Rac GTPase特异性小分子抑制剂的合理设计与表征

摘要

Rho家族GTPases是一种分子开关，控制调节细胞骨架组织、基因表达、细胞周期进展、细胞运动和其他细胞过程的信号通路(1). 它们可以通过与Dbl家族鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）的相互作用而被激活，GEF催化它们的GTP/GDP交换，并将它们与上游细胞表面受体（如G蛋白偶联受体、生长因子受体、细胞因子受体和粘附受体）的各种刺激物连接(2). 越来越多的证据表明Rho GTPases参与了癌症发展的许多方面(三–6)在许多人类肿瘤中，包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨髓瘤和头颈鳞状细胞癌中都发现了Rho-GTP酶的非调节性(7–11). 因此，Rho GTPases及其调控的信号通路被认为是潜在的抗癌治疗靶点(12). 由于在许多情况下，与致瘤特性或癌症预后不良相关的单个Rho蛋白是过度表达或上调，而不是组成性激活突变，因此Rho GTPase信号通路的一种靶向策略可能是通过其特定的Dbl家族GEF抑制Rho GTPase激活。

因为Dbl家族GEF的数量似乎远远超过Rho-GTPase底物的数量(2)Rho蛋白介导的信号特异性在一定程度上受特定的GEF–Rho相互作用的控制。最近可获得的GEF–Rho蛋白复合物的3D结构提供了有关GEF–Rho GTPase相互作用机制的丰富信息(13–15). 在之前关于Rac1与其GEF相互作用的结构映射研究中，我们和其他人已经确定由Rac1的开关I、开关II和β1/β2/β3区域形成的凹槽是GEF规范和精确定位残留Trp的关键区域⁵⁶作为Rac1的关键决定因素，用于Rac1特定GEF子集（包括Trio和Tiam1）的区分(16). Rac1突变体Rac1W56F失去了其反应性以及与Trio和Tiam1相互作用的能力，而相应的Cdc42突变体Cdc42F56W对Trio和Tiam1敏感(16,17). 此外，我们已经证明，一种源自Rac1序列的多肽含有Trp⁵⁶可以专门抑制全球环境基金与Rac1的绑定(16)增加了Trp周围结构特征的可能性⁵⁶可以探索Rac1的活性，以设计一种干扰试剂，通过其GEF特异性阻断Rac1活化。

在目前的工作中，我们应用了一种基于结构的虚拟筛选方法(18)寻找Rac–GEF相互作用特异性小分子抑制剂。通过筛选美国国家癌症研究所的化学文库，我们发现了一种化合物，NSC23766，它很适合以Trp为中心的全球环境基金识别槽⁵⁶第1组。我们表明，NSC23766作为Rac激活特异性抑制剂，可用于Rac功能的细胞生物学研究和针对Rac解除调控的治疗。

实验程序

虚拟筛选。这个统一该项目（Tripos Associates，St.Louis）用于筛选美国国家癌症研究所数据库中的化学物质，这些化学物质能够进入含有Trp的Rac1表面⁵⁶。然后使用该程序将候选化合物对接到Rac1表面柔性（Tripos Associates）实现能源最小化(19). 计算中显示出最高结合亲和力的化合物从国家癌症研究所癌症治疗和诊断部发展治疗计划药物合成和化学分部获得，用于进一步的实验测试。

重组蛋白生产。请参见支持文本，发布为支持信息在PNAS网站上。

体外复合物形成试验。约0.5μg（His）₆-标记的TrioN与0.5μg EDTA处理、GST融合的Cdc42或Rac1在含有20 mM Tris·HCl（pH 7.6）、100 mM NaCl、1 mM DTT、1%BSA、1%Triton X-100、1 mM-MgCl的结合缓冲液中孵育₂和10μl悬浮谷胱甘肽-淀粉粒。GST标记的Intersectin（≈0.75μg）与无核苷酸、His-6标记的Cdc42或Rac1（0.25μg）在结合缓冲液中与10μl悬浮谷胱甘肽-甘露糖珠孵育。将化合物23766或其他化学品按指示浓度添加到培养缓冲液中。4点孵育后°将谷胱甘肽珠在恒定搅拌下放置30分钟，用结合缓冲液洗涤两次。（他的）金额₆-用抗-His-Western印迹法检测与GST-融合结合珠共沉淀的标记蛋白。类似地，含有myc-Tiam1、AU-PDZ-RhoGEF或（His）的细胞裂解物₆-Rac1与纯化（His）混合₆-Rac1、GST-RhoA、GST-BcrGAP或GST-PAK1，以及蛋白质之间的成对关联性在各分析中的指示量为23766时进行评估。

体外鸟嘌呤核苷酸交换分析。在不存在或存在200 nM TrioN、Intersectin或PDZ RhoGEF的情况下，测定其核苷酸交换活性的是200 nM Rac1、Cdc42或RhoA负载的mant GDP，如所述(20).

内源性Rho GTPase活性测定。细胞在10 cm培养皿中以对数相生长，并在含有20 mM Tris·HCl（pH 7.6）、100 mM NaCl、10 mM MgCl的缓冲液中溶解前，在0.5%血清培养基中饥饿24小时或以其他方式指示₂、1%Nonide P-40、10%甘油和1×蛋白酶抑制剂混合物（罗氏分子生物化学公司）。如前所述，澄清裂解产物，标准化蛋白质浓度，并通过效应域下拉分析测定裂解产物中GTP-结合的Rac1、Cdc42或RhoA(16).

免疫荧光。请参见支持文本。

细胞生长测定。野生型、L61Rac1或各种GEF转染的NIH 3T3细胞在5%小牛血清中生长。将细胞在6孔板中以5×10的比例分成两份⁴在有或无指示量23766的情况下，每孔的细胞数每天进行计数。采用CellTiter 96 AQueous分析（Promega）测定前列腺PC-3细胞的生长速度；将每孔1500个细胞置于200μl 5%FBS培养基中，置于96个平板中，并在正常条件下生长。

安克雷奇独立生长测定。Rac1、Ras或Tiam1转化的NIH 3T3细胞和前列腺上皮RWPE和PC-3细胞（1.25×10^三每孔）在0.3%琼脂糖中生长，不存在或存在不同剂量的化合物23766(21).

细胞侵袭试验。如前所述，使用6.4-mm Biocoat Matrigel侵入室和8.0-μm孔径膜（Becton Dickinson）测量细胞侵入(22).

结果

Rac-特异性对接化合物的虚拟筛选。在Rac1–Tiam1复合体的3D结构中，Trp⁵⁶Rac1被埋在残留物形成的口袋里¹¹⁷⁸，序号1¹⁸⁴，谷氨酸¹¹⁸³和Ile¹¹⁹⁷Tiam1和Lys的⁵，瓦尔⁷、Thr⁵⁸和Ser⁷¹第1组(13). 根据Trp周围的结构特征识别Rac1特异性抑制剂⁵⁶，在Trp的6.5º范围内用Rac1残留物形成一个假定的抑制剂结合囊⁵⁶在Rac1-Tiam1单体中，包括Lys⁵，瓦尔⁷，色氨酸⁵⁶和Ser⁷¹进行了3D数据库搜索，以确定其构象适合此口袋的化合物。我们使用的数据库可以从国家癌症研究所免费获得(网址：www.dtp.nih.gov)，其中包括140000个以上小型化合物的坐标。为了在筛选过程中考虑化合物的灵活性，该计划统一，其定向调整算法允许构象灵活的3D搜索(23)，已应用。由统一接下来将程序对接到含有Trp的Rac1的预测结合口袋中⁵⁶通过使用程序柔性纤维，一个能量最小化建模软件，允许灵活对接到蛋白质结合位点(24). 按照对接程序，化合物根据其与程序结合的预测能力进行排序cscore公司.cscore公司根据蛋白质-配体复合体的单个评分功能的表现，生成相对一致的评分(25). 在一致性得分最高的100种化合物中，我们剔除了58种对接似乎不涉及Trp残基的化合物⁵⁶通过目视检查。考虑到其余化合物的溶解度和可用性，我们将重点放在一组15种化学品上，这些化学品通过评分法显示出良好的对接亲和力，以便进一步表征。

化合物23766体外特异性抑制Rac1-GEF相互作用。在复合物形成测定中，检测了通过虚拟筛选产生的15种化合物抑制Rac1与其GEF结合相互作用的能力。为此，TrioN专门激活Rac1而非Cdc42(16)和Intersectin，一个特定于Cdc42的全球环境基金(17)，用于在每种化合物的浓度为1mM的情况下测定与各自底物的结合活性。如所示图1一，TrioN容易与GST-Rac1共沉淀，但不与GST共沉淀。在测试的化合物中，NSC23766是唯一显著抑制TrioN与Rac1结合的化合物。NSC23766的抑制作用似乎对Rac1及其GEF之间的相互作用具有特异性，因为它不干扰Cdc42与Intersectin的结合。

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图1。

NSC23766作为Rac1–Trio相互作用抑制剂的鉴定。(A鞋面)通过虚拟筛选预测的一组化合物对Rac1与TrioN相互作用的抑制作用在复合物形成试验中进行了测试。（他的）₆-标记的TrioN（0.5μg）与GST单独或无核苷酸的GST-Rac1（2μg）在有或无1 mM国家癌症研究所化合物和10μl悬浮谷胱甘肽-甘露糖珠的情况下孵育。在4°C下孵育30分钟后，珠子相关（His）₆-TrioN被抗-His Western印迹检测到。(A下部)类似地确定了化合物对Cdc42与Intersectin结合的影响；≈1μg GST或GST标记的Intersectin与无核苷酸（His）孵育₆-在类似条件下标记Cdc42（0.25μg）。数据代表了四个独立实验的结果。(B类)NSC23766在Rac1表面的模拟对接模型。对接模型是用柔性纤维程序，并使用可视化观众录. (左侧)绑定到NSC23766的Rac1装订袋的俯视图。(赖特)Trp结合囊中NSC23766的预测结构接触⁵⁶. (C类)用与TrioN结合的Rac1L70A/S71A突变体检测NSC23766的抑制作用。

NSC23766的化学结构如图7所示，发布为支持信息在PNAS网站上。对对接模型的检验表明，NSC23766在Rac1上的结合位点是由Lys残基形成的表面裂缝⁵，天冬氨酸³⁸、Asn³⁹，色氨酸⁵⁶，天冬氨酸⁵⁷、Thr⁵⁸，亮氨酸⁷⁰和Ser⁷¹(图1B类)符合之前预测的开关I、开关II和β1/β2/β3区域之间的凹槽，这是GEF规范中涉及的关键区域。该区域大多数残基的突变损害了全球环境基金的结合和/或催化作用。如所示图1C类，Rac1L70A/S71A保留了与TrioN的结合，但失去了对NSC23766的抑制反应，这表明该化学品可能确实使用预测的Rac1对接囊来干扰GEF识别。

对NSC23766的进一步检查显示，它可以以剂量依赖的方式抑制Rac1–TrioN的相互作用，在GST下拉条件下，在≈50μM时达到50%的抑制作用(图2一和图8，发布为支持信息在PNAS网站上）。在下拉试验中增加GEF剂量可能会显著阻碍抑制作用（数据未显示），这与抑制剂作用的竞争性质一致。为了观察NSC23766对Rac–TrioN相互作用的抑制活性是否可以扩展到其他Rac特异性GEF，以及该化学物质是否专门干扰GEF相互作用，我们接下来测试了其对Rac1–Tiam1、RhoA–PDZ-RhoGEF、Rac1-BcrGAP和Rac1-PAK1相互作用的影响。如所示图2B类–D类与TrioN类似，该化合物抑制Tiam1与Rac1的结合，但对RhoA与GEF或PDZ-RhoGEF的结合或Rac1与BcrGAP或效应剂PAK1的结合没有检测到影响。这些结果表明，NSC23766能够专门干扰Rac1–GEF的相互作用。

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图2。

NSC23766对GEF与Rac1相互作用的剂量依赖性特异性抑制。(一)（他的）₆-标记的TrioN（0.5μg）与GST单独或无核苷酸、GST融合的Cdc42或Rac1（2μg）在含有不同浓度NSC23766和10μl悬浮谷胱甘肽-甘露糖的结合缓冲液中孵育。相关珠子（他的）₆-TrioN被抗-His Western印迹检测到。(B类)将Cos-7细胞裂解物中表达的myc-tagged Tiam1与（His）孵育₆-Rac1在NSC23766浓度增加的情况下。抗myc免疫沉淀后用抗-His印迹法检测Rac1与Tiam1的相关性。(C类)AU标记的PDZ-RhoGEF在Cos-7裂解物中表达，并在不同浓度的NSC23766存在下与GST或GST-RhoA孵育。用谷胱甘肽琼脂糖珠亲和沉淀后，用抗AU抗体检测RhoA-相关PDZ-RhoGEF。(D类)（他的）₆-在200μM NSC23766存在或不存在的情况下，用GST-BcrGAP或GST-PAK1（p21-binding domain）孵育负载了GDP或GTPγS的Rac1，并在谷胱甘肽琼脂糖珠亲和沉淀后通过抗His印迹检测与GST-BcrGAP或GST-PAK1。

为了确定NSC23766在特异性抑制GEF刺激的Rac1鸟嘌呤核苷酸交换反应中是否有效，分别在增加NSC23765剂量的情况下，在TrioN、Intersectin和PDZ-RhoGEF的催化下对Rac1、Cdc42和RhoA进行mant-GDP/GTP交换分析。如图9所示，发布为支持信息在PNAS网站上，该化学品能够以剂量依赖的方式阻断TrioN催化的Rac1核苷酸交换。50%的抑制剂量约为50μM，与结合相互作用的抑制效力一致(图2一). 相反，在200μM浓度下，该化合物对Cdc42的Intersectin刺激mant-GDP/GTP交换或对RhoA的PDZ-RhoGEF刺激mant-GP/GTP交换几乎没有影响（图9）。这些结果表明，NSC23766能够通过其GEF特异性抑制Rac1的激活在体外.

NSC23766对体内Rac1活性的特异性抑制作用。在成纤维细胞中，Rac1可以被多种刺激激活，包括血清和血小板衍生生长因子（PDGF）(26,27)，该激活预计由一个或多个Rac特异性GEF介导，如Tiam1。评估NSC23766是否会影响Rac活性体内用不同浓度的NSC23766处理生长于10%小牛血清中的NIH 3T3细胞过夜，并用效应域下拉法检测细胞内内源性Rac1的激活状态。如所示图3一，NSC23766强烈抑制血清诱导的Rac1激活，NSC237066的抑制作用似乎对Rho GTPases中的Rac具有特异性，因为Cdc42和RhoA在同一细胞中的激活状态不受高达100μM NSC23765的影响(图3一). 为了检测NSC23766是否可以通过PDGF刺激影响Rac1激活，用10 nM PDGF对存在或不存在50或100μM化合物的缺血清NIH 3T3细胞进行2分钟的激发，并对细胞裂解物进行活性Rac1-GTP量的测定。与不含NSC23766的Rac1活性相比，经该化合物处理的细胞在PDGF刺激下表现出Rac1-GTP的剂量依赖性降低。100μM NSC23766的存在导致细胞中Rac1-GTP的水平低于基础水平(图3B类). 因此，与在体外对Rac1的GEF反应的影响，NSC23766能够特异性抑制Rac1激活体内.

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图3。

NSC23766在特异性抑制细胞Rac1激活方面有效。(一)通过效应下拉分析检测有或没有NSC23766处理的NIH 3T3细胞中内源性Rac1、Cdc42和RhoA的激活状态。在有10%血清存在的情况下，在80%的汇合率下，用指示剂量的NSC23766处理100 mm培养皿中的NIH 3T3细胞12小时。将含有类似数量Rac1、Cdc42或RhoA的细胞裂解液与琼脂糖固定化GST-PAK1、GST-WASP或GST-Rhotekin孵育，并对共沉淀进行抗Rac1，Cdc42或RhoA Western blot分析以揭示GTP-结合Rho蛋白的数量。(B类)通过GST-PAK1下拉试验测定NSC23766对PDGF刺激的Rac1激活的抑制作用。用10 nM PDGF处理DMEM中血清饥饿的NIH 3T3细胞（含不同剂量的NSC23766）2分钟(C类)NSC23766抑制PDGF刺激的跛足足形成。在存在或不存在50μM NSC23766的情况下过夜血清饥饿后，瑞士3T3细胞用10nM PDGF处理指定的时间。细胞被固定并用罗丹明标记的卵磷脂染色。显示的结果代表了三个独立的实验。

PDGF激活Rac1并诱导成纤维细胞Rac-介导的膜皱褶和跛足(26). 为了评估NSC23766抑制Rac1介导的细胞功能的能力，我们接下来检查了PDGF刺激的细胞的肌动蛋白细胞骨架结构。如所示图3C类，10 nM PDGF在5分钟和10分钟的时间内有效刺激瑞士3T3细胞的膜皱褶和跛足形成。然而，在50μM NSC23766存在的情况下，PDGF在5分钟时仅在细胞边缘诱导跛足症方面有轻微的效果，而在10分钟时，当未经NSC23765处理的对照细胞显示出显著的跛足症结构时，PDGFs无效。基本上，所有处理过的细胞在10分钟时都对PDGF刺激失去反应，≈70%的细胞完全丧失跛足。这些结果进一步表明，NSC23766在抑制Rac介导的细胞事件方面是有效的。

NSC23766抑制血清或Rac GEF诱导的细胞生长和转化。Rac1活性对细胞生长调节很重要。显性阴性Rac1的过度表达会减缓细胞生长，而组成活性Rac1会增加成纤维细胞的生长速度(28). 由于NSC23766能够降低NIH 3T3细胞中Rac1的活性，我们接下来研究了其对野生型NIH 3T3细胞和表达组成活性Rac1突变体L61Rac1细胞的生长特性的影响。比较50μM NSC23766存在和不存在时细胞的生长速度表明，该化合物可以减缓野生型细胞的生长，而不会影响L61Rac1细胞的生长速率(图4一). 无论有无复合处理，GTP-结合的L61Racl水平保持不变，而相同细胞中的内源性Rac1活性被NSC23766显著降低(图4一). 这些结果表明，NSC23766对细胞生长的抑制作用是由于其抑制细胞Rac1活性的能力。

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图4。

NSC23766特异性抑制Rac GEF刺激的细胞生长和转化。(一)在存在（––）或不存在（-）100μM NSC23766的情况下，在5%血清中生长表达WT或L61Rac1的NIH 3T3细胞。细胞在6孔板中以5×10的密度分为三份⁴每个孔的细胞数。在用增加浓度的NSC23766处理12小时后，通过GST-PAK1下拉来探测表达L61Rac1的细胞的GTP结合的L61Rac1和内源性Rac1。(B类)表达WT或GEF（Tiam1或Lbc）的NIH 3T3细胞在有（––）或无（-）100μM NSC23766的5%血清中生长，细胞数量通过每日细胞计数确定。(C类)在存在或不存在100μM NSC23766的情况下，将表达Tiam1的稳定转染体NIH 3T3细胞培养在0.3%的软琼脂培养基中14天。在显微镜下检查菌落的数量和形态。(D类)在存在或不存在100μM NSC23766的软黄培养基中，检测稳定的V12-H-Ras表达NIH 3T3细胞的生长情况。在电镀后14天对菌落进行评分。

Dbl家族GEF能够直接激活其同源Rho GTPase底物，因此是细胞增殖的有力刺激物。NSC23766能够抑制Rac1特异性GEF Tiam1或TrioN诱导的细胞生长(图4B类以及未显示的数据），但不是由Rho特定的GEF Lbc、Cdc42特定的GEF-Intersectin或以独特机制作用于Rac的更混杂的GEF-Vav刺激的(图4B类和图10，发布为支持信息在PNAS网站上）。此外，50μM浓度的NSC23766显著抑制了Tiam1的病灶形成活性，但不抑制L61Rac1的病灶生成活性（图11，发布为支持信息并降低了Tiam1诱导的菌落数和软琼脂上菌落的大小(图4C类). 当应用于致癌Ras（V12H-Ras）转化的细胞时，NSC23766部分抑制集落形成活性(图4D类). 这些结果进一步表明，NSC23766可以作为一种特异性抑制试剂来逆转Rac活化带来的细胞增殖优势。

NSC23766逆转PC-3前列腺肿瘤细胞表型。Rac1活性的升高与癌细胞的过度增殖和侵袭性有关。接下来，我们测试了NSC23766对前列腺癌细胞系PC-3转化和侵袭活性的影响。PC-3细胞是来自前列腺癌患者骨转移的恶性前列腺腺癌细胞(29). 在这些细胞中检测不到PTEN抑癌基因的mRNA(30)由于磷脂酰肌醇（3,4,5）-三磷酸水平的显著增加，PTEN的丢失以前与Rac1过度激活有关(31). 事实上，当用GST-PAK1（p21-binding domain）探针检测PC-3细胞内源性Rac1的活性时，观察到GTP-binding Rac1水平显著高于正常前列腺上皮细胞RWPE-1或相对惰性的LNCaP细胞（参考文献。32和数据未显示）。通过表达PAK1的p21结合域或显性负Rac1突变抑制PC-3细胞的Rac1活性可显著抑制细胞生长（参考文献。32; 数据未显示）。因此，我们推断PC-3细胞的增殖优势和其他肿瘤特征可能是由细胞中过度活跃的Rac1介导的，而抑制Rac1活性可能会逆转PC-3细胞中的一些特征。如所示图5一和B类用NSC23766处理PC-3细胞，导致增殖和凤尾鱼非依赖性生长的剂量依赖性抑制。与未经处理的细胞相比，经过处理的细胞集落的大小似乎更小、更紧密。此外，在25μM时，NSC23766通过Matrigel抑制PC-3细胞侵袭85%(图5C类). PC-3和RWPE-1细胞在这些条件下都能存活。综上所述，这些结果表明，NSC23766通过干扰Rac活化，有效逆转PC-3肿瘤细胞的增殖、锚定非依赖性生长和侵袭表型。

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图5。

NSC23766抑制PC-3前列腺癌细胞的增殖、锚定非依赖性生长和侵袭。(一)PC-3细胞在添加了指定浓度NSC23766的5%小牛血清中生长。细胞以1.5×10的比例在96个孔中分为三份^三每个孔的细胞数。采用CellTiter 96 AQueous细胞增殖检测试剂盒检测不同天数的细胞数。(B类)PC-3和RWPE-1前列腺上皮细胞（1.25×10^三每孔）在0.3%琼脂糖中以不同剂量的NSC23766培养，并在培养12天后对软琼脂中形成的菌落数量进行量化。(C类)将PC-3细胞放置在37°C的侵入室中24小时，在没有或存在25μM NSC23766的情况下。

讨论

Rho家族GTPases是重要的细胞内信号蛋白，控制与癌症发展相关的多种细胞功能，包括肌动蛋白细胞骨架组织、转录调节、细胞周期进展、凋亡、小泡运输、细胞与细胞及细胞与细胞外基质粘附(1,4). 它们已成为肿瘤发生的潜在有用靶点(12). 特别是，几项证据表明，Rho家族成员Rac可能在肿瘤发生和癌症进展的几个方面发挥关键作用。首先，组成活性Rac1可以加速细胞生长并转化NIH 3T3细胞，而显性负Rac抑制细胞生长(28). 其次，Rac1被发现是Ras诱导转化的重要组成部分(三)Rac-specific GEF，Tiam1参与Ras介导的小鼠皮肤癌进展(33). 第三，PTEN、p19Arf或p53抑癌基因功能的丧失导致Rac活性升高，导致细胞迁移和增殖增加PTEN公司^-/-,p19Arf（第19页）^-/-，或第53页^-/-单元格(31,34,35). 第四，过度活跃的Rac1和Rac3与几个乳腺癌细胞系的增殖增加有关(8,10). 此外，在人类肿瘤中发现了Tiam1的点突变，该突变可转化NIH 3T3细胞(36). 然而，与Ras不同的是，在人类癌症中未发现Rac的组成活性突变。Rac的上调或过表达，而不是GTPase缺陷突变，可能与致瘤特性有关。因此，全球环境基金激活Rac1的信号步骤可能是涉及Rac的信号链的靶点。

在之前的工作中，我们已经证明了Trp⁵⁶Rac1的特异性是决定Rac1识别和响应Rac特异性GEF子集的关键结构决定因素(16). 源自Rac1序列的肽，包括Trp⁵⁶残基，能够阻断Rac和几个Rac特异性GEF之间的相互作用，而不影响效应物PAK1结合。我们推测含有Trp的区域中Rac1的结构特征⁵⁶可以探索设计抑制剂来专门干扰GEF对Rac1的激活。在本研究中，基于Rac1–Tiam1复合体提供的结构信息，并通过计算机模拟虚拟筛选方法，我们已将国家癌症研究所化学数据库中的小化合物NSC23766确定为Rac特异性抑制剂。我们发现，该化合物能够区分Rac1、Cdc42和RhoA，并通过其GEF特异性抑制Rac1的激活在体外和体内我们提供了将该化合物应用于人类癌症细胞系PC-3的示例，并表明其能够通过下调内源性Rac1活性来抑制Rac高活性前列腺癌细胞的增殖、锚定非依赖性生长和侵袭。

为了了解NSC23766对Rac1的抑制机制，我们检查了NSC23766-Rac1对接的模拟模型(图1B类). 在模型中，Rac1中NSC23766的结合位点是由残基Lys形成的表面裂缝⁵，瓦尔⁷，天冬氨酸³⁸、Asn³⁹，色氨酸⁵⁶，天冬氨酸⁵⁷、Thr⁵⁸，亮氨酸⁷⁰和Ser⁷¹NSC23766和Rac1之间相互作用所涉及的主要键本质上是疏水性的。NSC23766的氮原子与Rac1主链上的残基形成三个氢键，NSC237666的中间嘧啶环与Trp的吲哚环的堆积效应⁵⁶也可能对交互作用做出重大贡献。我们怀疑Trp之间的相互作用⁵⁶NSC23766的芳香环控制着23766的结合专一性，而NSC237666对Rac1对Cdc42的选择性可能是因为Trp的侧链⁵⁶Rac1为识别NSC23766提供了足够的键合，而Phe的较小侧链⁵⁶在Cdc42中未能与NSC23766建立相对高亲和力的相互作用。此外，Rac1中NSC23766的结合囊位于开关I、开关II和β1/β2/β3的三向结合部位，为Rac1–Tiam1晶体结构中的Tiam1识别提供了大部分结合面(13). NSC23766可能不仅干扰Rac1和Tiam1的β1/β2/β3之间的相互作用，而且抑制开关区域与Tiam1之间的相互影响。Rac1突变结果支持这种对接模型(图1C类)和我们的初步核磁共振¹⁵通过将NSC23766滴定到N中获得的N-异核序贯量子关联化学位移微扰数据¹⁵-标记为Rac1。因此，结合囊的战略性定位可能是NSC23766能够有效抑制Trio或Tiam-1激活Rac1的原因，而NSC23766-Rac1的特异性结合可能涉及Trp的整体构象⁵⁶及其邻近残留物。

作为第一代Rac抑制剂，NSC23766能够特异性干扰Rac1，但不会通过其各自的GEF激活Cdc42或RhoA，如在体外结合和交换分析（图。​（图22和9）和体内Rho GTPase效应域下拉分析(图3). 该化合物可进一步影响Rac的下游信号事件，如上游刺激PDGF诱导的膜皱褶和跛足形成(图3). 该化合物对Rac1活性和Rac-介导的细胞功能的影响似乎是可逆的，这与其作为Rac活化的竞争性抑制剂的作用一致，因为NSC23766处理的细胞的培养基改变可能会减弱Rac-抑制效应（Y.G.和Y.Z.，未发表的数据）。尽管我们不能排除NSC23766有额外目标的可能性体内、事实(我)它可以特异性阻断Rac1特异性Trio和Tiam1刺激的细胞生长，但不能阻断RhoA或Cdc42特异性Lbc和Intersectin引起的细胞生长，也不能阻断更混杂的Rho-GTPase GEF-Vav引起的细胞生长，后者利用一种独特的机制与Rac偶联(37,38)和(ii（ii）)它抑制血清刺激的细胞生长，但不抑制组成活性L61Rac1诱导的细胞生长。这强烈表明，NSC23766可能通过干扰Rac1激活而特异性地发挥作用，从而引发其对细胞的抑制作用。

我们在成纤维细胞中收集的NSC23766数据表明，它可能在肿瘤细胞中具有抑癌潜力。为了证明NSC23766可能有助于逆转肿瘤细胞表型，我们检测了前列腺癌PC-3细胞，这些细胞依赖于高活性Rac1活性的生长和侵袭特性(32)可能是因为这些细胞PTEN表达受损(30). 将NSC23766应用于PC-3细胞可显著抑制增殖、锚定非依赖性生长和侵袭，表明NSC23766干扰Rac激活是抑制肿瘤细胞的一种令人鼓舞的方法。这项初步研究的结果为在Rac信号被解除调控的其他肿瘤细胞类型中进一步测试这种化学物质打开了大门。除了对细胞生长和侵袭的影响外，我们注意到NSC23766能够导致细胞圆形和从基质上脱落（Y.G.和Y.Z.，未发表的数据），可能影响Rac1介导的细胞粘附(39). 我们还注意到PC-3细胞和成纤维细胞之间的剂量依赖性差异，这可能反映了细胞类型在吸收效率或对Rac1活性的依赖性方面的差异。为了确定每个细胞系统所需的最佳剂量，需要对该化合物在各种细胞类型中的功效进行更详细的检查。

为了进一步提高NSC23766对Rac1激活的抑制作用，我们必须尝试修改NSC237666的结构，以更好地拟合Rac1表面的凹槽，并增加对接亲和力。最近，通过正向双杂交筛选，发现了一种小分子化合物及其衍生物作为Ras–Raf相互作用的抑制剂(40). 这些化合物可以在≈20μM的浓度下逆转Ras在几种癌细胞系中诱导的转化表型。Rac作用于Ras的下游，并有助于Ras转化。NSC23766可以部分抑制致癌Ras诱导的细胞转化，这使其有可能与Ras–Raf相互作用抑制剂协同作用，有效逆转Ras介导的肿瘤发生，因为Rac1和Raf参与Ras介介的生长调节的不同方面(三).

补充材料

致谢

笔记

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：GEF，鸟嘌呤核苷酸交换因子；血小板衍生生长因子。

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