性。鲜血。1979;54:961–976.[公共医学][谷歌学者] Mair G.R.、Braks J.A.、Garver L.S.、Wiegant J.C.、Hall N.、Dirks R.W.、Khan S.M.、Dimopoulos G.、Janse C.J.、Waters A.P.通过转化抑制调节疟原虫的性发育。科学。2006;313:667–669. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] McNamara C.W.、Lee M.C.、Lim C.S.、Lim S.H.、Roland J.、Nagle A.、Simon O.、Yeung B.K.、Chatterjee A.K.、McCormack S.L.针对疟原虫PI（4）K消除疟疾。自然。2013;504:248–253. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Meister S.、Plouffe D.M.、Kuhen K.L.、Bonamy G.M.、Wu T.、Barnes S.W.、Bopp S.E.、Borboa R.、Bright A.T.、Che J.疟原虫肝脏分期成像以推动下一代抗疟药物的发现。科学。2011;334:1372–1377. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Miguel-Blanco C.、Lelièvre J.、Delves M.J.、Bardera A.I.、Presa J.L.、López-Barragán M.J.，Ruecker A.、Marques S.、Sinden R.E.、Herreros E.基于图像的高通量筛选分析，以识别具有阻断恶性疟原虫雌配子形成的新分子。抗微生物。代理Chemother。2015;59:3298–3305. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Peatey C.L.、Spicer T.P.、Hodder P.S.、Trenholme K.R.、Gardiner D.L.用于鉴定抗晚期恶性疟原虫配子细胞药物的高通量分析。摩尔生物化学。寄生虫醇。2011;180:127–131.[公共医学][谷歌学者] Pendergrass W.，Wolf N.，Poot M.MitoTracker Green和CMXrosamine测量活细胞和组织线粒体膜电位变化的功效。细胞计量学A。2004;61:162–169.[公共医学][谷歌学者] Plouffe D.、Brinker A.、McNamara C.、Henson K.、Kato N.、Kuhen K.、Nagle A.、AdriáN F.、Matzen J.T.、Anderson P.在电子活性分析中揭示了高通量筛选中发现的抗疟药的作用机制。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2008;105:9059–9064. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Poot M.，Zhang Y.Z.，Krämer J.A.，Wells K.S.，Jones L.J.，Hanzel D.K.，Lugade A.G.，Singer V.L.，Haugland R.P.用新型固定荧光染色剂分析线粒体形态和功能。《组织化学杂志》。细胞化学。1996;44:1363–1372.[公共医学][谷歌学者] Reader J.、Botha M.、Theron A.、Lauterbach S.B.、Rossouw C.、Engelbrecht D.、Wepener M.、Smit A.、Leroy D.、Mancama D.无处藏身：在阻断传播的药物研发管道中询问恶性疟原虫配子体的不同代谢参数，以消除疟疾。马拉尔。J。2015;14:213. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Robert V.、Sokhna C.S.、Rogier C.、Ariey F.、Trape J.F.塞内加尔Dielmo居民恶性疟原虫配子细胞的性别比。寄生虫学。2003;127:1–8.[公共医学][谷歌学者] Rogers N.J.、Hall B.S.、Obiero J.、Targett G.A.、Sutherland C.J.恶性疟原虫传播阶段的隔离模型：受配子体感染的红细胞与人类骨髓细胞的粘附。感染。免疫。2000;68:3455–3462. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Rottmann M.、McNamara C.、Yeung B.K.、Lee M.C.、Zou B.、Russell B.、Seitz P.、Plouffe D.M.、Dharia N.V.、Tan J.Spiroindolones，一种治疗疟疾的强效化合物。科学。2010;329:1175–1180. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Ruecker A.、Mathias D.K.、Straschil U.、Churcher T.S.、Dinglasan R.R.、Leroy D.、Sinden R.E.、Delves M.J.一种雄性和雌性配子细胞功能活性分析，用于识别与生物学相关的疟疾传播阻断药物。抗微生物。代理Chemother。2014;58:7292–7302. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Schreiber S.L.药物发现中的靶向和多样性有机合成。科学。2000;287:1964–1969.[公共医学][谷歌学者] Schuffenhauer A.、Ertl P.、Roggo S.、Wetzel S.、Koch M.A.、Waldmann H.脚手架树——通过分层脚手架分类可视化脚手架世界。化学杂志。信息模型。2007;47:47–58.[公共医学][谷歌学者] Sinden R.E.恶性疟原虫体外配子细胞发生：氯喹致死作用的超微结构观察。安·特罗普。医学寄生虫学。1982;76:15–23.[公共医学][谷歌学者] Sinden R.E.疟疾寄生虫的性发育。高级寄生虫醇。1983;22:153–216.[公共医学][谷歌学者] Sinden R.E.疟疾、性发育和传播：回顾与展望。寄生虫学。2009;136:1427–1434.[公共医学][谷歌学者] Spangenberg T.、Burrows J.N.、Kowalczyk P.、McDonald S.、Wells T.N.、Willis P.开放获取疟疾盒：被忽视疾病的药物发现催化剂。《公共科学图书馆·综合》。2013;8：e62906。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Stead A.M.、Bray P.G.、Edwards I.G.、DeKoning H.P.、Elford B.C.、Stocks P.A.、Ward S.A.Diamidine化合物：恶性疟原虫的选择性摄取和靶向。摩尔药理学。2001;59:1298–1306.[公共医学][谷歌学者] Sun W.、Tanaka T.Q.、Magle C.T.、Huang W.、Southall N.、Hung R.、Dehdashti S.J.、McKew J.C.、Williamson K.C.、Zheng W.杀配子药物开发的化学特征和新药靶点。科学。代表。2014;4:3743. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Tanaka T.Q.、Dehdashti S.J.、Nguyen D.T.、McKew J.C.、Zheng W.、Williamson K.C.鉴定杀配子化合物的高通量定量分析。分子生物化学。寄生虫醇。2013;188:20–25. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] Tanaka T.Q.、Guiguemde W.A.、Barnett D.S.、Maron M.I.、Min J.、Connelly M.C.、Suryadevara P.K.、Guy R.K.、Williamson K.C.二氨基萘醌的高效恶性疟原虫配子杀杀活性，在抗疟复合物筛查中确定的主要抗疟化学类型。抗微生物。代理Chemother。2015;59:1389–1397. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 世界卫生组织。疟疾治疗指南。第三版。世界卫生组织；2015年，《疟疾治疗指南》。[谷歌学者] 
