世界胃肠病杂志。2006年5月14日；12(18): 2895–2900.
Beclin 1部分沉默加重阿霉素和Fas诱导的HepG2细胞凋亡
Fanny Daniel，Agnès Legrand，Dominique Pessayre，Véronique Descatoire，Dominike Bernuau，法国巴黎国立医学研究院，INSERM，U773，Centre de Recherche Bichat Beaujon CRB3，BP 416，F-75018；巴黎第七大学丹尼斯·迪德罗校址比查特，BP 416，F-75018，法国巴黎
Nathalie Vadrot，巴黎大学7号Denis Diderot，地点Bichat，BP 416，F-75018，法国巴黎
通信地址：Fanny Daniel，U773 INSERM（équipe 3），Facultéde Médecine Xavier Bichat，16 rue Henri Huchard，Paris 75018，France。rf.mresni.tahcib@leinadf电话：+33-1-44856211传真：+33-1-404856207
2005年8月2日收到；2005年8月28日修订；2005年10月9日接受。
版权©2006百色鼎出版集团有限公司。保留所有权利。 摘要
目的：研究Beclin 1在抗Fas抗体或阿霉素治疗后HepG2细胞凋亡易感性中的作用。
方法：利用RNA干扰实现Beclin 1沉默。流式细胞术检测DNA倍体、凋亡细胞百分率和线粒体膜电位。Beclin 1、Bcl-X水平L（左）用Western blots检测细胞色素c和聚ADP-核糖聚合酶（PARP）的裂解。
结果：Beclin 1 siRNA转染72 h后，Beclin l表达降低75%。Beclin 1部分沉默分别在阿霉素或抗Fas抗体治疗24小时和40小时后显著增加了亚G1细胞的百分比，而这种增强作用通过泛酶抑制剂治疗被消除。部分Beclin 1沉默还增加了PARP裂解、线粒体膜去极化和细胞溶质细胞色素c。部分Beclin-1沉默的促凋亡后果与Bcl-X的下降无关L（左）表达。
结论：Beclin 1部分沉默加剧了抗Fas抗体或阿霉素处理的HepG2细胞线粒体通透性和凋亡。
关键词：Beclin 1，凋亡，HepG2细胞，抗-Fas抗体，阿霉素
简介
Beclin 1是最近发现的一种位于人类染色体17q21上的肿瘤抑制基因，在40%-70%的散发性乳腺、卵巢和前列腺肿瘤中存在单等位基因缺失[1]. 杂合beclin 1+/-转基因小鼠自发性恶性肿瘤的发病率很高，包括肝细胞癌（HCC），尽管剩余的beclin 1等位基因在这些肿瘤中没有丢失、突变或沉默[2,三]. 这些数据已经得出结论，beclin 1是一种单倍体的肿瘤抑制因子。beclin 1单倍体不足促进癌症的一个机制是自噬受损和细胞增殖增加[4]. 然而，Beclin 1如何调节癌细胞的死亡尚不清楚。
一些研究报告了Beclin 1在自噬细胞死亡中的作用。当用足叶乙甙处理Bax/Bak双基因敲除小鼠的胚胎成纤维细胞时，细胞发生非凋亡性细胞死亡，其特征是存在大量自噬体/自溶体以及Beclin 1和APG5-APG12复合物的积聚[5]. 自噬抑制剂以及Beclin 1或APG5的沉默在很大程度上阻止了细胞死亡。在另一项研究中，用泛酶抑制剂治疗小鼠L929成纤维细胞或人U937单核细胞导致自噬细胞死亡[6]. Beclin 1或ATG7是形成自噬空泡所需的另一种蛋白质，沉默它们可以减少z-VAD-诱导的细胞死亡。Beclin 1与抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-X发生物理相互作用L（左）[7]但这种相互作用对细胞凋亡的功能意义尚不清楚。因此，尽管beclin 1-/-小鼠胚胎表现出广泛的细胞死亡并死亡子宫内，的在体外beclin 1的凋亡率-/-与野生型细胞相比，紫外线照射或取血清后的胚胎干细胞没有显著增加[三]. 相比之下，感染嗜神经性Sindbis病毒与全长人Beclin 1的重组嵌合物的小鼠，其存活率增加，脑细胞凋亡减少，脑病毒滴度降低，而感染编码缺乏Bcl-2结合域或提前终止密码子的Beclin-1蛋白嵌合物小鼠的存活率增加[7]. 然而，这些结果并没有提供关于Beclin 1的保护作用是抗凋亡作用、抗病毒作用还是这两种机制的结合的结果的信息。最后，最近的一项研究报告称，Beclin 1在MKN28人胃癌细胞中的过度表达刺激了顺式-在相同的实验条件下，二氨基二氯折叠蛋白（CDD）或阿霉素诱导细胞死亡，而Beclin 1 siRNA保护细胞免受凋亡[8].
我们之前观察到Beclin 1和Bcl-X之间存在显著相关性L（左）人类肝癌中mRNA的表达（未发表的结果），表明Beclin 1过表达可能阻止肝细胞凋亡。为了验证这一假设，我们研究了Beclin 1沉默对HepG2细胞对凋亡刺激反应的影响。在本研究中，我们发现部分Beclin 1沉默会加剧人肝癌细胞系中由激动性抗Fas抗体或阿霉素诱导的线粒体通透性和凋亡反应。
材料和方法
材料
HepG2细胞在补充有100mL/L胎牛血清和1%青霉素/硫酸链霉素（Gibco，Invitrogen）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中生长。
小干扰RNA（siRNA）双链体购自Dharmacon（Lafayette，CO）。我们使用了位于人类beclin编码区起始密码子下游的beclin 1 siRNA:5'-CAGUUACAGAUGGAGCUAAtt-3'（nt 655-673）和荧光素酶siRNA作为对照siRNA:5'-CUUACGCUGAGUACUCGAtt3'。HepG2细胞（15-25×106细胞）通过胰蛋白酶法收集。用不含抗生素的无血清OptiMEM（Gibco，Invitrogen）清洗颗粒，将细胞重新悬浮在含有12μmol/L siRNA的同一培养基的500-600μL中。在冰上10分钟后，细胞在230 V，960μF下电穿孔。将细胞重新悬浮在含有100 mL/L胎牛血清且不含抗生素的DMEM中，并将其置于60 mm的培养皿（约10 mm）中6每个培养皿的细胞数）。3小时后添加抗生素。
在第一个治疗方案中，在siRNA转染24小时后添加5μg/mL的激动性抗Fas抗体（7C11，Immunotech，Beckman Coulter，Miami，FL），添加或不添加10μmol/L苄氧羰基-戊基-丙基-天冬氨酸（o-甲基）-氟-甲基酮（z-VAD-fmk）（Alexis，Coger，Paris，France），40小时后检测到细胞凋亡，细胞色素评估除外c（c）释放，在24h检测到。
在第二个治疗方案中，在siRNA转染后48 h添加6μmol/L阿霉素（Sigma，Saint-Louis，MO），有或没有100μmol/Lz-VAD-fmk，24 h后检测到细胞凋亡，但在20 h检测到细胞色素c释放的评估除外。
核糖核酸酶保护试验（RPA）测定Beclin 1 mRNA的表达
用PBS将附着的HepG2细胞洗涤两次，并在5 mol/L硫氰酸胍和0.1 mol/L EDTA（pH 7.4）中溶解。在未提取RNA的情况下，对细胞裂解物进行RPA[9]. 以下DNA片段用于制备核糖探针：来自人类beclin 1的一个200-bp片段（nt 554-753，登录号AF139131）和来自人类S6的一个131-bp片段，用于使mRNA水平正常化。如前所述，进行RPA和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离受保护的mRNA片段[9]. 使用Instant Imager（法国Courtaboeuf的PerkinElmer）评估凝胶放射性，并计算研究mRNA与S6 mRNA的比值。
Beclin 1和Bcl-X的Western blot分析L（左）
将附着的HepG2细胞用PBS洗涤两次，在PBS中收获，并通过离心法造粒。称量颗粒并将其悬浮在2×Laemmli缓冲液中。蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离（Beclin 1为70 g/L聚丙烯酰胺，Bcl-X为120 g/LL（左）)并转移到硝化纤维素膜上。封闭后，用Yoshimori博士提供的抗Beclin 1抗体将膜孵育1小时[10]，或抗Bcl-X序号抗体（S-18）（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA），然后是辣根过氧化物酶缀合的抗兔IgG抗体（Immunotech，Beckman Coulter）。通过增强化学发光系统（Pierce，Rockford，IL）检测到特定条带。随后用单克隆抗β-肌动蛋白抗体（Sigma）对膜进行探测，并使用β-肌动蛋白信号使蛋白质负荷正常化。
聚ADP-核糖聚合酶（PARP）裂解
在培养基中收集附着和漂浮的HepG2细胞，并通过离心法造粒。根据Sadowski和Gilman的研究，提取了核蛋白[11]. 蛋白质测量（Biorad试剂，Pierce）后，核提取物按照上述方法进行SDS-7%聚丙烯酰胺凝胶电泳和印迹，并用单克隆抗人PARP抗体（克隆C2-10，BD Pharmingen，加利福尼亚州圣地亚哥）显示。
流式细胞术检测细胞DNA含量
将混合的、游离的和粘附的HepG2细胞离心，用PBS洗涤，并用700 mL/L冷乙醇固定。将颗粒重新悬浮在100μL RNAse A（180μg/mL）中，并在室温下培养30分钟。添加碘化丙啶（默克，达姆施塔特，德国；最终浓度，50μg/mL使用Epics Elite ESP coulter细胞仪（加利福尼亚州富勒顿Beckman coulter）通过流式细胞术进行定量。碘化丙锭在488 nm处激发，在630 nm处分析荧光。
流式细胞术评估线粒体膜电位
为了测定线粒体膜电位，我们使用DIOC6（3）（分子探针，Eugene，OR），一种亲脂阳离子染料，它积聚在极化线粒体中。收集游离和粘附的HepG2细胞，用PBS冲洗，并悬浮在培养基中。以100nmol/L的终浓度加入DIOC6（3），并在37°C的黑暗中培养细胞悬浮液30分钟。在流式细胞术前加入碘化丙啶（1.5µmol/L），以排除死细胞，并仅考虑活细胞中的荧光DIOC6（3）。流式细胞术检测DIOC6（3）荧光。DIOC6（3）在488 nm激发，在510 nm检测。
细胞色素c释放的测量
使用ApoAlert制备线粒体和细胞溶质提取物®细胞分离试剂盒（BD Biosciences Clontech，Mountain View，CA，USA）。在SDS-12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离同等水平的蛋白质，转移并用抗细胞色素进行免疫印迹c（c）试剂盒中提供的抗体。
统计分析
数据表示为平均值±标准偏差。未配对学生的t吨该试验用于评估转染对照siRNA或Beclin 1 siRNA的HepG2细胞之间的统计差异t吨该试验用于评估在对照siRNA或Beclin 1 siRNA转染HepG2细胞中进行治疗所产生的差异。
结果
Beclin 1部分沉默对Fas和阿霉素介导的细胞凋亡的影响
我们使用RNA干扰来部分沉默HepG2细胞中的Beclin 1基因。Beclin 1 siRNA转染后24、48和72小时，Beclin 1mRNA分别减少57%、61%和65%（图)Beclin 1蛋白分别减少了48%、54%和76%（图).
Beclin 1 siRNA或对照siRNA转染HepG2细胞后Beclin 1mRNA的表达。a：代表性RPA凝胶；B： Beclin1/S6 mRNA比率的量化。结果为4个实验的平均值±SE(一P（P）< 0.05与C） ●●●●。
用Beclin 1 siRNA或对照siRNA转染HepG2细胞后Beclin 2蛋白的表达；B： 将Beclin 1蛋白标准化为β-肌动蛋白的定量。数据为三个实验的平均值±SE(一P（P）< 0.05与C） ●●●●。
然后，我们测量了用阿霉素或激动性抗Fas抗体处理转染细胞后，DNA含量降低的细胞（subG1细胞）的百分比，这两种抗体都会触发HepG2细胞的凋亡细胞死亡[12,13]. 我们比较了转染对照siRNA（对照细胞）或Beclin 1 siRNA（Be-单元格）（图). 未经处理的Be中G1亚细胞的百分比没有显著增加-与未经处理的对照细胞相比（图). 然而，在暴露于抗Fas抗体或阿霉素后，Be中G1亚细胞的增加要高得多-单元格与控制单元格进行比较（图). 在对照细胞和Be中-细胞，泛酶抑制剂z-VAD-fmk在用抗Fas抗体或阿霉素治疗后显著降低了亚G1细胞（图).
用激动性抗Fas抗体或阿霉素治疗siRNA-转染的HepG2细胞后，G1以下细胞的百分比。A： 细胞周期的代表性流式细胞术分析；B： 亚G1峰的量化。结果是5到8个实验的平均值±SE(一P（P）与未处理细胞相比<0.05；c（c）P（P）<0.05 vs转染对照siRNA的细胞）；C： z-VAD-fmk的影响。该图显示了3到5次实验中G1亚细胞的平均减少百分比(e（电子）P（P）含和不含z-VAD-fmk培养的细胞之间<0.05）。
我们还通过评估PARP裂解来研究HepG2细胞的凋亡反应（图). 在未处理的对照细胞或未处理的Be中未检测到PARP的裂解p85片段-细胞。用抗Fas抗体处理后，在处理的对照细胞中仍然没有裂解的p85片段，但在处理的Be中存在-细胞。用阿霉素治疗后，Be中p85片段更丰富，而未分离的p116片段更少-单元格与控制单元格进行比较（图).
用激动性抗Fas抗体或阿霉素治疗siRNA-转染HepG2细胞后PARP裂解的Western blot分析。
由于Fas或阿霉素的凋亡作用被线粒体放大[14-16]，我们通过首先评估线粒体膜电位的变化来确定Beclin 1缺失是否会增加线粒体凋亡途径（图). 未经处理的Be中线粒体膜电位较低的活细胞百分比没有显著增加-细胞与未经处理的对照细胞进行比较。经抗Fas抗体或阿霉素治疗后，Be中线粒体膜电位低的活细胞百分比显著升高-细胞数高于对照细胞数（图). 我们接下来研究了Beclin 1沉默是否会增加线粒体细胞色素的释放c（c）经抗Fas抗体或阿霉素治疗后进入胞浆[14,16]. 我们首先通过评估COX4（数据未显示）检查细胞溶质部分未被线粒体污染。细胞溶胶细胞色素c（c）在对照细胞中通过抗Fas抗体或阿霉素治疗而增加，并且这种增加在Be中进一步增强-细胞与对照细胞进行比较，尤其是用抗Fas抗体治疗后（图).
siRNA转染和用激动性抗Fas抗体或阿霉素（Dox）治疗后HepG2活细胞线粒体膜电位的评估。在四到五个不同的实验中，线粒体膜电位低的细胞百分比（平均值±SE）在C细胞中为4.5±1.3%，在Be细胞中为7.7±2.9%，在Fas Ab处理的C细胞中是29.1±4.9%，在Ba细胞中是52.5±7.1%(P（P）< 0.05与处理过的C细胞），Dox处理的C细胞中23.6±3%，以及Dox处理过的Be细胞中38.8±3.8%(P（P）< 0.05与处理的C细胞）。
siRNA转染HepG2细胞并用激动性抗Fas抗体或阿霉素治疗后细胞色素c释放的评估。
为了测试这种效应是否可以通过Bcl-X的降低来介导L（左）我们在未经处理和处理的细胞中评估了该蛋白（图). Bcl-X公司L（左）与对照siRNA转染的细胞相比，转染Beclin 1 siRNA的细胞在转染24、48或72小时后没有显著减少（图). 抗Fas抗体治疗未引起进一步变化（图). 尽管阿霉素治疗倾向于降低Bcl-XL（左）在控制细胞中表达，在Be中表达更多-细胞，阿霉素介导的Bcl-X下降L（左）对照细胞和Be之间没有显著差异-细胞
Bcl-X的表达L（左）siRNA转染后的蛋白，并用激动性抗Fas抗体或阿霉素（Dox）治疗。A： Bcl-X的代表性Western blotL（左）β-肌动蛋白；B： Bcl-X的量化L（左）/β-肌动蛋白比率（5个实验的平均值±SE）；C： Bcl-X的代表性Western blotL（左）和β-肌动蛋白，在有或无Dox或抗Fas孵育后；D： Fas-Ab或Dox诱导的Bcl-X变化的量化L（左）表达（4至5个实验的平均值±SE）。
（图).
讨论
尽管beclin 1单倍体不足与几种人肝癌有关[1,4]，并增加各种肿瘤的发病率，包括转基因小鼠中的肝癌[2,三]，其在人类肝癌中的作用尚不清楚[17]，其在肝细胞凋亡中的潜在作用尚未被研究。本研究的目的是评估部分Beclin 1沉默对HepG2人肝癌细胞凋亡敏感性的影响。
在转染Beclin 1 siRNA（Be-与转染对照siRNA的细胞（对照细胞）相比，Beclin 1蛋白在24小时和72小时分别减少50%和75%。虽然Be的自发凋亡率-与对照细胞相比，细胞没有显著增加，他们对阿霉素或激动性抗Fas抗体的凋亡反应明显加重（图). 在处理过的铍中，G1亚细胞的百分比要高得多-细胞与经处理的对照细胞的比较（图)当用泛酶抑制剂z-VAD-fmk预处理细胞时，细胞显著下降（图). 此外，经处理的铍中PARP的裂解更广泛-与治疗后的对照细胞相比，尤其是阿霉素中毒后（图).
两个原因促使我们研究Beclin 1缺失对线粒体途径的潜在影响。首先，Beclin 1与Bcl-2或Bcl-X发生物理相互作用L（左）[7,8]，两种主要定位于线粒体膜的抗凋亡蛋白，可防止线粒体膜电位和细胞色素的丧失c（c）释放[18-20]. 其次，线粒体放大了Fas或阿霉素的凋亡作用，尤其是在肝细胞和肝癌细胞系中[14-16]. 抗Fas抗体或阿霉素治疗后线粒体膜电位耗散更严重，细胞色素c（c）Be的释放量更大-比控制单元中的单元（图和)表明Beclin 1缺失激活了线粒体凋亡途径。在之前的一项研究中，在感染嗜神经Sinbis病毒的小鼠中，全长人Beclin 1的过度表达与神经细胞凋亡减少有关，而缺失与Bcl-2或Bcl-X相互作用区域的Beclin-1构建物被删除L（左）没有保护性[7]. 上述观察结果可能表明Beclin 1与Bcl-2或Bcl-X的相互作用L（左）对Beclin 1的抗凋亡作用至关重要[7]. 自从几项研究报告Bcl-2在HepG2细胞中没有组成性表达以来[21-23]Bcl-2过表达不能保护这些细胞免受Fas或阿霉素治疗[22-24]，Bcl-XL（左）似乎是HepG2细胞系中的主要抗凋亡蛋白。在本研究中，部分Beclin 1沉默增加了细胞凋亡，但没有显著降低Bcl-XL（左）蛋白质（图)这表明需要正常的Beclin 1水平来保护HepG2细胞免受凋亡刺激，可能是通过维持Bcl-X的表达L（左）-Beclin 1复合物。Beclin 1和Bcl-X之间的相互作用如何L（左）或其他蛋白调节线粒体通透性和细胞凋亡尚待确定。
与我们的结果相反，Furuya等人[8]相反，观察到Beclin 1过表达加剧了CDD或阿霉素诱导的胃癌细胞凋亡，而Beclin-1沉默则有相反的作用[8]. 然而，Beclin 1沉默并不能保护另一个胃癌细胞系（Bcl-2和Bcl-X较低L（左）表达）对抗CDD介导的凋亡。因此，Beclin 1对不同细胞系的凋亡调节不同。尽管这些差异的原因尚不清楚，但Beclin 1的分子环境从一个癌细胞系到另一个癌基因系的变化可能涉及其中，包括Bcl-2和Bcl-X的不同表达L（左）[8]，以及Bcl-2家族的其他促凋亡蛋白与这些蛋白相互作用，但与Beclin 1不相互作用[7,8,24,25]
总之，我们的数据表明，部分Beclin 1沉默可增强肝癌HepG2细胞中Fas刺激或阿霉素治疗诱导的线粒体通透性和凋亡。正如Takehara等人[21]据报道，反义寡核苷酸下调Bcl-XL的表达会加剧staurosporine诱导的HepG2细胞凋亡或血清剥夺，Beclin 1和Bcl-X的使用L（左）反义寡核苷酸与化疗药物联合应用可有效诱导肝癌细胞凋亡。Beclin 1对不同细胞系凋亡的不同影响[三,7,8]表明Beclin 1与Bcl-2或Bcl-X不同L（左），可以是促凋亡的、抗凋亡的或无效的，具体取决于细胞环境。
致谢
作者感谢Tamotsu Yoshimori博士（日本冈崎国立基础生物学研究所）提供抗Beclin 1抗体。
脚注
S-编辑Wang J L-编辑Kumar M E-编辑Bi L
工具书类
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