诱导突变型IDH表达细胞系的建立和鉴定A）演示通过突变IDH酶催化的反应将氘（红点）从NADPH转移到2HG的示意图。mtIDH1定位于细胞质，mtIDH2定位于线粒体。通过表达隔室特异性突变酶，并将其与氘化葡萄糖示踪剂结合，可以追踪2HG的生成，因此NADPH的来源是用来在细胞质或线粒体中生成2HG。B）突变体IDH1-R132H定位于胞浆（mtIDH1-C），突变体IDH2-R172K定位于H1299和A549细胞的线粒体（mtIDH2-M）。在多西环素诱导启动子的控制下，用包含编码C末端FLAG标记的IDH1-R132H或IDH2-R172K的cDNA的慢病毒构建物转导细胞。建立稳定的细胞系后，用0.1µg/mL多西环素处理细胞24小时。通过细胞分级和Western印迹，使用抗FLAG、细胞色素C（线粒体特异性标记）和Hsp70（细胞质特异性标记）的抗体分析蛋白质表达。C： 上清液-100级分（细胞质）；M： 线粒体。水平方向斑点之间的白线表示单独的凝胶。C）表达诱导型IDH突变体的细胞株以强力霉素依赖的方式产生2HG。用多西环素（0.1µg/mL）处理稳定表达可诱导mtIDH1-C或mtIDH2-M构建物的H1299和A549细胞24小时。显示2HG（总离子计数：TIC）的量相对于用载体处理的GFP对照细胞。D）在IDH1（R132C/+，HT1080）和IDH2（R172S/+，SW1353）内源性突变的细胞系中，通过2HG/αKG比率测量的2HG生成量远高于表达mtIDH1-C和mtIDH2-M的细胞。E）戊糖磷酸途径（6PGD）产生的NADPH是细胞溶质。细胞在[3-2H] -葡萄糖（10mM）24小时，然后添加强力霉素（0.1µg/mL）24小时以诱导突变IDH表达和M1标记量（%）-2H] -测量加入2HG和αKG的葡萄糖。F）NADH支持线粒体中NADPH的生成。用10mM[4培养细胞-2H] -葡萄糖24小时，并按照E进行处理和分析。数据表示至少三个生物复制品的平均值±SEM。
