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国家协议。作者手稿；PMC 2015年10月30日提供。
以最终编辑形式发布为：
国家协议。2007; 2(4): 933–938.
数字对象标识：10.1038/nprot.2007.106
预防性维修识别码：PMC4627699
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院732326
PMID：17446892

组蛋白的化学衍生化便于质谱分析

本杰明·加西亚,1,三 萨哈娜·莫拉,1,三 Beatrix M Ueberheide公司,1,三 斯科特·巴斯比,1,三 塔拉·L·穆拉托雷,1 杰弗里·沙巴诺维茨,1和唐纳德·亨特1,2
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

组蛋白翻译后修饰因其在调节基因表达中的作用而受到广泛研究。在这里，我们描述了使用化学衍生和串联质谱定性和半定量方式表征组蛋白修饰的方案。在这些程序中，首先使用丙酸酐将提取的组蛋白衍生化，以中和电荷并阻断赖氨酸残基，然后使用胰蛋白酶消化，在这些条件下，胰蛋白酶仅裂解精氨酸残余物。使用在线LC-电喷雾电离-质谱法可以很容易地分析生成的肽，以确定修饰位点。此外，可以包括稳定的同位素标记步骤，以修饰羧酸基团，从而相对量化组蛋白修饰。这种方法的优点是从高度修饰的蛋白质中产生少量预测肽。该方案大约需要15-19小时才能完成，包括所有化学反应、酶消化和质谱实验。

简介

组蛋白是高度碱性的小蛋白质，它将真核生物DNA组织成核小体，核小体是染色质的组成部分。除了促进染色质纤维的形成外，大量工作证实组蛋白与基因调控密切相关1,2染色质介导的基因调控是通过组蛋白的翻译后修饰（PTM）实现的。这些PTM主要集中在延伸到核小体表面以外的N末端尾部。流行的组蛋白PTM包括丝氨酸和苏氨酸磷酸化、精氨酸甲基化（单甲基化和二甲基化）以及赖氨酸乙酰化和甲基化（单甲基化、二甲基化和三甲基化）。有趣的是，某些修饰和修饰位点与基因激活或沉默有关。组蛋白H3的赖氨酸9甲基化位于异染色质区域，导致基因阻遏，而相同组蛋白赖氨酸4的甲基化在活性转录基因上发现2由于组蛋白的过度修饰及其与调节基因表达的观察到的联系，组蛋白密码假说等理论三已经进化来解释这些修饰如何影响细胞事件。

传统上，组蛋白修饰被发现并使用诸如位点特异性抗体或32P-标记，然后通过Edman降解进行蛋白质测序。然而，这些技术很耗时，并且有一定的局限性，无法完全表征组蛋白上存在的无数修饰。质谱（MS）对组蛋白PTM的生物学研究进行了补充，对以前未通过任何其他方法检测到的组蛋白的新修饰进行了分类4–8组蛋白对质谱学家来说是一个巨大的挑战，因为它们的序列被大量的精氨酸和赖氨酸残基修饰，尤其是在已知大多数PTM存在的N末端。这会导致问题，因为最常用的酶通常会在碱性或酸性残留物上裂解。用胰蛋白酶进行酶消化会产生难以保留在反相高效液相色谱柱上并由质谱仪分析的小肽。另一方面，用在酸性残基（如Glu-C）后裂解的酶进行蛋白质水解会产生更大的多电荷肽，其质谱/质谱很难解释。MS相关的组蛋白工作受益于使用有限的胰蛋白酶或其他酶消化4–6; 然而，这些方法通常会生成几个含有相同修饰位点的截短肽，使得组蛋白PTM的量化变得繁琐。最近，对组蛋白进行了Arg-C消化，以产生可用于相对定量目的的组蛋白肽8尽管如此，我们决定开发一种方法，可以使用强健的胰蛋白酶生产均匀的肽。

这种方法包括组蛋白的化学衍生化，然后进行胰蛋白酶消化，得到高度可重复的蛋白水解片段，这些片段可以很容易地在质谱仪中进行监测，还可以比较分析两种不同细胞条件下的组蛋白修饰9我们的方法学涉及在使用胰蛋白酶裂解之前，用丙酸酐衍生未修饰或内生单甲基化赖氨酸的N末端的自由胺基和ε-氨基，以形成丙酰酰胺。也描述了使用有机酸的类似方法，甚至用于蛋白质的凝胶内消化10–12.丙酸酐衍生化有两个实际目的：

  1. 由于所有赖氨酸残基都会被添加的化学基团或内源性修饰物阻断，胰蛋白酶消化只能导致模拟Arg-C消化的C-末端到精氨酸残余物的蛋白质水解，如图1组蛋白H3，但具有胰蛋白酶的效率和重复性。
    保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms732326f1.jpg

    丙酰化组蛋白H3.2的胰蛋白酶消化产生的肽。由于所有赖氨酸残基都通过内源性修饰或化学转化为丙酰酰胺而被阻断，因此只有C端的精氨酸残基才发生裂解（其他组蛋白也可以获得类似的结果）。

  2. 衍生化步骤中和N末端的电荷以及未修饰和单甲基化的赖氨酸残基。这使得生成的组蛋白肽的亲水性降低。现在可以通过标准RP-HPLC轻松解决这些问题；此外，肽在电喷雾电离质谱中产生双电荷和三电荷离子，伪密码样片段也一样，其质谱/质谱光谱易于解释(图2). 这比使用精氨酸-C蛋白酶有优势，精氨酸C蛋白酶可以在精氨酸残基上裂解，但不能去除赖氨酸残余物中的电荷。
    保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms732326f2.jpg

    [M+2H]的MS/MS谱2+在LTQ-FT质谱仪上采集丙酰化组蛋白H3.2消化液中的前体离子。经测定，该肽的残基跨度为18-26，并发现在K23上含有乙酰化（ac）修饰。注意未修饰的K18残基和N末端上的丙酰酰胺基团（pr）。b和y型离子被标记。插图：前体母体离子的质谱将该肽区分为乙酰化肽（+1.23 p.p.m.）和非三甲基化肽（-30.66 p.p.m），因为肽的实验质量与乙酰化标记一致。

由于我们现在可以从一个样本到下一个样本重复生成一组肽，而不考虑组蛋白修饰状态，因此我们可以使用羧酸的稳定同位素标记来实现第二个衍生步骤，以相对量化和比较来自两个不同来源或细胞条件的组蛋白修饰。所述方案已用于成功鉴定和定量各种生物体细胞和各种外部刺激下的组蛋白PTM13–17但可以明确地扩展到从任何细胞来源提取的组蛋白。

来自两种细胞来源的组蛋白H3 PTM的比较分析（即相对定量）的典型实验设计如下。组蛋白是从两种不同的细胞样品中酸提取的，并通过HPLC分离纯化成含有不同家族成员的级分。将每个含有组蛋白H3的样品中的组分蒸干，然后在小体积水中重组后，用丙酸酐处理以阻止赖氨酸残留。然后对两个样品进行胰蛋白酶消化，并进行另一个丙酸酐反应以修饰新生成的N末端。然后在质谱仪中分别分析两个样品的一小部分，以确定每个来源中有多少样品（基于几个肽的总离子电流）。然后用甲醇HCl处理剩余的样品，将稳定的同位素标记加入羧酸基团。一个样品用“轻”甲醇HCl处理，而另一个样品则用“重”甲醇HCl处理。混合大致等量的样品（通过之前对每个样品的MS分析判断等量），并由MS分析，以对每个细胞状态的组蛋白PTM进行相对比较。通常，这些实验可以提供两种不同生物条件下组蛋白PTM表达不足或过度的信息。未修饰的组蛋白肽可以作为对照，以确定是否加载了等量的每个样品，因为它们的相对丰度应该大致相等。建议执行三次复制运行。

材料

试剂

  • 去离子水
  • 氢氧化铵
  • 丙酐（Sigma-Aldrich）
  • D类0-甲醇99%（Alltech）▲ 关键不使用时，D0-甲醇应贮存在氩气或氮气中，以减少瓶中的水分。
  • D类4-甲醇>99%（Sigma-Aldrich）▲ 关键不使用时，D4-甲醇应贮存在氩气或氮气中，以减少瓶中的水分。
  • 序列级改良胰蛋白酶（Promega）
  • 碳酸氢铵（100 mM，pH值8）
  • 冰醋酸
  • 乙酰氯（Sigma-Aldrich）▲ 关键不使用时，乙酰氯应储存在氩气或氮气下，以减少瓶子中的水分。
  • MS样品缓冲液：0.1%乙酸
  • HPLC级水（Millipore）
  • HPLC级乙腈（Mallinckrodt）
  • HPLC缓冲液A=0.1%乙酸
  • HPLC缓冲液B=70%乙腈溶于0.1%乙酸

设备

  • 漩涡混合器
  • 微型离心分离机
  • pH指示条
  • 加热块或水浴（51和37°C）
  • SpeedVac集中器
  • 小玻璃瓶
  • 迷你磁力搅拌器（<2 mm，可装在玻璃瓶中）
  • 用于纳米流动HPLC的微毛细管柱：C18树脂（5–20μm，YMC ODS-AQ，Waters），360μm o.d.×75μm i.d.聚酰亚胺涂层（Polymicro Technologies）
  • 配置用于溶剂纳米流量输送的HPLC仪器
  • 高分辨率质谱仪（如Thermo Finnigan LTQ-FT或LTQ Orbitrap质谱仪）▲ 关键需要高分辨率、高质量精度的质谱仪来区分乙酰化和三甲基化（Δ米=0.036 Da）。

试剂设置

样品要求

当应用于从酸提取制剂中获得的HPLC分馏组蛋白样品时，这些程序是最好的，该酸提取制剂将主要包含组蛋白。通常，我们的程序可应用于低至1μg的蛋白质，在对两种不同细胞状态的组蛋白PTM进行比较分析时，应进行三次重复。如果需要定量信息（正常C18筛选和稳定同位素标记后的定量分析），每个样品必须至少进行两次运行；所以一定要为两次MS实验保存足够的样本。

设备设置

RP-HPLC仪器和质谱仪

使用流动缓冲液A和洗脱缓冲液B的以下反相HPLC梯度。

时间间隔（min）梯度
0–600–60%B
60–7060–100%B
70–75100%B
75–80100–0%B

使用100 nl min的纳米流速可获得最佳灵敏度−1或更低。如前所述，高分辨率、高质量精度质谱仪应使用与数据相关的MS/MS模式设置在正模式下运行（见参考文献）。13–17).

需要高质量精度的仪器来区分乙酰化肽和三甲基化肽（Δ米=0.036 Da）。

强烈建议使用能够进行MS/MS实验的质谱仪来定位修饰位点，因为使用肽质量指纹图谱（仅获取肽质量）可能会与所有14 Da（甲基）倍数的多重修饰肽和化学衍生物混淆。

程序

组蛋白与丙酸酐的化学衍生

  • 1|
    在去离子水中重组已完全干燥的RP-HPLC纯化组蛋白样品（我们通常尝试将浓度保持在0.5–1μgμl左右−1).
  • 2|
    校准1至5μg组蛋白样品，并用5μl 100 mM碳酸氢铵缓冲液（pH 8）稀释。
  • 3|
    向样品中添加1-2μl浓氢氧化铵。

    ! 注意安全氢氧化铵应在通风柜中处理和分配。

    ▲ 关键步骤步骤3–7必须以流线型方式执行，不得中断或中断，以实现最大反应效率。

  • 4|
    在25μl D中加入75μl丙酸酐制备丙酰化试剂0-99%甲醇，与涡流器混合，在小型离心分离机中旋转几秒钟。

    ▲ 关键步骤每次反应均应新鲜制备丙酰化试剂。

    ! 注意安全不使用时，丙酸酐和D0-99%的甲醇应贮存在氩气或氮气中，并用副膜密封，以减少瓶中的水分。

  • 5|
    立即向组蛋白样品中添加20μl丙酰化反应，旋涡，在微型离心分离机中旋转几秒钟，并用pH指示条检查pH值（将<0.5μl添加到条中）。如果pH值<8，则逐滴添加氢氧化铵，直到pH值约为8。通常，添加5μl氢氧化铵是滴定的良好起点。

    ! 注意安全氢氧化铵应在通风橱中处理和分配。

    ▲ 关键步骤pH值下降是由于丙酸酐水解释放丙酸所致。丙酸酐在标记氨基的同时，也被水分子水解。反应的最佳pH值为8。应尽快执行步骤5，以避免降低标签效率。滴定氢氧化铵时应小心。如果pH值>10，则标记具有较高pK的其他残留物一是可能的。

    ?故障排除

  • 6|
    在51°C下培养反应20分钟。
  • 7|
    在室温（25°C）下，在SpeedVac浓缩器中将样品干燥至约5μl，持续约20分钟。
  • 8|
    用5μl 100 mM碳酸氢铵缓冲液（pH 8）稀释样品。
  • 9|
    重复步骤3–7。

    ▲ 关键步骤通常，进行两次丙酰化反应可确保氨基到丙酰酰胺的最大转化率（>95%）。

    ■ 暂停点丙酸化组蛋白样品可以在−80°C下保存数周。

丙酰化组蛋白的酶消化和新生成N-末端的丙酰化

  • 10|
    用50μl 100 mM碳酸氢铵缓冲溶液稀释样品。
  • 11|
    向样品中添加胰蛋白酶，使蛋白质与胰蛋白酶的比例为20:1（wt/wt）。在37°C下培养6–10小时。
  • 12|
    通过添加冰醋酸来终止胰蛋白酶消化。我们通常每15μl样品缓冲液体积添加1μl冰醋酸，但要确保pH值降到约3。将淬火后的样品置于−80°C的冷冻柜中，直至冷冻（以灭活胰蛋白酶）。
  • 13|
    在SpeedVac浓缩器中将样品干燥至约5μl。
  • 14|
    重复步骤3–7。我们再次将样品与丙酸酐反应，将肽上新生成的胰蛋白酶N末端转化为丙酰酰胺。
  • 15|
    用5μl 100 mM碳酸氢铵缓冲液（pH 8）稀释样品。
  • 16|
    重复步骤3–7。对于来自两种细胞状态的组蛋白PTM的比较分析，请转至步骤23。对于使用稳定同位素标记的定量分析，请转至步骤17。

    ▲ 关键步骤通常，进行两次丙酰化反应可确保氨基到丙酰酰胺的最大转化率（>95%）。

    ■ 暂停点消化后的组蛋白样品可以在−80°C下保存数周。

两种细胞状态组蛋白定量质谱中羧酸基团的稳定同位素标记

  • 17|
    使用SpeedVac浓缩器将两个不同细胞状态的组蛋白样品干燥。

    ▲ 关键步骤样品必须完全干燥，因为样品中的水会导致副产品和标记效率低下。由于要经过多次干燥才能完全完成，因此必须使用至少1μg组蛋白肽样品执行下述稳定同位素标记程序。

  • 18|
    添加10μl D0-99%甲醇加入样品中，用轻甲醇和10μl D标记4-甲醇>99%，用重甲醇标记样品，使用SpeedVac浓缩器再次涡流并完全干燥。这一步骤有助于在应用稳定同位素标记反应之前去除样品中最后的微量水。
  • 19|
    通过缓慢滴加160μl乙酰氯制备甲酯试剂0-99%甲醇或D4-玻璃瓶中甲醇>99%。向玻璃瓶中加入微磁搅拌棒，缓慢搅拌，同时加入乙酰氯。

    ! 注意安全该反应应在通风橱中进行。由于反应是放热的，当添加乙酰氯时，玻璃瓶将变得温热。然而，需要小心，因为如果乙酰氯添加过快，试剂可能会发生剧烈反应。

  • 20|
    添加100μl甲酯试剂（D0-甲醇99%），并添加100μl氘化甲酯试剂（D4-甲醇>99%）从细胞状态2到组蛋白样品，并在室温下反应1h。

    ? 故障排除

  • 21|
    重复步骤17–20。

    ▲ 关键步骤通常，进行两次甲酯反应可确保羧酸基团最大限度地转化（>95%）为相应的甲酯。

  • 22|
    使用SpeedVac浓缩器将样品干燥。

    ■ 暂停点标签样品可以在−80°C下储存1-2天。

质谱分析

  • 23|
    对于定性分析，使用20μl MS样品缓冲液（0.1%乙酸）稀释样品，并添加1μl冰乙酸。在微型离心分离机中涡旋和旋转1分钟。对于定量分析，用20μl MS样品缓冲液（0.1%乙酸）稀释样品，并添加1μl冰乙酸；然后，将两个样品混合均匀。在微型离心分离机中旋转和降速1分钟。

    ▲ 关键步骤为了获得最佳定量结果，您应该从状态1和状态2添加等量的组蛋白样品。为了确保均匀加载，您可能必须首先单独分析每个样品，以确定每个样品的总离子信号，并进行相应调整（参见参考文献。13–17).

  • 24|
    将样品加载到微毛细管柱上，使用纳米液相色谱在线RP-HPLC分离肽（参见设备设置中的建议梯度），并直接洗脱到以数据相关MS/MS模式运行的电喷雾离子化高分辨率串联质谱仪中。

    ? 故障排除

数据分析

  • 25|
    可以使用SEQUEST或Mascot等搜索算法根据组蛋白序列数据库搜索质谱数据，以识别修饰位点，但手动验证结果至关重要。对于数据库搜索，对赖氨酸残基使用以下差异修饰：未修饰（+56.03 Da）、单甲基化（+70.04 Da），二甲基化（+28.03 Da，三甲基化（+42.05 Da）和乙酰化（+40.01 Da）。所有N端应使用+56.03 Da的静态修改。如果使用甲酯稳定同位素标记，则使用+14.02 Da（D0-甲酯）和+17.03 Da（D三-甲酯）。

    ? 故障排除

  • 26|
    如前所述，通过手动整合来自所有电荷状态的所选离子物种曲线下的面积，确定组蛋白修饰位点的相对定量（参见参考文献。10–12).

● 计时

  • 消化前标记丙酸酐，步骤1-9:2 h
  • 胰蛋白酶消化和重丙酸酐，步骤10–16：8–12 h
  • 稳定同位素标记，步骤17–22：3 h
  • 质谱分析，步骤23–24：每个样品2小时
  • 数据分析，步骤25-26：变量，取决于用户

? 故障排除

步骤24

由于几个具有相似保留时间的肽可以大致同稀释到质谱仪中，偶尔会观察到低水平修饰组蛋白肽的欠采样。您可能需要调整HPLC梯度，使其更加渐进，以更好地分离肽。然而，大多数基于LTQ离子阱的质谱仪（我们推荐）的扫描速度足以获得几乎所有洗脱肽的MS/MS光谱。

步骤25（赖氨酸基团的不完全标记）

在步骤5中，如果pH值下降，并且您无法快速将pH值提高到8，则结果可能是赖氨酸基团标记不完整。不幸的是，在使用LC-MS/MS进行分析之前，无法评估低效丙酰化。如果pH值下降时间延长（>1分钟），则建议重复丙酰化步骤。

步骤25（羧基标记不完整）

在步骤20中，如果样品中有微量水，这可能导致羧基标记不完整。可通过LC-MS/MS分析评估转化为甲酯的效率低下。

预期结果

组蛋白修饰位点的鉴定

图1显示了可以从丙酰化组蛋白H3.2的胰蛋白酶消化物中预期的肽。由于赖氨酸残基被化学或内源性修饰所阻断，所以只有精氨酸残基才发生裂解。应注意，只有N-末端、内源性未修饰和单甲基化的赖氨酸才能与丙酸酐衍生，二甲基化、三甲基化或乙酰化的赖胺酸的空间位阻太大，不允许添加丙酰酰胺基团。这允许用户从组蛋白（所有核心组蛋白）中产生少量易于预测的肽，否则很难，因为存在大量的碱性残基和PTM。这些可预测的肽还产生了MS/MS光谱，由于其伪胰蛋白酶特性，更容易分析。图2显示了赖氨酸23处含有乙酰化修饰的18-26残基片段的MS/MS光谱。由于所有肽片段都可以预测，因此也可以使用与特定PTM相对应的质量添加和相应搜索的数据（计算机搜索或手动搜索）来计算肽质量。

组蛋白修饰位点的相对定量

建议在稳定同位素标记之前，首先使用MS对样品进行定性分析，以估计标记样品均匀混合的肽水平，以便进行比较分析。要确定是否装载了等量的两个标签样品，一个很好的检查是检查来自未经修饰的肽的离子信号，例如来自组蛋白H3的41–49残留肽，如图3a。如果装载等量的每个样品，则应观察到大约1:1的离子比(图3a). 对其他组蛋白H3肽的分析可以揭示某些PTM是否在任何样品上富集，如图3b对于H3.2样品中赖氨酸27上含有三甲基化的27–40残基片段。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms732326f3.jpg

组蛋白PTM的差异表达质谱分析。(一)组蛋白H3样品的甲酯稳定同位素标记示例。总计551–555的全MS频谱米/z（z）组蛋白H3变异体H3.1（标记D0-甲醇，轻）和H3.2（标记为D三-甲醇，重）。551.8212和553.3304处的双峰米/z（z）两者都对应于肽pr-YRPGTVALR，在C末端包含一个稳定同位素标记（pr=丙酰基）。观察到的离子比大约为1:1，表明两个样品的负载量相等，因为该肽未被修饰，并且只存在一种形式。(b条)总计828–833个MS全谱米/z（z）组蛋白H3变体H3.1（标记为D0-甲醇，轻）和H3.2（标记为D三-甲醇、重质）。829.4917和831.0007的双峰米/z（z）两者都对应于肽pr-K甲基丙烯酸甲酯SAPATGGVK公司公共关系K（K）公共关系在C末端加入一个稳定同位素标记的PHR（pr=丙酰基）。与H3.1样品相比，H3.2样品中K27处经三甲基化修饰的肽的丰度是H3.1样品的两倍。

致谢

感谢美国国立卫生研究院（GM 37537）向D.F.H.和福特基金会向B.A.G提供的资金。

脚注

竞争利益声明作者声明，他们没有相互竞争的经济利益。

工具书类

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