图3

A） 通过S6K1磷酸化测定不同亮氨酸浓度对mTORC1活性的影响。HEK-293T细胞被剥夺亮氨酸50分钟，并用指示浓度的亮氨酸重新刺激10分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解物中的指示蛋白质和磷酸化状态。

B） 不同亮氨酸浓度对Sestrin2-GATOR2相互作用的影响。如（A）所示，稳定表达所示蛋白的HEK-293T细胞被饥饿，并收集FLAG免疫沉淀物。用指示浓度的亮氨酸处理免疫纯化复合物，然后按图1C.

C） Sestrin2 S190W突变体的GATOR2结合能力降低。从瞬时表达指示蛋白的HEK-293T细胞制备FLAG免疫沉淀，并通过免疫印迹分析指示蛋白。

D） Sestrin2 S190W结合亮氨酸能力的测定。进行分析并分析免疫沉淀物，如图2A.

E） 在表达Sestrin2 S190W的Sestrin1-3三重零细胞中，mTORC1通路无法检测到亮氨酸的缺失。使用CRISPR/Cas9系统生成的野生型HEK-293T细胞和Sestrin1-3三重零HEK-293 T细胞表达所示的FLAG标记蛋白。将细胞饥饿亮氨酸50分钟，并在指示的情况下用亮氨酸刺激10分钟，并通过免疫印迹分析裂解物。