图5

（A）在存在或不存在细胞渗透性甲基-α-KG的情况下，测定GDH1稳定敲除的癌细胞中的GPx活性。（B）在增加α-KG、富马酸、琥珀酸或苹果酸浓度的情况下，检测293T细胞纯化的鞭毛GPx1或人红细胞内源性GPx1的活性。Western blot分析显示每个样本的GPx1输入。（C）甲基-α-KG处理对GDH1敲除细胞内富马酸水平的影响。（D）从转染的293T细胞裂解物中提取Flag-GPx1并与¹⁴C-富马酸或¹⁴C-α-KG。将未结合的代谢物洗掉，并使用闪烁计数器测量富马酸或α-KG的残留量。Western blot分析显示每个样本的GPx1输入。（E）在富马酸盐（80µM）存在下，检测293T细胞中纯化的标记GPx1野生型（WT）或富马酸结合缺陷突变标记GPx1T143A/D144A（2A）的活性。Western blot分析显示每个样本的GPx1输入。（F）细胞内富马酸水平（上部）和内源性GPx的相对酶活性(降低)在甲基-α-KG和SDHA siRNA存在或不存在的情况下检测GDH1敲除细胞。Western blot分析显示GDH1和SDHA的敲除。（G）细胞内富马酸水平(上面的)，GPx活动(中间的)和ROS水平(降低)在肿瘤细胞中，GDH1的稳定敲除是在存在或不存在细胞可渗透的富马酸二甲酯的情况下测定的。数据为三个重复的平均值±SD。p值由双尾Student’st吨试验（ns：无显著性；*0.01<p<0.05；**0.001<p<0.01）。另请参见图S4.