随着人们认识到许多疾病的发病机制涉及多种因素，药物研发的重点已经从传统的“一靶点，一药”模式转移到新的“多靶点，多药”模式1,2,三,4在寻找新药的历史中，植物是生物活性化合物的优良来源5,6,7,8,9,10此外，人们很好地声称，草药本身是多组分混合物，并通过多靶点添加剂和/或协同模式发挥作用11,12,13,14,15,16因此可以很好地满足多基因相关复杂疾病的治疗要求。事实上，从临床研究中积累的证据支持HM是控制复杂疾病的一种有效形式，如心血管疾病、癌症和糖尿病17美国食品和药物管理局（FDA）在过去几年中批准了越来越多的草药临床试验，这代表了西方国家对HMs评估的积极态度。此外，HMs在从头开始的多化合物多靶点创新药物的发现与开发18,19然而，在这两种情况下，一个基本要求是揭示能够代表整个HM整体临床益处的组合中的药理活性化合物。以往的生物活性化合物鉴定工作主要集中在从HMs中筛选分离出的单一生物活性化合物，并为新药的发现和开发做出了巨大贡献。然而，这种筛选策略很难发现有助于HMs整体效应的组合化合物，这是提供支持HMs临床益处的可靠证据的主要瓶颈20,21.
最近，我们的实验室提出了一种称为“生物活性等效组合成分（BECC）”的策略，以发现组合中具有药理活性的化合物，这些化合物代表了整个HM的整体效果14BECCs被定义为组合成分的确切组成，占原始草药的全部功效。使用这种策略，我们成功地发现了18种化合物的组合(补充图S1)作为强心丸（CP）的BECC，在中国用于治疗CVD已有数十年的历史，最近被FDA批准进入三期临床试验22,23,24据报道，CP或其所含化合物具有多种药理活性，以支持其对CVD的临床治疗作用，主要包括抗炎、清除自由基、改善微循环、降脂、扩张血管、抗凝血、抗血栓、抗缺血、抗凋亡、，内皮保护和线粒体保护作用25,26,27,28,29然而，以协同和/或加性方式发挥作用的化合物组合对什么样的药理活性起作用仍然是一个关键问题，这是最终揭示HMs的多化合物和多目标整体模式的关键步骤。
系统生物学揭示了CVD背后的一系列复杂的病理过程，如炎症、氧化应激、脂质积聚、凝血、内皮细胞损伤、缺血损伤、细胞凋亡和线粒体功能障碍30,31,32在所有这些病理过程和原因中，炎症是贯穿CVD病理发展整个过程的核心33,34,35,36,37炎症细胞的激活引起炎症细胞因子、趋化因子、氧和氮自由基以及其他炎性分子的释放，最终过度的炎症反应导致心肌损伤，导致结构和功能缺陷。所以，及时抑制炎症反应对受伤组织的有效愈合至关重要。许多实验和临床研究表明，CP可以抑制炎症反应，并显示出心脏保护能力38,39,40,41,42.
作为我们最近研究的延伸，本研究旨在以CP的抗炎活性为典型模型，开发并验证一种识别组合化合物的策略，这些组合化合物共同发挥作用，有助于HMs的某些药理作用。该策略主要包括以下四个步骤()（1）通过面向生物活性等效性的反馈筛选方法鉴定BECC；（2） 根据化学家族分类筛选活性化合物；（3） 确定单个化合物的药理活性及其相互作用模式；（4） 基于活性贡献分析的优势化合物组合的指定，随后进行活性验证。
用于筛选通过HM中的加性模式生效的组合化合物的策略。(一)通过面向生物活性等效的反馈筛选方法识别BECC；(b条)根据化学家族分类筛选活性化合物；(c（c）)确定单个化合物的药理活性及其相互作用模式；(d日)根据活动贡献指数和DCC活动验证指定DCC。BECCs：生物活性等效组合成分；DCC：优势化合物组合。
结果
脂多糖（LPS）刺激巨噬细胞抗炎活性的表征
为了研究CP的抗炎作用，我们用LPS刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7，用不同浓度的CP处理细胞，并测量炎症介质的产生。CP显著抑制LPS诱导的一氧化氮（NO）、前列腺素E的生成2（PGE2)白细胞介素-6（IL-6）呈剂量依赖性(，p<0.01）。通过预先培养CP细胞，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）的蛋白和mRNA表达水平也降低(). 此外，CP浓度依赖性地降低IL-6和白细胞介素-1β（IL-1β）mRNA的表达(). 为了确保细胞死亡与CP治疗组细胞因子表达降低无关，在LPS存在下评估CP的细胞毒性。与对照组相比，用不同浓度的CP（0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/ml）孵育24 h未引起任何显著的存活率变化(补充图S2). 这些数据表明，CP治疗可以抑制炎症介质的表达，减少LPS诱导的炎症反应。由于0.4 mg/ml的CP具有较强的抗炎活性，并且对巨噬细胞几乎没有毒性作用，因此在进一步的研究中应用了该浓度，以鉴定组合化合物，从而解释CP的整体抗炎活性。
强心丸对LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞的抗炎作用。用不同浓度的CP（0.1–0.4 mg/ml）预处理细胞1 h，然后用LPS（1μg/ml）处理并培养指定时间。的浓度(一)否(b条)前列腺素E2和(c（c）)上清液中的IL-6。(d日)iNOS和COX-2的蛋白表达水平。β-actin作为内负荷对照。信使核糖核酸的表达水平(e（电子）)iNOS、(（f）)环氧化酶-2(克)IL-6和(小时)采用实时定量PCR分析IL-1β。GAPDH作为mRNA表达正常化的内部控制。数据表示为重复进行的三个独立实验的平均值±SD##与对照组相比p<0.01*与LPS组相比，p<0.05，**p<0.01（单向方差分析，Dunnett检验）。CP：强心丸。
基于化学族分类的筛选
使用生物活性等效性导向的反馈筛选策略，在我们之前的工作中，18种化合物的组合被确定为CP的BECC14因此，我们决定从先前鉴定的BECC中鉴定负责CP抗炎活性的化合物组合。为此，我们首先利用LPS刺激的RAW264.7细胞模型验证了BECC在抗炎方面是否具有与CP等效的生物活性。BECC预处理显著降低NO、PGE的生成2和IL-6(，p<0.01）。BECC还抑制iNOS和COX-2在mRNA和蛋白水平的表达(). BECC治疗后IL-6和IL-1βmRNA水平也降低(). 与我们之前的结果一致，我们在这项研究中验证了BECC可以解释CP提取物的大部分（如果不是全部的话）抗炎作用。这些结果支持从这组18种化合物中鉴定具有抗炎活性的组合化合物是合理的。
基于化学家族分类的CP抗炎化合物筛选。用受试样品（对应浓度为0.4 mg/ml CP）预处理细胞1 h，然后用LPS（1μg/ml）处理并培养指定时间。的浓度(一)否(b条)前列腺素E2和(c（c）)上清液中的IL-6。(d日)iNOS和COX-2的蛋白表达水平。β-actin作为内负荷对照。mRNA的表达水平(e（电子）)iNOS中(（f）)环氧化酶-2(克)IL-6和(小时)采用实时定量PCR分析IL-1β。GAPDH作为mRNA表达正常化的内部控制。数据表示为重复进行的三个独立实验的平均值±SD##与对照组相比p<0.01*与LPS组相比，p<0.05，**p<0.01（单向方差分析，Dunnett检验）。CP：强心丸；PA：10种酚酸的组合；GN：4种人参皂苷的组合；TN：4种丹参酮的组合；BECC：生物活性等效组合成分（PA、GN和TN的组合）。
众所周知，HMs中所含的化合物通常可分为几个化学家族；此外，一类具有相似药效团的化合物可能具有相似的药理活性，尽管强度不同。基于这一考虑，我们提出了一种基于化学家族分类的筛选方法，以便于识别具有抗炎活性的化合物。根据化学结构，CP中的18种化合物可分为三大类，包括酚酸（PA）、人参皂苷（GN）和丹参酮（TN）(补充图S1). 为了确定哪组成分负责CP的抗炎活性，PA、GN和TN对NO、PGE生成的影响2测定IL-6。我们通过根据0.4 mg/ml CP中每种化合物的相应浓度混合参考化合物来制备PA、GN、TN及其组合（BECC）(补充表S1). PA显著抑制NO、PGE的生成2和IL-6(并降低LPS刺激的RAW264.7细胞中iNOS和COX-2的蛋白水平(). TN对LPS刺激的炎症介质的产生也有一定的抑制作用。iNOS、COX-2、IL-6和IL-1βmRNA的分析显示出类似的趋势(). 结果表明，PA和TN（而非GN）是CP抗炎作用的主要原因。
单一化合物的筛选及交互模式的表征
通过LPS刺激的RAW264.7细胞产生NO和IL-6来筛选具有抗炎活性的单一化合物并评估其相互作用模式。在不同浓度下，测试了单一化合物、10种酚酸（PA）的组合、4种丹参酮（TN）的组合、PA和TN的组合在LPS刺激的RAW 264.7细胞中抑制炎症指标水平的能力(). 测量RAW264.7细胞存活率，以确保细胞死亡不会导致炎症指标的减少(补充图S3). 集成电路50PA和TN中单个化合物的值列于PA和TN单独或联合使用都能以浓度依赖的方式抑制NO和IL-6的积累(). PA和TN在CP中分别以0.15 mg/ml和0.10 mg/ml的相应浓度抑制50%的NO和IL-6生成。使用组合指数（CI）方法评估相互作用的性质（协同、相加或拮抗效应）43,44,45,46,47.CI根据药物浓度和生物活性计算(补充表S2–S4)绘制剂量效应曲线是评价联合效应的前提步骤。如中所示，大多数CI值位于0.9~1.1范围内，表明PA和TN之间存在加性效应。此外，还测定了PA和TN.中化合物之间的相互作用模式。数据表明，PA族化合物与TN族化合物之间的相互作用也主要以加性方式进行().
单一活性化合物或化合物组合对LPS诱导的炎症指标产生的组合指数和剂量依赖性抑制。RAW264.7巨噬细胞在1μg/ml LPS存在下用不同浓度的受试样品预处理24 h(一)否和(b条)IL-6的产生。高浓度TN抑制(c（c）)否和(d日)IL-6产生。10种酚酸类化合物对大鼠脑缺血再灌注抑制作用的剂量效应曲线(e（电子）)否和(（f）)IL-6产生。4种丹参酮抑制(克)否和(小时)IL-6产生。(我)组合索引。根据3个重复的数据，使用CompuSyn软件计算组合指数。0.9<CI<1.1表示存在加性效应。CP：强心丸；PA：10种酚酸的组合；TN：4种丹参酮的组合；PA&TN：PA和TN的组合。
表1
集成电路5010种酚酸和4种丹参酮的活性贡献。
| 不。 | 化合物 | 不
| 白介素-6
|
|---|
| C（微米） | C类50（μM） | ACI公司50(%) | C（μM） | C类50（μM） | ACI公司50(%) |
|---|
| 第1页 | 丹参素 | 22.21 | 123.2 ± 4.2 | 18 | 14.81 | 186.7 ± 9.2 | 7.4 |
| 第2页 | 原儿茶醛 | 9.18 | 27.5 ± 2.0 | 33.4 | 6.12 | 72.1 ± 3.6 | 8.5 |
| 第3页 | 丹酚酸D | 2.94 | >200 | 1.5 | 1.96 | 42.8 ± 2.2 | 4.6 |
| 第4页 | 丹酚酸G | 2.74 | 116.2 ± 9.1 | 2.4 | 1.83 | >200 | 0.9 |
| 第5页 | 异紫草酸A | 2.68 | 51.0 ± 4.0 | 5.3 | 1.79 | 4.8 ± 0.4 | 37.1 |
| 第6页 | 丹酚酸a | 2.43 | 23.7 ± 1.5 | 10.2 | 1.62 | 6.6 ± 0.5 | 24.5 |
| 第7页 | 异紫草酸B | 1.92 | 51.5 ± 3.6 | 3.7 | 1.28 | 20.0 ± 1.6 | 6.4 |
| 第8页 | 迷迭香酸 | 1.44 | 96.1 ± 7.2 | 1.5 | 0.96 | 36.9 ± 0.9 | 2.6 |
| 第9页 | 丹酚酸B | 0.86 | 59.7 ± 3.9 | 1.4 | 0.57 | 8.8 ± 0.6 | 6.5 |
| 第10页 | 紫草酸 | 0.65 | 146.2 ± 10.8 | 0.4 | 0.43 | 26.3 ± 1.2 | 1.6 |
| 时间T1 | 丹参酮I | 0.44 | 9.2 ± 0.4 | 4.8 | 0.29 | 16.0 ± 1.2 | 1.8 |
| T2段 | 二氢山参酮I | 0.39 | 2.8 ± 0.2 | 13.9 | 0.26 | 4.8 ± 0.3 | 5.4 |
| T3航站楼 | 丹参酮IIA | 0.30 | 17.5 ± 1.3 | 1.7 | 0.20 | 26.2 ± 2.1 | 0.8 |
| T4类 | 隐丹参酮 | 0.24 | 8.0 ± 0.3 | 3 | 0.16 | 15.0 ± 0.7 | 1.1 |
贡献系数和优势化合物组合
为了阐明HMs的整体效应，重要的是确定每个化合物的贡献和交互模式。从上述研究中获得的结果表明，CP中所含化合物在抗炎反应中具有加性模式。因此，我们调整以确定每种化合物对CP整体抗炎作用的贡献。在没有协同或拮抗作用的情况下，可以根据质量作用定律原理预测联合作用48,49基于本研究中活性化合物的加性效应，我们能够确定每种化合物对CP整体抗炎作用的贡献系数。中位效应的活性贡献指数（ACI50)用于评估活动贡献。显示ACI50在PA和TN的组合中，每种化合物都有助于抑制50%的NO和IL-6生成。
根据ACI50对于每种化合物，我们选择最主要的贡献者，其中ACI的总和50以NO生成为指标，原儿茶醛、丹参素、二氢丹参酮I、丹酚酸A、异麻黄碱酸A和丹参酮Ⅰ被确定为对CP抗炎活性贡献最大的六种化合物。ACI总和50这六种化合物中，占85.6%。考虑到最大贡献者可能因应用的不同药理指标而异，我们使用IL-6产生量作为另一个指标来验证所测定的六种化合物是否代表CP的抗炎活性50与NO的产生不同，ACI的总和50六种贡献者的IL-6抑制值为84.7%。这些结果表明，这六种成分的组合可以代表整个抗炎活性，因此它们被指定为CP的主要抗炎化合物组合（DCAC）。
DCAC的抗炎作用验证
为了进一步评估DCAC（一组六种选定的化合物）是否能够代表CP的全部抗炎活性，与BECC和CP提取物相比，在LPS刺激的RAW264.7细胞中验证了DCAC的抗炎作用。DCAC处理显著降低NO、PGE的生成2和IL-6(，p<0.01）。Western blot分析表明，DCAC预处理也抑制了RAW264.7细胞iNOS和COX-2的蛋白表达(). 同样，DCAC治疗显著降低iNOS、COX-2、IL-6和IL-1β的mRNA水平(). 值得注意的是，在所有测定的参数方面，DCAC的抗炎作用与BECC相当。这些结果支持指定的DCAC主要负责CP的抗炎作用。
验证DCAC在LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中的抗炎作用。用受试样品（对应浓度为0.4 mg/ml CP）预处理细胞1 h，然后用LPS（1μg/ml）处理并培养指定时间。的浓度(一)否(b条)前列腺素E2和(c（c）)上清液中的IL-6。(d日)iNOS和COX-2的蛋白表达水平。β-actin作为内负荷对照。mRNA的表达水平(e（电子）)iNOS、(（f）)环氧化酶-2(克)IL-6和(小时)采用实时定量PCR分析IL-1β。GAPDH作为mRNA表达正常化的内部控制。数据表示为重复进行的三个独立实验的平均值±SD##与对照组相比p＜0.01*与LPS组相比，p<0.05，**p<0.01（单向方差分析，Dunnett检验）。CP：强心丸；BECCs：生物活性等效组合成分；DCAC：抗炎化合物的主要组合。
为了进一步验证基于ACI的顶级化合物选择是合适的，我们从六种化合物中逐个去除了化合物，并测试了其余五种化合物的抗炎活性(). 当原儿茶醛是抑制NO产生的主要活性贡献者时（ACI5033.4%），则其余组合的抑制活性显著降低(，与DCAC相比p<0.01）。相反，当丹参酮I（ACI504.8%），其余部分的活性没有受到显著影响。对IL-6产生的分析表明了类似的趋势(). 当异精酸A（ACI5037.1%），其余组合抑制IL-6生成的抑制活性显著降低(，与DCAC相比p<0.01）。这些结果强烈表明，基于ACI的选择是从HM中鉴定组合化合物的一种合适策略。
去除化合物对DCAC抗炎活性的影响。用测试样品（对应浓度为0.4 mg/ml CP）预处理细胞1 h，然后用LPS（1μg/ml）处理并培养24 h(一)否和(b条)DCAC处理的巨噬细胞上清液中IL-6的浓度，每种化合物分别去除。数据表示为三个独立实验的平均值±SD**与LPS组相比p<0.01#与DCAC组相比，p<0.05，##p<0.01（单向方差分析，Dunnett检验）。CP：强心丸；DCAC：抗炎化合物的主要组合；P1：丹参素，P2：原儿茶醛；P5：异精酸A；P6：丹酚酸A；T1：丹参酮I；T2：二氢丹参酮I。
讨论
近年来，人们越来越认识到HMs本身是多组分混合物，具有“固定剂量”，通过添加和/或协同模式发挥作用，从而体现出整体临床效益12,15,16这种添加剂和/或协同模式可以解释为什么原始HM通常比分离的单一成分具有更高的活性。因此，从HMs中鉴定以添加剂和/或协同方式发挥作用的生物活性化合物组合，不仅对HMs的临床效益提供科学证据，而且对质量控制和新药开发具有重要意义21,50然而，缺乏适当的战略和方法是解决这项具有挑战性的重要任务的主要障碍。根据我们最近对一组18种化合物的鉴定，这些化合物解释了CP的大部分整体效应，这项研究有助于制定组合筛选策略，并鉴定出六种与CP抗炎作用有关的化合物。这六种化合物的联合抗炎活性与CP的整个提取物相当。此外，我们进一步表明，这六种成分通过加性方式发挥作用，但几乎没有协同作用。
从理论上讲，HMs可以通过靶向不同靶点的多种化合物引发整体效应，从而适应对抗复杂和多基因疾病的多种病理因素的需要12,15,16,19此外，还需要注意的是，HMs中所含单一化合物的含量通常太低，无法对某些病理过程或因素发挥足够的药理活性。因此，很可能是几种化合物通过协同和/或加性方式联合作用，通过靶向相同或不同的靶点，对抗相同的病理过程。基于这一考虑，本研究侧重于评估CP在抗炎活性方面的整体模式，这被认为是解释CP对心血管疾病临床益处的主要机制。首先，我们验证了之前鉴定的BECC，一组由18种化合物组成的混合物，在抗炎作用方面与CP提取物相当。其次，我们提出了一种基于化学家族分类的筛选策略，以快速确定哪些化合物家族负责CP的抗炎作用。为此，我们制备了PA、TN和GN三个化合物家族的组合，通过将每种化合物的标准品以其在CP提取物中的原始浓度混合。研究发现，PA和TN（而非GN）具有较强的抗炎活性。此后，GN家族的化合物被排除在进一步筛选之外。这一结果支持了基于化学族分类的筛选方法对于缩小筛选范围是非常可行和有效的。第三，对PA和TN家族中化合物的抗炎活性进行单独筛选，并将IC50测定了每种化合物的值。此外，我们还扩展到确定两类化合物之间以及同一类化合物之间的相互作用模式。有趣的是，结果表明，这些化合物的组合以加性方式起作用。在此基础上，我们利用质量作用定律原理预测了各化合物对CP整体抗炎活性的贡献指数，异紫草酸A和丹参酮I被指定为CP的主要抗炎组合化合物。尽管这些化合物的抗炎活性先前已有报道44,45,46,47,48，本研究首次有助于阐明每种化合物对CP整体抗炎活性的确切贡献。此外，我们发现其他一些已知具有抗炎活性的化合物对CP的整体效应贡献甚微，因为它们在CP中的水平很低。例如，隐丹参酮具有以IC为特征的强烈抗炎活性50值为8.0μM，但未纳入DCAC，因为其在CP提取物中含量较低。与筛选HMs中的单个生物活性化合物不同，当前的研究侧重于阐明哪些化合物在组合中起作用并有助于整体效应，从而为解释HMs的临床益处提供证据。
除了抗炎活性外，CP还具有许多其他药理作用，如抗氧化和代谢调节，所有这些都可能有助于观察到CP的临床益处。因此，目前的研究在阐明CP对心血管疾病的多化合物和多靶点模式方面还远没有定论。我们的实验室正在寻找有助于CP其他药理作用的组合化合物。总之，本研究和我们最近的工作为鉴定HMs具有一定药理活性的组合化合物提供了一种广泛适用的策略。从该策略中获得的主要化合物组合不仅为理解整体效应提供了见解，还可能有助于选择合适的标记化合物，用于HM的临床效益相关质量控制。
方法
试剂和化学品
丹参素、原儿茶醛、丹酚酸A、丹参酚酸B、丹参酸D迷迭香酸、紫草酸、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮IIA的化学标准购自成都必达生物科技有限公司（中国）。人参皂苷Rg1、Rb1、Rh1和Rd购自吉林大学（中国）。异紫草酸A、异紫草精酸B和丹酚酸G从丹参在作者的实验室里。它们的化学结构(补充图S1)通过将核磁共振和质谱数据与报道的文献进行比较，明确地确定了。通过对HPLC-UV检测的峰面积进行归一化，确定每种参考化合物的纯度高于98%。大肠杆菌055:B5的LPS购自Sigma（美国）。抗iNOS抗体来自细胞信号技术（美国）；抗COX-2和β-肌动蛋白的抗体购自圣克鲁斯生物技术公司（美国圣克鲁斯）。
样品制备
强心丸（批号：110419）购自塔斯利制药有限公司（中国）。10种酚酸（PA）、4种人参皂苷（GN）、4种丹参酮（TN）和所有18种活性化合物（BECC）的组合是根据参考化合物在CP中的实际浓度混合制备的，这些浓度已在我们之前的研究中确定。组合的成分详见补充表S1.
细胞培养和细胞活力测定
RAW264.7小鼠巨噬细胞细胞系购自美国型培养物收藏中心（ATCC，USA），并在37°C的加湿5%CO中，在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基中培养2大气。所有培养试剂均购自美国生命科技公司。根据制造商的说明，使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8试剂盒，日本Dojido）测量RAW264.7细胞活力。简而言之，细胞（5×104 细胞/孔）被镀到96 well板上，并在1μg/ml LPS存在下用不同浓度的指示化合物、化合物组合或CP处理24 h。向每个孔中添加CCK-8（10μl），并在37°C下培养1 h，然后在450℃下进行吸光度检测nm，使用微孔板阅读器（synergy 2，BioTek，USA）。
亚硝酸盐测量
RAW264.7电池（5×104 细胞/孔）在96个平板中放置12 h，用不同浓度的指示化合物或化合物组合处理1 h，然后用LPS（1μg/ml）处理并再培养24 h。通过Griess分析测定上清液中亚硝酸盐的积累51简单地说，100μl无细胞培养基与50μl 1%磺胺在5%磷酸中和50μl 0.1%N-（1-萘基）乙二胺在水中反应。在550 nm处测量吸光度。
前列腺素E2和IL-6测量
RAW264.7电池（3×105 细胞/孔）在24孔板中接种12小时，并用不同浓度的指定化合物或化合物组合处理1小时，然后用LPS（1μg/ml）处理并再孵育24小时2（BD Biosciences，美国）和IL-6（Cusabio Biotech，中国）细胞培养上清液中的IL-6根据制造商的说明使用商用ELISA试剂盒进行测定。
用组合指数（CI）评价PA与TN的组合效果
组合中相互作用的研究涉及建立单种化合物和多种药物组合的剂量-效应曲线。在不同浓度下测试了单一化合物、10种酚酸组合（PA）、4种丹参酮组合（TN）、PA和TN组合抑制炎症介质水平的能力。抑制能力由以下等式计算得出：
药物的联合效应可以用联合指数（CI）来表征，其定义为：
其中Cx、 n个是化合物的浓度n个单独抑制x%。C类n个是化合物的浓度n个组合C中1 + C类2 + C类三 +…+ C类n个，抑制x%。
PA和TN之间的相互作用可通过以下方程式进行表征：
当CI等于、小于或大于1时，组合效应分别为加性、协同或拮抗。在本研究中，CI为1±0.1被视为可加性，CI值低于0.9被视为协同作用，CI值高于1.1被视为拮抗作用。加性效应是指根据质量作用定律原理预测的综合效应，协同作用是指产生大于预期的加性效应，对抗作用是指生成小于预期的加性效应45,46抑制浓度50（IC50)使用CompuSyn软件（美国ComboSyn公司）计算CI值。
具有加性效应的活性化合物的活性贡献计算
具有加性效应的活性化合物的活性贡献可通过活性贡献指数（ACIx个)，定义为：
其中Cx、 n个是化合物的浓度n个单独抑制x%。C类n个是化合物的浓度n个组合C中1 + C类2 + C类三 +…+ C类n个，抑制x%。
定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）
RAW264.7电池（1.5×106 细胞/孔）接种在6孔板中，孵育12小时，用测试样品处理1小时，然后用LPS（1μg/ml）处理，再孵育6小时（以量化iNOS、IL-6和IL-1β的mRNA）或12小时（以量化COX-2的mRNA）。根据制造商的说明，使用RNAprep纯试剂盒（中国天津）提取总RNA，并在使用前储存在−80°C。使用PrimeScript RT试剂盒（中国TaKaRa）将每个样品中的1 mg RNA反向转录为cDNA。引物序列如所示补充表S5和由GENEWIZ Inc.合成。实时PCR分析使用LightCycler 96系统（德国罗氏诊断公司）和FastStart Essential DNA Green Master（德国罗奇诊断公司）进行。在以下条件下进行实时PCR：95°C 10 min，然后进行45个95°C循环10 s，60°C 10 s和72°C 10 s.为了确认扩增的特异性，在每个PCR程序结束时进行熔融曲线分析。GAPDH作为家政基因用于归一化。
蛋白质印迹
RAW264.7电池（1.5×106 细胞/孔）在六孔板中放置12 h，用测试样品处理1 h，然后用LPS（1μg/ml）处理并再培养24 h。细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，并用RAPI裂解缓冲液（中国贝尤泰姆）进行裂解。蛋白质浓度使用比钦酸（BCA）蛋白质检测试剂盒（中国贝尤蒂姆）测定。每个裂解液中的蛋白质样品（30μg）在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝化纤维素膜（Millipore，USA）中，并在室温下用5%的非脂肪乳在含有0.1%吐温-20（TBST）的Tris缓冲盐水中封闭2 h。然后在4°C过夜，使用抗iNOS、COX-2和β-肌动蛋白的主要抗体。次要抗体是HRP结合的山羊抗兔或抗鼠抗体（中国贝尤蒂姆）。用ECL Western Blotting基板（Thermo Fisher Scientific）显影印迹，并使用Tanon图像系统（中国Tanon）通过扫描密度测定法进行分析。β-肌动蛋白作为间隔对照。
统计分析
使用GraphPad Prism 6.0软件（美国GraphPad-）进行统计分析。结果表示为来自至少三个独立实验的单个值的平均值±标准偏差。数据通过单因素方差分析和Dunnett事后检验进行比较。当p<0.05时，差异被认为具有统计学意义。
