美国胃肠病杂志。 2014年12月； 109(12): 1942–1952.
基于血浆和胆汁中Select miRNA差异表达建立胰腺导管腺癌诊断试验的初步研究 医学博士、理学硕士， 1, 4 ，博士， 2, 4 ，理学硕士， 2 ，文学学士， 1 ，博士， 三 ，医学博士， 1 和 ，医学博士 2, *
格雷戈里·阿科特 1 美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院消化与肝脏科医学系
杰西·戈尔 2 美国印第安纳州印第安纳波利斯市印第安纳大学医学院西蒙癌症中心内分泌、生物化学和分子生物学系医学系和胰腺癌特征中心
萨曼莎·德·麦克利耶 2 美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院IU Simon癌症中心内分泌、生物化学和分子生物学部医学系和胰腺癌特征中心
劳拉·E·希瑟斯 1 美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院消化与肝脏科医学系
徐慧萍 三 美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院生物统计学系
斯图亚特·谢尔曼 1 美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院消化与肝脏科医学系
默里·科克 2 美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院IU Simon癌症中心内分泌、生物化学和分子生物学部医学系和胰腺癌特征中心
1 美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院消化与肝脏科医学系
2 美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院IU Simon癌症中心内分泌、生物化学和分子生物学部医学系和胰腺癌特征中心
三 美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院生物统计学系
* 美国印第安纳州印第安纳波利斯市西胡桃街980号沃尔特霍尔印第安纳大学医学院IU西蒙癌症中心，邮编：46202。电子邮件： ude.ui@crokm 4 前两位作者对这项工作的贡献相等
补充资料 补充材料。
指南：3C5E89E4-6714-4BD9-8FD3-69B5579E4A68
摘要 目标： 缺乏准确的胰腺导管腺癌（PDAC）诊断外周标志物。 我们测量了PDAC患者、慢性胰腺炎（CP）患者和对照组血浆和胆汁中选择性microRNA（miRNAs）的差异表达。
方法： 我们确定了患者( n个 =215）治疗无效PDAC( n个 =77），CP伴胆管/胰管病理( n个 =67）和控制( n个 =71）在进行内镜逆行胰胆管造影或内镜超声检查时，已前瞻性登记入胰胆管生物库。 对照组为胆总管结石患者，但胰腺正常。 将样本分为训练( n个 =95）和验证( n个 =120）队列建立并测试PDAC特征面板在诊断PDAC中的性能。 培训队列( n个 =95）包括PDAC、CP和对照组的年龄匹配患者。 小组来源于血浆或胆汁中10个候选miRNAs的差异表达。 我们选择了精确度极高的miRNAs纳入回归模型。
结果： 通过训练队列，我们确认了9/10 miRNAs在血浆（miR-10b、-30c、-106b、-132、-155、-181a、-181b、-196a和-212）和胆汁（不包括miR-21、-132和-181b）中的差异表达。 其中，有五种药物（miR-10b、-155、-106b、-30c和-212）在区分PDAC方面具有极好的准确性。 在训练和验证队列中，来自血浆的PDAC面板的敏感性/特异性分别为95/100%和100/100%； 胆汁中分别为96/100%和100/100%。
结论： 血浆中miRNA-10b、-155和-106b的表达增加对PDAC的诊断具有高度的准确性。 需要更多的研究来确认该小组并探讨其作为预后测试的价值。
简介 胰腺导管腺癌（PDAC）缺乏可靠的血液标志物，降低了筛查策略在慢性胰腺炎（CP）等高危人群中的潜在有效性。 此外，在PDAC患者中，目前临床上没有组织学或分子靶点用于指导治疗或告知生存率评估。 因此，发现来源于血液或胆汁的生物标记物有助于区分PDAC和CP，并为PDAC患者提供预后信息，这将极大地影响患者管理。 此外，生物标记物可以指导旨在阐明PDAC特异性发育不良-癌机制和确定新疗法的基因或蛋白质靶点的研究。
因为它们的生物稳定性和在癌症病理生物学中的作用( 1 , 2 , 三 )，microRNAs（miRNAs）作为癌症生物标记物具有巨大潜力( 4 , 5 ). miRNA是一种短的非编码RNA，由18-25个核苷酸组成，其功能是靶向特定的mRNA部分进行翻译抑制或降解，从而调节多种生物过程，包括细胞增殖、迁移、侵袭、存活和转移( 6 , 7 , 8 , 9 ). miRNAs也与PDAC进展和患者生存的调节有关( 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 ). 大多数评估PDAC中miRNAs的研究都来自外科组织样本； 通过在PDAC组织中的差异表达，已鉴定出近100个miRNAs( 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 ). 为了在临床设置（筛查、治疗计划和治疗反应评估）中发挥最大效用，最好的PDAC生物标记物将从血样中确定，并且在转诊专门的内窥镜手术后，生物标记物可以在胆汁或胰液抽吸物中容易地进行检测， 或细针抽吸获得的PDAC组织。
这项初步研究的主要目的是通过比较PDAC、CP和正常胰腺患者血浆和胆汁中miRNA的差异表达，评估选择miRNA作为区分PDAC、CP和无胰腺疾病患者的诊断标志物的效用。 其次，我们描述了具有可供分析的胰液样本的个体亚组中miRNAs的差异表达。
方法 患者队列 我们从2012年7月至2014年2月间前瞻性登记入印第安纳大学医学院胰胆管疾病数据库和生物知识库的队列中选择患者。 该数据库包括在印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学卫生大学医院接受内镜超声（EUS）或内镜逆行胰胆管造影（ERCP）检查的PDAC、CP或其他良性胰胆管疾病患者。 这是一个针对晚期胰腺疾病患者（如CP和PDAC）的三级转诊中心。 从这个知识库中，我们选择了具有可用血浆、胆汁、胰液或某些组合的患者。 所有样本均在内窥镜检查之前或期间立即采集。
我们将所有确诊为PDAC组织诊断的患者纳入知识库，并且之前未对PDAC进行治疗。 为了开发和验证用于诊断PDAC的PDAC签名面板，我们建立了一个训练队列和一个源自知识库的验证队列。 为了减少年龄对miRNA诊断准确性的混杂影响，我们设计了训练队列，包括PDAC患者的随机亚组和已确认患有CP或其他良性胆道疾病的患者的年龄匹配样本（对照组） 使用可用样本进行频率匹配方案分析。 所有CP患者均接受ERCP治疗，以治疗胆道或胰管病理（即狭窄）。 所有归类为对照组的患者均接受ERCP治疗胆总管结石。 选择针对训练队列的样本量，以提供>80%的能力检测诊断准确度差异0.1（由受试者操作特征（ROC）曲线下的面积表示），以与糖类抗原19-9（CA19-9）相比，区分PDAC和其他使用血浆miRNAs的患者。 由于研究的探索性，我们假设α水平为0.1。 根据先前的研究，假设CA19-9的诊断准确性在ROC曲线（AUC）下的面积为0.85( 19 , 20 ). 为了验证从训练队列中开发的miRNA小组的诊断性能，我们随后建立了一个验证队列，该队列由具有相同诊断的个人组成，使用来自知识库的单独随机样本， 其中患者年龄不匹配，因此数据代表了EUS、ERCP或两者均可疑PDAC、CP和胆总管结石患者的真实队列。
手术时收集了相关的临床数据，PDAC的诊断需要细胞病理学证实。 所有PDAC患者均在开始治疗（未接受治疗）前登记。 根据剑桥标准对CP患者进行CT、ERCP或两者的分类( 21 ). 对照组受试者之前接受过正常的胰腺横截面成像。 在受试者登记之前，我们当地的机构审查委员会批准了该研究方案，并且每个受试者都签署了知情同意书。
样品采购 签署同意书后，在内窥镜检查开始之前，收集不超过20 ml的血液，并均匀地分配到EDTA涂层管中。 在接受ERCP的受试者中，抽取1–5 ml胆汁和/或胰液，并收集在无涂层的试管中。 样品最初储存在4–8°C下，然后通过离心快速处理，然后收集上清液。 处理后，将所有上清液储存在−80°C下，直至分析。
miRNA选择和检测方法的原理 分析样本的研究人员（A.J.G.、S.D.M.和M.K.）对潜在诊断不了解。 根据我们小组和其他人以前的研究，我们分析了血浆、胰液和胆汁抽吸物中10个已知或怀疑与PDAC相关的miRNA候选物（miR-10b、-21、-30c、-106b、-132、-155、-181a、-181b、-196a和-212）。 这些miRNA中的每一种都在PDAC中过表达，或者在机制上与RB功能障碍或表皮生长因子受体有关，这两者在PDAC的病理生物学中都具有关键作用( 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 ). 与正常或CP患者相比，我们之前报告过PDAC患者档案血浆样本中miRNA-10b水平升高( 12 ). 重要的是，miRNA-10b是PDAC中最常上调的miRNAs之一，我们以前曾利用EUS衍生细针抽吸物的活检，将PDAC中癌细胞中miRNA-10/b表达的降低与生存率、新辅助放化疗反应和转移延迟时间的提高相关联( 29 ). 因此，我们假设这10个血浆miRNAs在PDAC中代表着广泛的功能，并且具有很高的释放到循环中的潜力。 包括胆汁和胰液的理由是，许多PDAC和CP患者存在胆汁或胰管梗阻。 这通常促使ERCP结合EUS衍生的细针抽吸进行引流和导管内组织采样。 组织取样依赖于操作人员，在CP设置中细胞病理学不准确，因此在某些情况下，需要抽吸胆汁或胰液的诊断测试在临床上是有用的。
使用Trizol-LS（加利福尼亚州卡尔斯巴德生命科技公司）从样品中分离出总RNA。 根据制造商的建议，使用10 ng RNA结合miRNA-10b、-21、-30c、-106b、-132、-155、-181a、-181b、-196a、-212或-425-5p逆转录引物和miRNA逆转录试剂盒（生命科技）生成互补DNA。 使用Taqman（纽约州格兰德岛生命科技公司）miRNA表达分析试剂对每个miRNA进行定量PCR。 所有候选miRNAs的表达水平均归一化为miRNA-425-5p，在所有样本中的表达水平相似，样本之间的周期阈值（Ct）差异小于1( 31 ). MiRNA-16、-23a和-93被评估为内源性对照，但这些miRNAs表现出比miR-425-5p更大的样本间变异性。 将miR-425-5p（ΔCt）归一化后，取对照组中miRNAs的ΔCt值的平均值，并从每个样本的ΔC值中减去（ΔΔCc），使用2 -ΔΔCt 方法，该方法表示标准化Ct值中每一个差异都有两倍的差异( 32 ).
统计分析 使用正态分布连续变量的方差分析、非正态分布持续变量的非参数Kruskal–Wallis检验和Pearsonχ 2 分类变量测试。 描述性统计采用正态分布连续变量的平均值±标准差和非正态分布持续变量的中位数/四分位数范围进行报告。 对每个变量进行两两比较 P（P） 使用Bonferroni方法调整的值( 33 ).
PDAC特征小组开发的第一步涉及在训练队列中使用logistic回归进行双变量分析，以确定每个miRNA的表达水平与PDAC的存在/缺失之间的关系（PDAC与CP或对照）。 使用ROC曲线和AUC描述每个miRNA的预测性能，精确性定义为AUC>0.90。 我们还评估了每个miRNA在区分PDAC与CP、PDAC与对照、CP与对照中的预测性能。 为了探索表达水平的二分法，我们使用分类树模型进一步检验了在PDAC预测的双变量分析中具有良好准确性的miRNA。
然后使用logistic回归进行多变量分析，在正向逐步选择程序中包括所有miRNAs的精确二分表达水平( P（P） <0.20（对于进入和停留在模型中），以确定PDAC签名小组的最终预测因素。 我们选择了 P（P） 由于分析的探索性，在多变量模型中小于0.20。 最后，我们构建了一个得分系统，使用最终logistic回归模型的系数将分数分配给miRNAs。 我们通过将相应系数除以最终模型中的最小系数并四舍五入到最接近的整数来计算与每个miRNA相关的点。 然后，我们通过在最终模型中添加所有miRNAs的积分来计算每个患者的Panel得分。 单独使用血浆和胆汁重复PDAC特征小组评分系统。
为了验证PDAC签名小组，我们通过确定验证队列中每个患者的风险点，将训练队列中构建的评分系统应用于验证队列。 使用敏感性和特异性评估这些特征面板的性能。
由于患者的胰液样本有限，我们在二次分析中使用来自PDAC和CP患者训练和验证队列的数据描述了miRNAs的差异表达。 此外，为了便于描述，我们测量了患有转移性（IV期）和非转移性（I-III期）疾病的PDAC患者之间miRNA表达的差异。 使用SAS v.9.3（北卡罗来纳州Cary）和R Project软件（奥地利维也纳）进行统计分析。
结果 研究人群 该研究共包括215名生物知识库中确定的个体，其中95名受试者参与了培训，120名受试人参与了验证队列( ). 在患有PDAC的个体中，53/77（69%）在样本采集时处于T1–T3阶段。 临床特征总结于 在训练队列中，年龄和性别没有显著差异； 在验证队列中，PDAC患者明显年龄较大。 在训练队列中，对照组受试者中吸烟的流行程度较低，但PDAC和CP个体之间的吸烟情况相似； 根据烟草使用情况，miRNA表达没有差异( 补充图S1 在线）。 酒精使用在验证队列中的对照受试者中不太普遍，但在训练和验证队列中，PDAC和CP个体之间的情况相似。
研究人群( n个 =215). 慢性胰腺炎； PDAC，胰腺导管腺癌。 7名PDAC受试者在培训中缺少阶段信息( n个 =1）和验证( n个 =6）队列。
表1 患者特征
变量 个人数字助理 人物配对关系 控制 P（P） 价值 PDAC与CP PDAC与对照 CP与控制 培训队列 N个 =40 N个 =30 N个 =25 平均年龄（s.d.） 一 66.5 (9.8) 64.0 (10.4) 66.4 (10.8) 0.567 女性， n个 (%) 24 (60%) 15 (50%) 15 (60%) 0.658 烟草使用、状况、， n个 (%) 从未 18 (47.4%) 6 (21.4%) 13 (61.9%) 0.012 0.083 1 0.016 曾经 13 (34.2%) 9 (32.1%) 6 (28.6%) 当前 7 (18.4%) 13 (46.4%) 2 (9.5%) 饮酒、状态 从未 20 (51.3%) 15 (55.6%) 17 (81%) 0.084 曾经 13 (33.3%) 11 (40.7%) 3 (14.3%) 当前 6 (15.4%) 1 (3.7%) 1 (4.8%) 吸烟和饮酒， n个 (%) 13 (35.1%) 12 (44.4%) 2 (9.5%) 0.030 1 0.097 0.025 验证队列 平均年龄（s.d.） 65.2 (11.9) 47.7 (12.2) 48.8 (15.8) <0.001 <0.001 <0.001 1 女性， n个 (%) 18 (48.7%) 19 (51.4%) 31 (67.4%) 0.170 烟草使用、状况、， n个 (%) 从未 13 (35.1%) 8 (21.6%) 15 (33.3%) 0.274 曾经 13 (35.1%) 9 (24.3%) 14 (31.1%) 当前 11 (29.8%) 20 (54.1%) 16 (35.6%) 饮酒、状态 从未 22 (61.1%) 15 (40.5%) 33 (73.3%) 0.030 0.455 1 0.018 曾经 9 (25%) 17 (46%) 7 (15.6%) 当前 5 (13.9%) 5 (13.5%) 5 (11.1%) 吸烟和饮酒， n个 (%) 11 (30.6%) 21 (56.8%) 10 (22.2%) 0.004 0.072 1 0.004
样本采购时的实验室特征总结如下 。我们没有对CA19-9进行比较统计，因为数值仅适用于PDAC患者。 与CP患者和对照组相比，PDAC患者的血清胆红素中位数和血清胆红素轻度升高（定义为>2mg/dl）的患者比例显著升高。 然而，将血清胆红素作为潜在的混杂变量并不影响miRNA的表达( 补充图S2 )或下面详细介绍的诊断面板的性能。 血清白蛋白和总蛋白的观察差异与临床无关（每个测量值的差异<1.0），各组间的白细胞计数和钙水平相似。
表2 实验室特征
变量 个人数字助理 人物配对关系 正常 P（P） 价值 PDAC与CP PDAC与正常 CP与正常 研究队列 N=40 N=30 N=25 CA19-9，U/ml中值（IQR） 385 (1,689) 总胆红素，mg/dl中位数（IQR） 5.3 (11.2) 0.6 (0.2) 0.7 (1.1) <0.001 <0.001 0.001 1 至少轻度升高（胆红素>2.0 mg/dl）， n个 (%) 20 (55.6%) 1 (3.5%) 4 (20%) <0.001 <0.001 0.024 0.176 白细胞，细胞×10 三 /μl（中位数，IQR） 7.5 (3.1) 7.8 (2.6) 5.9 (2.5) 0.107 白蛋白，g/dl平均值（标准日） 3.7 (0.5) 3.9 (0.6) 3.9 (0.4) 0.137 总蛋白质，g/dl平均值（标准日） 6.8 (0.8) 7.2 (0.6) 6.9 (0.5) 0.078 钙，mg/dl平均值（标准日） 9.3 (0.6) 9.4 (0.5) 9.3 (0.8) 0.674 验证队列 N=37 N=37 N=46 CA19-9，U/ml中值（IQR） 742.5 (1,477) 总胆红素，mg/dl中位数（IQR） 11.6 (13) 0.4 (0.3) 0.9 (1.2) <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 至少轻度升高（胆红素>2.0 mg/dl）， n个 (%) 26 (78.8%) 2 (5.4%) 9 (20.5%) <0.001 <0.001 <0.001 0.120 白细胞，细胞×10 三 /μl（中位数，IQR） 8 (4.6) 7.6 (1.6) 7.7 (3) 0.859 白蛋白，g/dl平均值（标准日） 3.5 (0.8) 3.9 (0.5) 3.9 (0.5) 0.005 0.039 0.005 1 总蛋白质，g/dl平均值（标准日） 6.5 (0.9) 6.9 (0.5) 7.2 (0.8) 0.001 0.074 <0.001 0.285 钙，mg/dl平均值（标准日） 9.1 (0.5) 9.3 (0.5) 9.4 (0.6) 0.070
MiRNA表达 我们在训练队列中评估了血浆和胆汁中的10个miRNA：除1个对照组外，所有对照组的血浆和胆汁均可进行分析，除15个PDAC、7个CP和3个对照组外，所有对照组的胆汁均可进行分析( 和 补充表S1 ). 在血浆miRNAs中，只有miRNA-21在各组间相似( P（P） =0.426). MiRNA-10b、-30c、-106b、-155、-181b、-196a和-212在所有三组中均存在显著差异 P（P） PDAC和CP患者之间的值<0.001( P（P） <0.001). MiRNA-132和-181a在所有三组中也存在显著差异( P（P） 分别=0.001和0.007），仅miRNA-181a的PDAC和CP的配对比较中存在统计学显著差异( P（P） =0.016). 在胆汁中，除miRNA-21外，各组间的所有miRNAs均存在显著差异( P（P） =0.151），miRNA-132( P（P） =0.535）和miRNA-181b( P（P） =0.297). 除miRNA-181a外，PDAC与CP的配对比较中，胆汁中miRNA表达的差异持续存在( P（P） =0.115）和miRNA-196a( P（P） =0.198); 在PDAC与对照组的配对比较中，胆汁miRNA表达的差异持续存在。 ROC曲线显示了每种miRNA区分PDAC与CP和对照的准确性( ).
训练队列血浆和胆汁样本中microRNA（miRNA）的表达( n个 =95). y轴表示训练队列血浆和胆汁中测得的10个miRNAs中每一个的miRNA.Box图的相对表达。 慢性胰腺炎； IQR，四分位范围； PDAC，胰腺导管腺癌。
血浆的准确度( 一 )和胆汁( b条 )miRNAs在胰腺癌诊断中的应用。 受体操作特征曲线说明了每个血浆和胆汁miRNA在区分胰腺癌患者与慢性胰腺炎和良性胆道疾病患者时的表现。
与患有I–III期疾病的PDAC患者相比( n个 =53），采集标本时患有IV期疾病( n个 =17，其中7人缺乏分期数据），10个miRNA测量值中的每一个都有相似的血浆miRNA谱。 尽管没有达到统计学意义，miRNA-132的中位数（四分位范围）表达( n个 =24）在IV期患者中较高（2.01（1.44）vs.0.57（1.58）， P（P） =0.0926); 胆汁中miRNA-155和-181b的表达( n个 =24）在IV期患者中较低（miRNA-155:14.59（18.29）vs.24.7（20.9）， P（P） =0.0792; miRNA-181b:0.62（0.84）对1.22（0.82）， P（P） =0.0448). 所有其他胆汁miRNAs在IV期和I-III期患者中的表达相似。
PDAC签名面板 双变量logistic回归分析表明，血浆和胆汁中的5种miRNAs（miRNA-10b、-30c、-106b、-155和-212）在基于训练队列的PDAC患者与其他患者（CP+对照）的鉴别中具有极好的准确性（AUC>0.90）( 补充表S2 ). 这些miRNAs也为区分PDAC和对照组提供了极好的准确性。 此外，每种miRNA在区分PDAC和CP受试者方面都具有良好的准确性（血浆miRNA-212，定义为AUC>0.80）或优异的准确性（所有其他血浆miRNA和所有五种胆汁miRNA）。 因此，我们选择这些miRNAs构建PDAC特征面板。 基于分类树分析，血浆miRNA-10b、-30c、-106b、-155和-212表达水平的二分阈值分别为3.579、4.873、2.920、10.680和2.013。 对于来自胆汁的相同五种miRNA，阈值分别为3.497、3.933、5.261、5.232和4.163。 考虑到这些阈值，计算并总结了这些来源于血浆和胆汁的miRNAs的敏感性和特异性 .
表3 训练队列中血浆和胆汁miRNA诊断PDAC的性能特征（n=95）
候选miRNA 真阳性( n个 ) 真阴性( n个 ) 假阳性( n个 ) 假阴性( n个 ) 敏感 特异性 左后+ 左后− 等离子 miR-10b型 38 54 0 2 95% 100% 103.6 0.06 miR-30c型 29 52 2 11 73% 96% 15.9 0.29 miR-106b型 40 53 1 0 100% 98% 36.3 0.09 miR-155型 37 54 0 三 93% 100% 100.9 0.09 miR-212型 36 45 9 4 90% 83% 5.2 0.13 胆汁 miR-10b型 24 45 0 1 96% 100% 87.4 0.06 miR-30c型 24 44 1 1 96% 98% 29.1 0.04 miR-106b型 24 45 0 1 96% 100% 87.4 0.06 miR-155型 24 45 0 1 96% 100% 87.4 0.06 miR-212型 24 45 0 1 96% 100% 87.4 0.06
使用来自验证队列的样本对血浆和胆汁中的miRNA-10b、-155、-106b、-30c和-212进行分析，与训练队列相似( ). 使用训练队列中的二分差异miRNA表达水平，我们单独使用血浆miRNA和胆汁miRNA构建PDAC特征面板( ). 仅使用血浆miRNAs，正向逐步选择程序选择miRNA-10b和-106b，其他三个miRNAs-从模型中删除 P（P） 值>0.20，因为每个miRNA之间具有高度相关性。根据包括血浆miRNA-10b在内的最终logistic回归模型得出的系数（参数估计值±s.e.3.83±1.87， P（P） =0.0405）和miRNA-106b（5.18±1.87， P（P） =0.0055），我们为miRNA-10b高（>3.579）和miRNA-106b高（>2.920）分配了1分。 使用≥2的血浆Panel评分诊断PDAC，在训练队列中，我们有38/40=95%的敏感性（95%置信区间（CI），83–99%），54/54=100%的特异性（95%置信限，93–100%），阳性似然比103.6（95%可信限，6.6–1637），阴性似然比0.06（95%可信区间，0.02–0.21），29/29=100%的敏感性（95%CI，88–100%） 在验证队列中，75/75=100%特异性（95%置信区间，95–100%），阳性似然比151（95%置信限，9.5–2392），阴性似然比0.02（95%可信区间，0.001–0.26）。
验证队列中血浆和胆汁中microRNA（miRNA）的表达( n个 =120). y轴表示验证队列中血浆和胆汁中测得的五种miRNAs的miRNA.Box图的相对表达。 慢性胰腺炎； IQR，四分位范围； PDAC，胰腺导管腺癌。
表4 血浆或胆汁来源PDAC标志板的性能特征
仅血浆 仅胆汁 PDAC签名面板得分 培训队列 验证队列 训练队列 验证队列 不是PDAC 个人数字助理 总计 不是PDAC 个人数字助理 总计 不是PDAC 个人数字助理 总计 不是PDAC 个人数字助理 总计 0 53 0 53 73 0 73 45 1（FP） 46 61 0 61 1 1 2（FN） 三 2 0 2 0 24 9 0 28 28 2 0 38 38 0 29 29 总计 54 40 94 75 29 104 45 25 70 61 28 89
我们仅使用胆汁miRNA构建了一个类似的模型。 正向逐步选择程序证实，在区分PDAC与其他病因方面，五种miRNAs中每一种的二分法表达水平表现相同。 添加两个或更多胆汁miRNAs并没有改善小组的表现。 因此，如果以下miRNA-10b（>3.497）、-106b（5.261）、-155（5.232）和-212（>4.163）中的任何一个miRNAs超过阈值得分，我们为患者分配一分。 使用胆汁小组评分≥1的阈值，在训练队列中，我们有24/25=96%的敏感性（95%置信区间，80–100%），45/45=100%的特异性（95%可信区间，92–100%）、阳性似然比87.4（95%可信限，5.5–1378.2）和阴性似然比0.06（95%可信范围，0.01–0.28），28/28=100%的敏感性（95%CI，88–100%）， 61/61=验证队列中的100%特异性（95%可信区间，94-100%）、阳性似然比123（95%可信范围，7.8-1944.4）和阴性似然比0.02（95%可信限，0.001-0.27）( ).
回归模型中包括血清胆红素（即控制血清胆红素差异）不会影响我们使用血浆的PDAC面板的性能特征( P（P） =0.73（血清胆红素）或胆汁miRNA( P（P） 血清胆红素=0.92）。
胰液 由于只有少数PDAC患者可以获得胰液( n个 =9）和CP( n个 =34）在整个队列中，我们还展示了这些组之间miRNA-10b、-155、-106b、-30c和-212的差异表达。 在单变量分析中，除miRNA-30c外，签名面板中所有miRNA的AUC=1.0（区分PDAC和CP的准确率为100%）（AUC=0.941）。 基于分类树的阈值为：miRNA-155为4.42，miRNA-106b为4.54，miRNA10b为3.41，miRNA212为3.69，miRNA30c为3.27。 与单独血浆和单独胆汁的模型类似，PDAC小组评分≥1正确诊断出所有患有PDAC的患者和CP患者。
讨论 在他们的一生中，68名美国人中有1人会患上PDAC，只有6%的患者能存活5年( 34 ). 宣扬吉西他滨、奥沙利铂/亚叶酸/伊立替康/氟尿嘧啶联合用药（FOLFIRINOX）等化疗药物增量益处的临床试验( 35 )和白蛋白结合的紫杉醇( 36 )报告以月为单位的生存效益。 考虑到这些令人沮丧的统计数据，人们对开发新的检测方法以在早期甚至在胰腺上皮内瘤变或早期导管内乳头状黏液性肿瘤等前驱病变中识别PDAC有着浓厚的兴趣( 37 , 38 , 39 ). 优越诊断的需要适用于患有或不患有慢性胰腺炎的患者，这些患者存在不确定的胆道或胰管狭窄，其中基于ERCP的组织采样技术的灵敏度有限，并且可以应用胆汁或胰液抽吸。 此外，PDAC的外周生物标记物可用于社区医院的梗阻性黄疸患者和疑似PDAC患者的一线检测，因为无法进行EUS和ERCP组织采样。 miRNA是一种短的非编码RNA，在临床应用中代表了一类有吸引力的诊断和预后生物标志物，因为它们在组织和体液中保持稳定，并通过改变各种蛋白质（如表皮生长因子受体）的表达来影响癌细胞的病理生物学。 评估全血中不同miRNA谱的病例对照研究( 19 , 40 )或血浆/血清( 12 , 27 , 41 , 42 )产生了不同的结果。 鉴于单个miRNA的高度准确性和我们队列中的PDAC特征面板，血浆似乎是优于血清的培养基( 41 )或者全血( 19 , 43 )用于此指示。
在目前的分析中，我们的小组纳入了miRNAs的差异表达，每个小组在区分PDAC与对照组和CP方面都有极好的准确性，其性能优于使用CA19-9的历史种群( 44 ). 因此，鉴于CP患者有发展为PDAC的风险，且CA19-9水平无法区分PDAC和CP，目前的miRNA谱在临床上可能很重要； 研究的miRNAs不受黄疸的影响( 补充图S2 )在我们的模型中加入血清胆红素并没有显著影响我们小组的诊断准确性。 我们的参考人群（患有胰胆管病变的CP患者和患有胆总管结石的对照组）反映了一组“真实世界”的患有各种胰胆管疾病的个体，其中一些（例如CP）可能模仿PDAC，并且外围生物标记物对其最为有用。 我们特意选择了一个患有胆总管结石的对照人群，而不是一个纯粹的健康对照人群，以尽量减少选择偏差。 对于癌症筛查，PDAC签名小组不太可能适用于普通人群，而是适用于高危人群，例如有家族史和CP的人群。
血浆、胆汁和胰液中MiRNA的稳定性 血浆miRNAs在广泛的pH值范围内稳定，当血浆经历多次冷冻/解冻循环或煮沸时不会降解( 45 , 46 ). 因此，毫不奇怪，我们在血浆、胆汁和胰液中产生了可重复的miRNA表达结果。 重要的是，在临床实践中，胆管和胰管狭窄患者是一个诊断难题。 基于ERCP和EUS的组织取样技术降低了区分PDAC和CP及其他良性狭窄病因的敏感性，因此，抽吸胆汁、胰液或两者都是胰胆管镜检查和荧光检查的一个有吸引力的替代方案 就地 杂交电流“二级”诊断试验在临床实践中的应用( 47 ). 此外，胰腺或胆管组织采样依赖于操作员，而所有ERCP提供者都可以进行胆汁或胰液抽吸以进行miRNA分析。 ERCP通常用于疑似PDAC的设置，以缓解梗阻性黄疸或不确定的胰管狭窄，因此，抽吸胆汁或胰液可能会提高这种干预的诊断性能。
对手术外植体miRNA表达的分析表明，miRNA小组甚至可以区分胆管癌和PDAC，随着这些癌症亚型的系统治疗个性化，这一点将变得越来越重要( 48 ). 令人印象深刻的是，单凭血浆的性能就可以很好地将PDAC与CP和对照区分开来。 尽管如此，未来的研究仍应探索血浆+胆汁miRNAs作为生物标记物的潜在互补作用，以区分胰腺癌与胆管癌或胰腺转移病灶。
外周miRNA作为预后标志物 MiRNA-10b、miR-21和miR-155在PDAC生物学中很重要( 12 , 13 , 15 , 17 , 29 ). 然而，在本研究中，miR-21并不能作为良好的血浆、胆汁或胰液生物标记物。 这一观察结果强调了一个事实，即调节miRNA释放到循环中的机制是复杂的，不能推广到所有的miRNA，并且还没有被清楚地描述。 此外，我们之前证明，miRNA-10b和miRNA-21在PDAC细胞中丰富，也存在于癌相关成纤维细胞中； 另一方面，miRNA-155定位于胰腺癌微环境中的CD45+T细胞，而在癌细胞中不存在( 29 , 49 ). 因此，PDAC中表达特定miRNA的细胞类型并不一定决定其作为外周生物标记物的用途。
我们也没有观察到I–III期和IV期PDAC患者中miRNAs表达的显著差异。 然而，我们的横断面研究没有包括在手术切除或系统治疗后连续收集血浆以追踪miRNA表达，PDAC患者的随访时间相对较短。 因此，我们无法推断血浆、胆汁或胰液中差异表达的某些miRNAs是否与特定治疗反应或生存相关。 尽管如此，目前的研究结果表明，血浆miRNA标记可以作为PDAC的非侵入性诊断测试，并且在ERCP期间获取胆汁或胰液中的miRNA用于评估和治疗胰胆管狭窄可能同样准确。 此外，当前的miRNA特征可以补充最近描述的蛋白质生物标记物( 50 )不受黄疸或年龄的影响。 我们故意在训练队列中选择年龄匹配的CP患者和对照组，以消除其影响结果的可能性。 与之前的研究一致，我们没有观察到随着年龄增长，对照组受试者的血浆miRNA表达存在显著差异( 补充图S3 ) ( 51 , 52 ). 验证队列代表了EUS、ERCP或两者兼有的疑似PDAC、CP和胆总管结石患者的真实队列（对照组）； 应用于该验证组的血浆和胆汁平板对诊断PDAC具有极好的敏感性和特异性。
我们研究的一个局限性是，我们无法直接将我们的PDAC签名面板的性能与CA19-9进行比较，CA19-9-是目前唯一可用于PDAC的外周生物标记物，因为大多数CP和对照个体都无法使用CA19-9。 然而，本研究中开发的miRNA特征面板比基于历史人群的CA19-9具有更高的诊断准确性。 需要进行更多的队列研究来确认我们的miRNA小组（血浆和胆汁）在诊断PDAC方面是否优于CA19-9； 理想情况下，这些将与长期随访相结合，以确定所选miRNAs的预后价值。
总之，从血浆、胆汁或胰液中miRNA的差异表达发展而来的PDAC特征小组是一种有前途的新型PDAC诊断测试。 该小组准确地将PDAC患者与CP患者区分开来，CP是一种可能被考虑进行筛查的高危人群，并且有很大潜力提高ERCP对不确定胆管狭窄的诊断准确性。 未来的研究需要在更大的队列中验证该小组的诊断准确性，并评估其作为与PDAC患者生存率和治疗反应相关的标记物的有用性。
研究重点
致谢 我们感谢Glen Lehman、James Watkins、Lee McHenry、John DeWitt、Mohammad Al-Haddad、Julia Leblanc和Evan Fogel为本研究贡献的患者。
笔记 物品担保人 ：马里兰州Murray Korc。
具体作者贡献： 研究概念和设计（科特、戈尔和科克）； 数据采集（科特、戈尔、麦克利耶和希瑟斯）； 数据分析和解释（Coté、Gore、Xu和Korc）； 起草手稿（科特、戈尔和科尔）； 对重要知识内容的手稿进行批判性修订（McElyea、Xu、Sherman和Korc）； 统计分析（徐）。
财务支持： 这项工作的部分支持来自NCI向M.Korc提供的NIH拨款R37-CA-075059，以及NIDDK向NIH拨款5K23DK095148（科特）。
潜在竞争利益： 没有。
脚注
补充材料 链接到该论文的在线版本 网址：http://www.nature.com/ajg
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