Sestrin2将亮氨酸与K（K）d日20µMA） 放射性标记的亮氨酸与Sestrin2结合，但不与WDR24、GATOR2或控制蛋白Rap2A结合。从瞬时表达指示蛋白或复合物的HEK-293T细胞制备的FLAG免疫沉淀物用于与[三H] 方法中描述的亮氨酸。在指定位置添加未标记的亮氨酸。值为一个代表性实验的3个技术重复的平均值±SD。SDS-PAGE和Coomasie蓝色染色用于分析与结合分析中包含的免疫沉淀平行制备的免疫沉淀。星号表示WDR24和GATOR2纯化中的分解产物。
B） Sestrin1（两种亚型）、Sestrin2和Sestrin3的亮氨酸结合能力。制备FLAG免疫沉淀物，并如（A）中那样进行结合测定和分析。
C） 亮氨酸与细菌产生的Sestrin2结合，但不与RagA/RagC异二聚体结合。按照方法中所述进行亮氨酸结合分析，并使用与Ni-NTA树脂结合的His-MBP-Sestrin2或His-RagA/RagC进行分析（A）。
D） 在热位移分析中亮氨酸和精氨酸对细菌产生的Sestrin2熔化温度的影响。His-MBP-雌激素与含有或不含亮氨酸或精氨酸的Sypro橙色染料孵育。加热样品后，捕获荧光变化，并用于计算所示条件下的熔化温度（Tm）。数值为3个重复的平均值±标准偏差。
E） Sestrin2将亮氨酸与K（K）d日20µM。按照（A）制备的FLAG-Sestrin2免疫沉淀物用于与10µM或20µM的结合分析[三H] 亮氨酸和未标记亮氨酸的指示浓度。在所示的代表性图表中，每个点代表10µM测定中n=3的归一化平均值±SD[三H] 亮氨酸。这个K（K）d日根据六个实验的结果计算得出（三个10µM，三个20µM[三H] 亮氨酸）。
F） 蛋氨酸可以竞争亮氨酸与Sestrin2的结合。如（A）所述制备的FLAG-Sestrin2免疫沉淀物用于与10µM[三H] 亮氨酸和未标记蛋氨酸的指示浓度。在所示图表中，每个点代表n=3的标准化平均值±SD。这个K（K）我使用三个实验的数据进行计算。
G） 异亮氨酸可以竞争亮氨酸与Sestrin2的结合。如（A）所述制备的FLAG-Sestrin2免疫沉淀物用于与10µM[三H] 亮氨酸和未标记异亮氨酸的指示浓度。在所示图表中，每个点代表n=3的标准化平均值±SD。这个K（K）我使用三个实验的数据进行计算。
