图6

LiP探测启动后病毒衍生IAV核心蛋白的结构转变。（A） 基于胰蛋白酶（Tryp.）的轻度酸化X31病毒的LiP。X31在pH 7.4和5.8下在37°C下预处理1小时，中和，并用0.1%Triton X-100（Tx-100；室温下20分钟）裂解。对照样品未经分析。以1:4（胰蛋白酶/M1）的比例添加胰蛋白酶，并在RT下培养混合物指定的时间。通过添加含有2 mM PMSF的还原SDS样品缓冲液停止反应。样品通过SDS-PAGE进行解析，并使用针对M1（HB-64）的单克隆抗体通过Western blot分析进行M1胰蛋白酶裂解。（B） 适用于X31的LiP-SRM工作流程示意图。用0.1%NP-40中和和溶解引物和未引物病毒样品（RT下20分钟）。在酶/底物比为1:100的情况下，用PK进行5分钟的LiP。随后对样品进行变性和胰蛋白酶化，以进行LC-SRM/MS分析。比较了预处理和未预处理样品的胰蛋白酶肽强度。（C） 预酸化病毒（pH 5.8，60 min，37°C）和对照病毒（pH 7.4）之间M1、NP和HA的定量LiP肽的倍数变化反映了PK裂解敏感性的差异。x个轴，原木₂（褶皱变化）；年轴，−log₁₀(P（P）值）。P（P）每个条件下通过三次技术复制获得数值。使用P（P）<0.01的值被认为是显著的。（D，E）将LiP肽映射到M1序列（D，底部），并对M1（D，顶部）和NP（E）中的PK裂解位点进行图解可视化。三角形表示观察到预酸化病毒PK裂解显著增加的位置（基于LiP分析）。（F） 在5 mM K中预酸化的病毒之间，M1、NP和HA定量肽的倍数变化反映了PK裂解敏感性的差异⁺（低K⁺浓度）和病毒在120 mM K中预酸化⁺（高K⁺浓度）。调整了面板A的相同设置。（G） （底部）肽到M1序列的映射。（顶部）三角形表示在用120 mM K处理的病毒中观察到PK裂解增加的位置（基于LiP分析）⁺pH值5.8。（D、E和G）显示了病毒蛋白M1和NP的结构域组织示意图。指出了其他病毒成分的结合位点。NLS，核定位信号。