跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
单元格代表。作者手稿；PMC 2014年11月7日提供。
以最终编辑形式发布为：
Cell Rep.2014年10月9日；9(1): 1–8.
2014年9月25日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.celrep.2014.09.014
预防性维修识别码：项目经理4223866
NIHMSID公司：NIHMS633192标准
PMID：25263562

Sestrins与GATOR2相互作用，负调控mTORC1上游的氨基酸感应通路

Lynne Chantranupong,1,2,三，4,* 瑞秋·L·沃尔夫森,1,2,三，4,* 何塞·M·奥罗佐,1,2,三，4 罗伯特·A·萨克斯顿,1,2,三，4 索尼娅·斯卡里亚,1,2 Liron条形毛皮,1,2,三，4,† 埃里克·斯普纳,1 玛尔塔·伊萨,5 史蒂芬·P·吉吉,5和大卫·M·萨巴蒂尼1,2,三，4
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

mTORC1激酶是细胞生长的主要调节因子，对多种环境信号作出反应。一个关键输入是氨基酸，它通过异二聚体Rag GTPases（RagA/B结合到RagC/D）发挥作用，促进mTORC1向溶酶体表面（其活化位点）的移位。GATOR2是一种功能未知的复合物，通过作用于GATOR1上游或与其平行，积极调节mTORC1信号传导，GATOR2为RagA/B的GTPase激活蛋白（GAP），也是氨基酸感应通路的抑制剂。在这里，我们发现Sestrins是一个不太了解的生长调节剂家族（Sestrin1-3），以氨基酸敏感的方式与GATOR2相互作用。Sestrin2介导的mTORC1信号传导抑制需要GATOR1和Rag GTPases，Sestrins调节mTORCl对氨基酸的定位。因此，我们确定Sestrins为GATOR2相互作用蛋白，其调节mTORC1途径的氨基酸传感分支。

雷帕霉素复合物1（mTORC1）蛋白激酶的机制靶点是一种主生长调节剂，可感知多种环境线索，如生长因子、细胞应激、营养和能量水平。当被激活时，mTORC1磷酸化底物，这些底物可增强合成代谢过程，如mRNA翻译和脂质合成，并限制分解代谢过程，例如自噬。mTORC1失调发生在广泛的疾病中，包括糖尿病、癫痫和癌症(豪厄尔等人，2013年;Kim等人，2013年;拉普兰特和萨巴蒂尼，2012年).

许多上游输入，包括生长因子和能量水平，通过TSC复合体向mTORC1发出信号，该复合体调节Rheb，Rheb是一种小GTPase，是mTORC2的重要激活物(Brugarolas等人，2004年;Garami等人，2003年;Inoki等人，2003年;Long等人，2005年;Sancak等人，2008年;Saucedo等人，2003年;Stocker等人，2003年;Tee等人，2002年). 氨基酸似乎不会通过TSC-Rheb轴向mTORC1发出信号，而是通过异二聚体Rag GTPases发挥作用，该酶由结合到RagC或RagD的RagA或RagB组成(Hirose等人，1998年;Kim等人，2008年;Nobukuni等人，2005年;Roccio等人，2005年;Sancak等人，2008年;Schürmann等人，1995年;Sekiguchi等人，2001年;Smith等人，2005年). Rags控制mTORC1的亚细胞定位，氨基酸促进其向溶酶体表面募集，Rheb也位于溶酶体的表面(Buerger等人，2006年;Dible等人，2012年;Menon等人，2014年;Saito等人，2005年;Sancak等人，2008年). Rag GTPases上游途径的几个阳性成分已被鉴定。Ragulator复合体将Rags定位于溶酶体表面，并与液泡ATP酶一起促进GDP与RagA/B上的GTP的交换(Bar-Peled等人，2012年;Sancak等人，2010年;Zoncu等人，2011年). 独特的FLCN-FNIP复合物作用于RagC/D并刺激其将GTP水解为GDP(Tsun等人，2013年). 当RagA/B装载GTP，RagC/D装载GDP时，异二聚体将mTORC1结合并补充到溶酶体表面，在那里它可以与其激活物Rheb接触。

最近的工作已确定GATOR1复合物是氨基酸感应通路的主要负调控因子，其缺失导致mTORC1信号对氨基酸饥饿完全不敏感(Bar-Peled等人，2013年;Panchaud等人，2013年). GATOR1由DEPDC5、Nprl2和Nprl3组成，是RagA/B的GTPase激活蛋白（GAP）。GATOR2复合物有五个已知亚基（WDR24、WDR59、Mios、Sec13和Seh1L），是该途径的阳性成分，位于GATOR1的上游或平行，但其分子功能尚不清楚(Bar-Peled等人，2013年).

在这里，我们将塞斯特林确定为GATOR2的互动伙伴。色氨酸是三种相关蛋白质（色氨酸1-3），其分子功能特征较差(Buckbinder等人，1994年;Budanov等人，2002年;Peeters等人，2003年). Sestrin2抑制mTORC1信号，并被提议激活TSC上游的AMPK以及与TSC相互作用(布达诺夫和卡林，2008年). 我们发现Sestrins以氨基酸敏感的方式与GATOR2相互作用，调节mTORC1的亚细胞定位，并要求GATOR1和Rag GTPases抑制mTORCl信号传导。因此，我们得出结论，Sestrins是mTORC1上游氨基酸感应通路的组成部分。

色氨酸与GATOR2的氨基酸敏感性相互作用

为了开始探索GATOR复合物是如何调节的，我们试图鉴定GATOR2相互作用蛋白。在对稳定表达FLAG标记的GATOR2成分（WDR24、Mios或WDR59）的HEK-293T细胞制备的抗FLAG免疫沉淀物进行质谱分析时，我们一致检测到来源于Sestrin2的肽，其水平与真正的GATOR2成分Sec13的肽水平相当(图1A). Sestrin1和Sestrin3也存在，尽管含量低于Sestrin2(图1A).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms633192f1.jpg
色氨酸以氨基酸敏感的方式与GATOR2相互作用，但与GATOR1不相互作用

（A） GATOR2与Sestrins相互作用。质谱分析鉴定了来自稳定表达FLAG标记的GATOR2组分的HEK-293T细胞的免疫沉淀物中的Sestrin衍生肽。

（B） 重组Sestrin 1、2和3与重组GATOR2相互作用，但不与GATOR1相互作用。从表达载体中表达所示cDNA的HEK-293T细胞中收集抗FLAG免疫沉淀物，并通过免疫印迹法与细胞裂解物一起分析相关表位标签。

（C） 稳定表达的Sestrin2共同免疫沉淀内源性GATOR2成分。从稳定表达所示FLAG标记蛋白的HEK-293T细胞制备免疫沉淀物，并通过免疫印迹法与细胞裂解液一起分析所示蛋白。

（D） 稳定表达的GATOR2和内源性Sestrin2以氨基酸依赖方式相互作用。稳定表达所示FLAG标记蛋白的HEK-293T细胞饥饿氨基酸50分钟，或饥饿然后用氨基酸刺激10分钟。抗-FLAG免疫沉淀物的分析如（C）所示。

（E） 稳定表达的Sestrin2以氨基酸敏感的方式与内源性GATOR2相互作用。表达所示表位标记蛋白的HEK-293T细胞是氨基酸饥饿或饥饿，并用氨基酸重新刺激，如（D）所示，抗FLAG免疫沉淀物分析如（C）所示。

（F） GATOR2-Sestrin2相互作用对氨基酸和葡萄糖的可用性敏感，但不受生长因子的影响。稳定表达所示FLAG标记蛋白的HEK-293T细胞饥饿氨基酸、葡萄糖或生长因子50分钟，或饥饿并分别用氨基酸、葡萄糖和胰岛素重新刺激10分钟。抗-FLAG免疫沉淀物的分析如（C）所示。

与Sestrins是GATOR2相互作用蛋白相一致，重组FLAG标记的Sestrin1、Sestrin2或Sestrin3在HEK-293T细胞中瞬时共表达时与免疫沉淀GATOR2共表达，而不是GATOR1或meta2控制蛋白(图1B). 当在HEK-293T细胞中稳定表达时，FLAG-Sestrin2通过其Mios成分共同免疫沉淀内源性GATOR2(图1C). 由于稳定表达的FLAG-WDR24共免疫沉淀了大量内源性Sestrin2以及GATOR2的既定成分，因此其相互作用也是正确的(图S1A). 相反，作为GATOR1成分的FLAG-DEPDC5并没有协同免疫沉淀内源性Sestrin2，这表明GATOR1和Sestring2没有容易检测到的相互作用(图S1A). 鉴于已知GATOR1与GATOR2相互作用(Bar-Peled等人，2013年)，我们测试了增加FLAG-Sestrin2表达量对这种相互作用的影响，发现Sestrin1并没有干扰GATOR1协同免疫沉淀GATOR2的能力(图S1B).

氨基酸调节氨基酸途径中多个关键成分之间的相互作用(Bar-Peled等人，2012年;Sancak等人，2010年;Sancak等人，2008年;Tsun等人，2013年;Zoncu等人，2011年). 同样，无论是通过免疫沉淀GATOR2或Sestrin2监测，还是通过检测内源性Sestring2或GATOR2监测，氨基酸剥夺都会显著增加GATOR2-Sestrin1的相互作用(图1D、1E). 用雷帕霉素（变构mTORC1抑制剂）或Torin1（ATP-竞争性mTOR抑制剂）预处理细胞并不能阻止氨基酸诱导的GATOR2-Sestrin2相互作用的减少，表明mTORC2活性不能控制相互作用(图S1C). 与感觉氨基酸和生长因子的mTORC1上游通路在很大程度上是独立的这一概念一致，细胞的胰岛素治疗没有调节Sestrin2-GATOR2相互作用(图1E). 然而，有趣的是，葡萄糖缺乏导致与GATOR2结合的Sestrin2的量适度增加，尽管程度远低于氨基酸饥饿引起的增加(图1E). 葡萄糖水平以前被描述为Rag GTPases Ragulator-v-ATPase输入的上游输入(Efeyan等人，2012a)，这些结果与葡萄糖也影响GATOR2输入Rags的结果一致。

考虑到Sestrin2和GATOR2之间的强大相互作用，我们推断细胞内GATOR2的水平可能会影响Sestring2的水平，与其他复合物的成分类似，如Ragulator或GATOR1(Bar-Peled等人，2013年;Sancak等人，2008年). 事实上，内源性Sestrin2在细胞中的表达受到严重抑制，通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑强烈抑制GATOR2的Mios或WDR24成分(图S1D).

总之，这些结果将Sestrins确定为GATOR2相互作用蛋白，并确定Sestrins2和GATOR2以氨基酸敏感的方式相互作用，这表明Sestrin在向mTORC1发送氨基酸充足信号方面具有调节作用。

Sestrins抑制mTORC1上游的氨基酸感应通路

Sestrins以前曾被报道为mTORC1信号的负调控因子，通过激活AMPK发挥作用，AMPK反过来刺激TSC抑制Rheb，并通过结合TSC发挥作用(布达诺夫和卡琳，2008年). 在我们的实验系统中，在GATOR2和Sestrin2相互作用的条件下，我们无法检测到重组TSC1和内源性Sestring2之间的相互作用(图S1E). 考虑到Sestrin2与GATOR2的强烈相互作用，我们推断Sestrin2可能调节mTORC1途径感知氨基酸的能力。事实上，根据S6K1的磷酸化测定，Sestrin2的稳定过表达剂量依赖性地抑制氨基酸对mTORC1的激活，证实了其作为负调控因子的作用(图2A和S2A公司). 此外，与以前的报告一致(布达诺夫和卡林，2008年)，FLAG-Sestrin2的稳定过表达导致细胞大小急剧减小(图2B)mTORC1抑制的一个众所周知的结果(Fingar等人，2002年).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms633192f2.jpg
Sestrins是mTORC1上游氨基酸感应通路的负调控因子

（A） Sestrin2的稳定过表达抑制mTORC1信号传导，但不影响Akt的磷酸化。稳定表达所示蛋白的HEK-293T细胞需要50分钟的氨基酸饥饿，或需要10分钟的氨基酸再刺激。细胞裂解物的免疫印迹可用于分析所示蛋白质的水平和磷酸化状态。

（B） Sestrin2的稳定过度表达严重降低了细胞大小。对稳定表达所示蛋白的HEK-293T细胞和野生型HEK-293细胞的细胞大小进行分析。

（C） Sestrins水平的降低导致在氨基酸缺乏的情况下无法完全抑制mTORC1信号。使用CRISPR/Cas9系统用指示的指导RNA对HEK-293T细胞进行基因改造，然后用指示的shRNAs处理，然后饥饿氨基酸50分钟，或饥饿并用氨基酸重新刺激10分钟，并按（A）中所述进行分析。

（D） 所示shRNAs降低了Sestrin1和3的mRNA水平。对（C）中描述的样本进行定量聚合酶链反应（qPCR），以评估shRNA介导的Sestrin1和3基因敲除的效果。所示误差是基于单个qPCR运行样本计算的平均值的标准误差。

（E） Sestrin1和2的双重敲除夸大了观察到的表型。对细胞进行处理，并对细胞裂解物进行分析，如（A）所示。

在HEK-293T细胞中，由短发夹RNA（shRNA）介导的敲除或CRISPR/Cas9介导的基因敲除引起的Sestrin1或Sestrin2的抑制，在氨基酸退出时只导致mTORC1抑制的轻微缺陷(图2C和S2B-E中). Sestrin1和Sestrin3的双重击倒也有同样微弱的效果(图2C)而Sestrin1和Sestrin2在缺乏氨基酸的情况下更有力地挽救了mTORC1信号(图2E). 最后，当我们通过在用CRISPR/Cas9系统创建的Sestrin2-null细胞中表达靶向Sestrin1和Sestrin3的shRNAs来抑制所有三种Sestrin时，我们在氨基酸剥夺时获得了对mTORC1信号的强烈但仍然部分的拯救(图2C). 此外，在HEK-293E细胞中使用shRNAs三重敲除所有三种Sestrin，使细胞对葡萄糖剥夺不敏感(图S2F). 这些数据表明，Sestrins在mTORC1通路中起着冗余作用，它们共同对在缺乏氨基酸或葡萄糖的情况下发生的mTORCl信号的完全抑制是必要的。

Sestrins在GATOR1和Rag GTPases上游起作用

为了进一步了解Sestrins如何在氨基酸感应途径中发挥调节作用，我们研究了它们是否需要该途径的其他成分来抑制mTORC1信号。Rag GTPase异二聚体的核苷酸负载状态对于mTORC1正确检测氨基酸至关重要(Sancak等人，2008年). 氨基酸促进RagA/B的GTP负荷和RagC/D的GDP负荷，使其能够将mTORC1补充到溶酶体表面(Sancak等人，2008年). GATOR1的GAP活性导致RagA/B的GTP水解和该途径的抑制(Bar-Peled等人，2013年).

有几条证据支持这样的观点，即塞斯特林群岛位于Rags的上游，并依赖GATOR1作为mTORC1的负调控因子。首先，伴随的重组Sestrin2和显性活性RagB的过度表达Q99升-RagC公司S75N系列这对搭档阻止了Sestrin2介导的通路抑制，从而使Sestrin位于Rag GTPases的上游(图3A). 第二，虽然Sestrin2过度表达强烈抑制了表达GATOR1的细胞中的信号传导，但在通过CRISPR/Cas9-系统产生的Nprl3-null HEK-293E细胞中，Sestrin1未能抑制在没有GATOR1的情况下观察到的构成性mTORC1信号传导。因此，GATOR1与Sestrin2上位(图3B).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms633192f3.jpg
Rag GTPases和GATOR1上游的Sestrins功能

（A） Sestrins在Rag GTPases的上游起作用。含有组成活性RagB的Rag异二聚体99升-RagC公司75牛顿或主导负RagB54牛顿-RagC公司121升在HEK-293T细胞中，突变体与所示cDNA共同转染。制备了抗FLAG免疫沉淀物，并通过免疫印迹法对蛋白裂解产物进行了分析。

（B） GATOR1是Sestrins抑制mTORC1信号传导所必需的。所示结构在对照HEK-293E细胞或通过CRISPR/Cas9方法生成的缺乏所示GATOR1成分的细胞中稳定过度表达。通过免疫印迹检测所示蛋白的裂解液。

鉴于Sestrin2在GATOR1上游发挥作用，我们测试了它可能通过增强GATOR1的GAP活性来抑制该途径的可能性，然而，当从过表达Sestrin2的细胞中分离时，GATOR1的GAP活性没有改变(图S3A).

先前的工作表明，溶酶体相关机制，包括v-ATP酶，对于氨基酸诱导的mTORC1活化是必要的(Zoncu等人，2011年). 有趣的是，用刀豆霉素A（ConA）抑制v-ATP酶，降低了mTORC1信号，也减少了在缺乏氨基酸的情况下Sestrin2和GATOR2之间的相互作用(图S3B).

综上所述，这些结果表明，Sestrin2需要GATOR1和Rags来抑制mTORC1信号传导，并与它在mTORCl上游的氨基酸感应途径中具有调节作用相一致。

色氨酸对mTORC1的氨基酸调节亚细胞定位是必要的

鉴于Sestrin2位于GATOR1和Rags的上游，我们推断Sestrins可能通过控制mTORC1的亚细胞定位来抑制该途径，类似于之前描述的氨基酸感应途径的调节器(Bar-Peled等人，2013年;Petit等人，2013年;Sancak等人，2010年;Sancak等人，2008年;Tsun等人，2013年;Zoncu等人，2011年). 与这一观点一致，在稳定过度表达FLAG-Sestrin2的HEK-293T细胞中，尽管存在氨基酸，mTORC1未能转位到LAMP2阳性溶酶体(图4A和S4A系列). 相反，即使在缺乏氨基酸的情况下，shRNA介导的Sestrin1和Sestrin2的敲除也会导致溶酶体相关mTORC1水平升高(图4B). shRNA介导的Sestrin2-null细胞中Sestrin1和Sestrin3的敲除进一步增加了mTORC1在氨基酸剥夺条件下溶酶体的定位(图S4B). 综上所述，这些结果表明Sestrins是mTORC1信号传导的负调控因子，并且对于mTORCl在溶酶体表面的氨基酸依赖性定位是必要的(图4C).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms633192f4.jpg
Sestrins控制mTORC1对氨基酸的定位

（A） Sestrin2过度表达可阻止mTORC1向溶酶体募集。稳定表达所示重组蛋白的HEK-293T细胞在进行免疫荧光处理之前，被饥饿或饥饿，并用氨基酸重新刺激指定时间。插图描述了放大3.24倍的选定字段及其叠加。

（B） Sestrin1和Sestrin2缺失导致构成性mTORC1定位到溶酶体。如上文（A）所述，处理稳定表达所示shRNA结构的HEK-293T细胞。

讨论

氨基酸必须存在于细胞环境中，mTORC1才能激活，并通过信号通路被检测到，信号通路通过Rag GTPase的核苷酸负载达到顶点（参见(Bar-Peled和Sabatini，2014年;Efeyan等人，2012年b;Kim等人，2013年;袁等，2013)). 许多调节器影响Rags的核苷酸负载状态，以响应氨基酸的可用性，最显著的是Ragulator和GATOR1，它们分别是RagA/B的全球环境基金和GAP。GATOR2是一个研究较少的复合物，作用于GATOR1上游或与之平行，是mTORC1途径的阳性成分。在此，我们将Sestrins鉴定为GATOR2相互作用蛋白，要求GATOR1和Rags作为mTORC1上游氨基酸途径的负调控因子发挥作用。此外，我们还表明，氨基酸水平调节了Sestrin2和GATOR2之间的相互作用强度，并且Sestrin对于mTORC1向溶酶体表面募集以响应氨基酸是必要的。

有趣的是，v-ATP酶是mTORC1活性的一种已知调节因子，它与溶酶体表面的Ragulator进行氨基酸调节的相互作用，而v-ATP酶的抑制在缺乏氨基酸的情况下破坏了Sestrin2-GATOR2的相互作用(图S3B). 到目前为止，涉及GATOR复合物的分支和涉及mTORC1上游Ragulator/v-ATPase复合物的分枝之间的关系尚未彻底研究，这些数据表明这两个分支之间可能存在一些串扰。然而，还必须进行进一步的研究，以确定康那霉素A对Sestrin2-GATOR2相互作用的影响是抑制v-ATP酶的直接还是间接作用。

我们的工作提出了几个有趣的问题。首先，Sestrins作为mTORC1信号负调控因子的机制尚不清楚。虽然最初我们最吸引人的假设是，塞斯特林似乎并没有通过干扰GATOR1和GATOR2之间的相互作用来抑制该途径(图S1B)也不影响GATOR1对RagA/B的GAP活动(图S3A). 另一种可能性是Sestrins抑制GATOR2功能，而GATOR2功能又是向Rags发出氨基酸充足信号所必需的。GATOR2的功能尚不清楚，因此，虽然Sestrins可能通过这种诱人的机制影响mTORC1途径，但目前尚无法测试。

虽然Sestrin与烷基羟基过氧化物酶家族在结核分枝杆菌，它们似乎不具有任何还原酶活性(Budanov等人，2004年;Woo等人，2009年). 一个有趣的可能性是，色氨酸具有一种酶功能，这与它们作为mTORC1氨基酸传感分支的负调节器的作用有关，但需要进一步研究来了解色氨酸是否保留任何酶活性。

另一个问题是Sestrins在肿瘤发生中起什么作用（如果有的话）。在这里，我们证明，在缺乏氨基酸的情况下，Sestrins的缺失使细胞无法完全抑制mTORC1。同样，在缺乏氨基酸的情况下，GATOR1缺失细胞保留构成性mTORC1信号。DEPDC5、Nprl2和Nprl3共同编码GATOR1，被认为是肿瘤抑制基因(Bar-Peled等人，2013年). 此前有人推测Sestrins可能作为肿瘤抑制基因(Budanov等人，2010年)癌症基因组测序工作已经检测到所有三个Sestrin基因的突变(Bamford等人，2004年). 然而，我们在这里显示，三个Sestrin具有很大程度的冗余，因此癌细胞可能需要失去两个或全部Sestrin才能显著影响mTORC1信号，这可能是不太可能的。

最后，之前有报道称，Sestrins是通过AMPK和TSC对mTORC1信号传导的负调节因子，它们在mTORCl上游的生长因子传感分支中起作用，与氨基酸传感分支不同(布达诺夫和卡林，2008年). 虽然从我们的工作中可以清楚地看出，色氨酸影响氨基酸感应途径，但它们是否调节mTORC1上游的这两个分支，以及每一个潜在影响的相对重要性还有待澄清。虽然我们无法检测到重组Sestrin2和内源性TSC之间的任何相互作用(图S1E)，需要进一步的工作来充分了解Sestrins对这两个单独的信号通路的影响。

实验程序

材料

试剂来自以下来源：圣克鲁斯生物技术公司的LAMP2 H4B4和HRP标记的抗鼠和抗兔二级抗体；来自细胞信号技术的磷酸-T389 S6K1、S6K1，Sestrin2，mTOR，Mios和FLAG表位抗体；来自Bethyl实验室的HA表位抗体。RPMI、FLAG M2亲和凝胶、ATP、GDP和Sigma Aldrich的氨基酸；SAFC Biosciences的DMEM；罗氏XtremeGene9和全蛋白酶鸡尾酒；Alexa 488和568-结合二级抗体；Invitrogen灭活胎牛血清（IFS）；美国生物制品公司生产的无氨基酸RPMI。WDR24和WDR59抗体由谢建新（Cell Signaling Technology）慷慨提供。

细胞裂解和免疫沉淀

用冰镇PBS冲洗细胞一次，然后立即用Triton裂解缓冲液（1%Triton、10 mMβ-甘油磷酸盐、10 mC焦磷酸盐、40 mM Hepes pH 7.4、2.5 mM MgCl）进行裂解2和1片不含EDTA的蛋白酶抑制剂[Roche]（每25 ml缓冲液）。通过在微型离心机中以13000 rpm在4°C下离心10分钟来澄清细胞裂解物。对于抗FLAG免疫沉淀，用裂解缓冲液洗涤FLAG-M2亲和凝胶3次。然后将30μl 50%的亲和凝胶浆液添加到清除的细胞裂解液中，并在4°C下旋转培养2小时。用含有500 mM NaCl的裂解缓冲液洗涤珠子3次。在探索Sestrins与GATOR2相互作用的瞬时共转染试验的情况下，将珠子在最终的盐水中孵育30分钟，以减少非特异性结合。如前所述，通过添加50μl样品缓冲液并煮沸5分钟，使免疫沉淀蛋白变性(Kim等人，2002年)经8%-16%SDS-PAGE分离，免疫印迹分析。

在HEK-293T细胞的联合转染实验中，将200万个细胞置于10 cm培养皿中。20小时后，通过聚乙烯亚胺方法转染细胞(Boussif等人，1995年)图中显示的基于pRK5的cDNA表达质粒的数量如下：300 ng Flag-Metap2、100 ng Flag-WDR24、50 ng Flag-Sestrin1、25 ng Flag_Sestrin2或200 ng Flag-Sestrin3；2 ng Flag-S6K1或200 ng HA-Mios、HA-WDR59、HA-WRR24、HA-Sec13、HASeh1L、HA-Depdc5、HA-Nprl3或HA-Npr2。每次转染的质粒DNA总量用空pRK5标准化为5μg。转染后36小时，按照上述方法对细胞进行裂解。

对于需要氨基酸饥饿或重新刺激的实验，细胞按上述方法处理(Tsun等人，2013年). 简言之，将细胞在无氨基酸的RPMI中孵育50分钟，然后用氨基酸刺激10分钟。对于葡萄糖饥饿，细胞在缺乏葡萄糖但含有氨基酸和透析血清的RPMI培养基中培养50分钟，然后用5 mM D-葡萄糖重新刺激10分钟。对于胰岛素缺乏，将细胞在无血清的RPMI中孵育50分钟，并用1微克/毫升胰岛素再刺激10分钟。最后，当使用Torin1或Rapamycin时，在整个饥饿和再刺激期间，细胞分别与250 nM培养。

CRISPR/Cas9转基因细胞的制备

为了生成丢失GATOR2组分或Sesn2的HEK-293T细胞，将以下编码导向RNA的正（S）和反（AS）寡核苷酸克隆到pX330载体中(Petit等人，2013年).

  • sgMios_1S:caccgATCACATCAGTAAAACATGAG公司
  • sgMios_1AS:aaacCTCATGTTTACTGTGATc
  • sgWDR24_1S:caccgACGCAGGCTGTGGTGCACAC公司
  • sgWDR24_1AS:aaacGTGACCACACCCTCTGTc
  • sgWDR59_1S:caccgCGGGGAGATGGCGGCGCGA
  • sgWDR59_1AS:aaacTCGCGCCGCCATCTCCCCGc
  • sgSesn2_1S:caccgaGCCTCGAGCACCTG
  • sgSesn2_1AS:aaacCAGGTGCTGCTCGAGGCTCTc
  • sgSesn2_2S:caccGGACTACCTGTGTTCGCCC
  • sgSesn2_2AS:aaacGGGCGAACCGTGTCC
  • sgSesn2_3S:caccGCCACACAACACAAAGG
  • sgSesn2_3AS:aaacCCTTCGTGTGGCTGGC
  • sgGFP_1S:caccgTGAACCGCATCGAGCTGAA
  • sgGFP_1AS:aaacTTCAGCTCGATGCTCAc
  • sgNprl3_1S:caccGGCTTCAGGCTCCGTTCGA
  • sgNprl3_1AS:aaacTCGAACGGAGCTCGAAAGCC

第一天，将200000个细胞接种到6孔板的6孔中。种子接种后20小时，使用XtremeGene9将250 ng shGFP pLKO、1 ug pX330引导构建体和0.5 ug空pRK5转染每个孔。第二天，将细胞进行胰蛋白酶化，汇集在一个10厘米的培养皿中，并用嘌呤霉素筛选以清除未转染细胞。选择后48小时，抽吸培养基，并用缺乏嘌呤霉素的新鲜培养基补充。第二天，用流式细胞仪将细胞分为单个细胞，放入含有150 ul补充30%IFS的DMEM的96 well板孔中。细胞培养两周，所得菌落进行胰蛋白酶化和扩增。通过免疫印迹法验证克隆是否丢失相关蛋白。

补充材料

补充数据

单击此处查看。（12M，pdf）

致谢

我们感谢Sabatini实验室的所有成员提供了有益的见解，特别是Zhi-Yang Tsun的成像建议，以及William Comb和Yoav Shaul的qPCR建议。我们还感谢Michael Mi博士在质谱分析方面的帮助。这项工作得到了NIH（R01 CA103866和AI47389）和国防部（W81XWH-07-0448）对D.M.S.的资助，以及NIH对L.C.（F31 CA180271）、R.L.W.（T32 GM007753）、J.M.O.（T32GM007752）、S.M.S.（Paul Gray UROP Fund）的奖学金支持(3143900)和M.I.（GM67945）。D.M.S.是霍华德·休斯医学研究所的研究员。

工具书类

  • Bamford S、Dawson E、Forbes S、Clements J、Pettett R、Dogan R、Flanagan A、Teague A、Futreal PA、Stratton MR等。COSMIC（癌症体细胞突变目录）数据库和网站。英国癌症杂志2004 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bar-Peled L、Chantranupong L、Cherniack AD、Chen WW、Ottina KA、Grabiner BC、Spear ED、Carter SL、Meyerson M、Sabatini DM。Rag GTPases的GAP活性肿瘤抑制复合物，其信号氨基酸对mTORC1的充分性。科学。2013;340:1100–1106. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bar Peled L，Sabatini DM。氨基酸对mTORC1的调节。细胞生物学趋势。2014;24:400–406. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bar-Peled L、Schweitzer LD、Zoncu R、Sabatini DM。Ragulator是Rag GTPases的全球环境基金，用于向mTORC1发送氨基酸水平信号。单元格。2012;150:1196–1208. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Boussif O、Lezoualc'h F、Zanta MA、Mergny MD、Scherman D、Demeneix B、Behr JP。一种用于将基因和寡核苷酸转移到培养和体内细胞的通用载体：聚乙烯亚胺。美国国家科学院院刊。1995;92:7297–7301. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Brugarolas J、Lei K、Hurley RL、Manning BD、Reiling JH、Hafen E、Witters LA、Ellisen LW、Kaelin WG。REDD1和TSC1/TSC2抑癌复合物对缺氧反应中mTOR功能的调节。基因与发育。2004;18:2893–2904. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Buckbinder L，Talbott R，Seizinger BR，Kley N.温度敏感型p53突变体的基因调控：p53反应基因的鉴定。美国国家科学院院刊。1994;91:10640–10644. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Budanov AV，Karin M.p53靶基因Sestrin1和Sestrin2连接基因毒性应激和mTOR信号。单元格。2008;134:451–460. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Budanov AV、Lee JH、Karin M.Stressin‘Sestrins与衰老作斗争。EMBO分子医学。2010;2:388–400. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Budanov AV、Sablina AA、Feinstein E、Koonin EV、Chumakov PM。通过p53调节的倍体蛋白、细菌AhpD同源物再生过氧化还原蛋白。科学。2004;304:596–600.[公共医学][谷歌学者]
  • Budanov AV，Shoshani T，Faerman a，Zelin E，Kamer I，Kalinski H，Gorodin S，Fishman a，Chajut a，Einat P，et al.鉴定一个参与细胞活性调节的新应激反应基因Hi95。致癌物。2002;21:6017–6031.[公共医学][谷歌学者]
  • Buerger C，DeVries B，Stambolic V.大黄在内膜的定位对其信号功能至关重要。生物化学和生物物理研究通讯。2006;344:869–880.[公共医学][谷歌学者]
  • Dibble CC、Elis W、Menon S、Qin W、Klekota J、Asara JM、Finan PM、Kwiatkowski DJ、Murphy LO、Manning BD。TBC1D7是mTORC1上游TSC1-TSC2复合物的第三亚基。分子细胞。2012;47:535–546. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Efeyan A、Zoncu R、Chang S、Gumper I、Snitkin H、Wolfson RL、Kirak O、Sabatini DD、Sabatini DM。Rag GTPases对mTORC1的调节对于新生儿自噬和存活是必要的。自然。2012年a月；493:679–683. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Efeyan A、Zoncu R、Sabatini DM。ScienceDirect.com-分子医学趋势-氨基酸和mTORC1：从溶酶体到疾病。分子医学趋势2012年b [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Fingar DC、Salama S、Tsou C、Harlow E、Blenis J.哺乳动物细胞大小由mTOR及其下游靶点S6K1和4EBP1/eIF4E控制。基因发育。2002;16:1472–1487. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Garami A，Zwartkruis F，Nobukuni T，Joaquin M.Science Direct.com-分子细胞-Rheb的胰岛素激活，mTOR/S6K/4E-BP信号的介体，被TSC1和2抑制。分子细胞2003[公共医学][谷歌学者]
  • Hirose E、Nakashima N、Sekiguchi T、Nishimoto T。RagA是参与Ran/Gsp1-GTPase途径的酿酒酵母Gtr1p的功能同源物。细胞科学杂志。1998;111（第1部分）：11–21。[公共医学][谷歌学者]
  • Howell JJ，Ricoult SJH，Ben Sahra I，Manning BD.mTOR在促进合成代谢中的作用越来越大。生物化学协会交易。2013;41:906–912.[公共医学][谷歌学者]
  • Inoki K，Li Y，Xu T，Guan K-L.大黄GTPase是TSC2 GAP活性的直接靶点，调节mTOR信号传导。基因与发育。2003;17:1829–1834. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kim D-H、Sarbassov DD、Ali SM、King JE、Latek RR、Erdjument-Bromage H、Tempst P、Sabatini DM。mTOR与猛禽相互作用，形成营养敏感复合物，向细胞生长机器发出信号。单元格。2002;110:163–175.[公共医学][谷歌学者]
  • Kim E、Goraksha-Hicks P、Li L、Neufeld TP、Guan K-L。Rag GTPases对TORC1营养反应的调节。自然细胞生物学。2008;10:935–945. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kim SG，Buel GR，Blenis J.mTOR复合物1信号通路的营养调节。分子和细胞。2013;35:463–473. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Laplante M，Sabatini DM。生长控制和疾病中的mTOR信号。单元格。2012;149:274–293. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Long X，Lin Y，Ortiz-Vega S，Yonezawa K，Avruch J.Rheb结合并调节mTOR激酶。当代生物学。2005;15:702–713.[公共医学][谷歌学者]
  • Menon S、Dibble CC、Talbott G、Hoxhaj G、Valvezan AJ、Takahashi H、Cantley LC、Manning BD。TSC复合体的空间控制整合了溶酶体中胰岛素和mTORC1的营养调节。单元格。2014;156:771–785. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Nobukuni T、Joaquin M、Roccio M、Dann SG、Kim SY、Gulati P、Byfield MP、Backer JM、Natt F、Bos JL等。氨基酸通过激活3类磷脂酰肌醇3OH激酶介导mTOR/猛禽信号。美国国家科学院院刊。2005;102:14238–14243. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Panchaud N，Peli-Gulli M-P，De Virgilio C.氨基酸剥夺通过Rag家族GTPase Gtr1的GTPase激活蛋白复合物抑制TORC1。科学信号。2013;6：ra42。[公共医学][谷歌学者]
  • Peeters H，Debeer P，Bairoch A，Wilquet V，Huysmans C，Parthoens E，Fryns JP，Gewillig M，Nakamura Y，Niikawa N，et al.PA26是人类异基因分裂的候选基因：人类和小鼠中新PA26相关基因家族的鉴定。人类遗传学。2003;112:573–580.[公共医学][谷歌学者]
  • Petit CS、Roczniak-Furguson A、Ferguson SM。卵泡蛋白向溶酶体的募集支持Rag GTPases的氨基酸依赖性激活。细胞生物学杂志。2013;202:1107–1122. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Roccio M、Bos JL、Zwartkruis FJT。氨基酸对小GTPase Rheb的调节。致癌物。2005;25:657–664.[公共医学][谷歌学者]
  • Saito K，Araki Y，Kontani K，Nishina H，Katada T。小GTPase Rheb的新作用：其在独立于雷帕霉素哺乳动物靶点激活的内吞途径中的意义。生物化学杂志。2005;137:423–430.[公共医学][谷歌学者]
  • Sancak Y、Bar-Peled L、Zoncu R、Markhard AL、Nada S、Sabatini DM。Ragulator-Rag复合物将mTORC1靶向溶酶体表面，是氨基酸激活其所必需的。单元格。2010;141:290–303. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sancak Y、Peterson TR、Shaul YD、Lindquist RA、Thoreen CC、Bar-Peled L、Sabatini DM。科学。第320卷。纽约州纽约市：2008年。Rag GTPases结合猛禽并介导mTORC1的氨基酸信号传导；第1496-1501页。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Saucedo LJ、Gao X、Chiarelli DA、Li L、Pan D、Edgar BA。Rheb作为胰岛素/TOR信号网络的一部分促进细胞生长。自然细胞生物学。2003;5:566–571.[公共医学][谷歌学者]
  • Schürmann A，Brauers A，Maßmann S，Becker W，Joost H-G。哺乳动物GTP-结合蛋白新家族（RagA，RagBs，RagB1）的克隆，与Ras-related GTPases具有远程相似性。生物化学杂志。1995;270:28982–28988.[公共医学][谷歌学者]
  • Sekiguchi T、Hirose E、Nakashima N、II M、Nishimoto T。新型G蛋白Rag C和Rag D与GTP结合蛋白Rag A和Rag B相互作用。生物化学杂志。2001;276:7246–7257.[公共医学][谷歌学者]
  • Smith EM、Finn SG、Tee AR、Browne GJ、Proud CG。结节性硬化蛋白TSC2不是氨基酸和某些细胞应激调节哺乳动物雷帕霉素靶点所必需的。生物化学杂志。2005;280:18717–18727.[公共医学][谷歌学者]
  • Stocker H、Radimerski T、Schindelholz B、Wittwer F、Belawat P、Daram P、Breuer S、Thomas G、Hafen E.Rheb是控制果蝇细胞生长的S6K的重要调节因子。自然细胞生物学。2003;5:559–565.[公共医学][谷歌学者]
  • Tee AR、Fingar DC、Manning BD、Kwiatkowski DJ、Cantley LC、Blenis J.结节性硬化复合物-1和-2基因产物共同作用，抑制雷帕霉素（mTOR）介导的哺乳动物靶向下游信号传导。美国国家科学院院刊。2002;99:13571–13576. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tsun ZY，Bar-Peled L，Chantranupong L，Zoncu R，Wang T，Kim C，Spooner E，Sabatini DM。卵泡蛋白肿瘤抑制物是RagC/D GTPases的GAP，该GTPases将氨基酸水平信号传递给mTORC1。分子细胞。2013;52:495–505. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Woo HA、Bae SH、Park S、Rhee SG。Sestrin 2不是过氧还蛋白的半胱氨酸磺酸的还原酶。抗氧化剂和氧化还原信号。2009;11:739–745.[公共医学][谷歌学者]
  • 袁H-X，熊Y，关K-L。营养传感、代谢和细胞生长控制。分子细胞。2013;49:379–387. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zoncu R、Bar-Peled L、Efeyan A、Wang S、Sancak Y、Sabatini DM。mTORC1通过需要液泡H+-ATPase的内-外机制感知溶酶体氨基酸。科学信号。2011;334:678–683. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]