TSC复合物的空间控制结合胰岛素和溶酶体mTORC1的营养调节

总结

引言

多细胞生物中的细胞以营养素和内分泌因子的形式同时感知细胞自主和系统生长信号。正确整合这些信号的能力是使单个细胞的生长与局部细胞生态位和整个生物体的需要相协调的关键。因此，在具有潜在遗传和环境影响的常见人类疾病中，包括癌症和糖尿病，检测和传递细胞生长状况的途径经常失调。

雷帕霉素（mTOR）复合物1（mTORC1）的机械靶点是一种高度保守的细胞生长调节因子，是所有细胞中存在的高度整合的信号节点之一(Dibble和Manning，2013年;拉普兰特和萨巴蒂尼，2012年). mTORC1由蛋白激酶mTOR组成，与其他两个重要核心成分Raptor和mLST8复合。激活后，mTORC1将细胞的代谢程序从分解代谢转变为促生长的合成代谢，刺激蛋白质、脂质和核苷酸的合成(豪厄尔等人，2013年). 由于mTORC1下游的细胞过程在所需的碳、氮、氧和ATP方面代价高昂，因此细胞进化出精细的机制，细胞内营养物质和能量的可用性通过这些机制影响mTORC2的激活状态也就不足为奇了(Dibble和Manning，2013年). 此外，mTORC1受多种分泌因子调节，包括生长因子、细胞因子和激素，如胰岛素和胰岛素样生长因子1（IGF1），它们传递系统代谢信号并刺激mTORCl上游的信号级联。通过这种方式，mTORC1对不同的局部和全身生长线索作出反应，以控制合成代谢和细胞、组织和生物体的生长。

在理解mTORC1如何感知这些不同信号方面取得的进展源于发现了两类与Ras相关的小G蛋白，即Rag和Rheb GTPases，它们直接位于mTORC2上游。Rag蛋白作为RagA或B亚基与RagC或D亚基复合的异二聚体发挥作用，是mTORC1感应氨基酸所必需的(Kim等人，2008年;Sancak等人，2008年). Rag异二聚体由一种称为Ragulator的蛋白质复合物固定在溶酶体表面(Sancak等人，2010年). 重要的是，氨基酸通过称为GATOR1的GTPase激活蛋白（GAP）复合物的联合作用影响RagA/B亚单位的GTP/GDP负载状态(Bar-Peled等人，2013年)以及Ragulator固有的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）活性(Bar-Peled等人，2012年). 在存在氨基酸的情况下，RagA/B亚单位转化为GTP结合形式，Ragulator-Rag复合物通过Rag异二聚体和Raptor之间的直接相互作用将mTORC1招募到溶酶体表面(Bar-Peled等人，2013年;Bar Peled等人，2012年;Kim等人，2008年;Sancak等人，2010年;Sancak等人，2008年;Zoncu等人，2011年). 这种通过氨基酸可用性对mTORC1定位的动态调节虽然是必要的，但不足以激活mTORC2，这也需要Rheb的存在(Sancak等人，2010年). Rheb被描述为定位于多个内膜小室，包括溶酶体，这被认为需要Rheb的C末端法尼基化(Buerger等人，2006年;克拉克等人，1997年;Saito等人，2005年;Sancak等人，2010年;Takahashi等人，2005年). Rheb的GTP/GDP负载状态由分泌生长因子而非氨基酸的存在控制，与GTP结合的Rheb是mTORC1的一种有效且必不可少的直接激活剂(Dibble和Manning，2013年).

Rheb由三种核心蛋白组成的复合体控制，称为TSC复合体，由结节性硬化复合体（TSC）肿瘤抑制因子TSC1和TSC2以及Tre2-Bub2-Cdc16-1结构域家族成员7（TBC1D7）组成(Dibble和Manning，2013年). 在TSC复合体中，TSC2充当Rheb的GAP，TSC1将TSC2和TBC1D7支架在一起，并稳定这些蛋白质。通过其Rheb-GAP活性，TSC复合物是mTORC1信号传导的重要抑制剂，复合物三种成分中任何一种的缺失都会导致生长因子依赖性激活mTORC1。重要的是，胰岛素和生长因子主要通过刺激涉及I类磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）及其下游效应物Akt的途径激活mTORC1，Akt是一种蛋白激酶，直接磷酸化TSC复合体内TSC2上的多个丝氨酸和苏氨酸残基(Inoki等人，2002年;Manning等人，2002年;波特等人，2002年). TSC2上所有五个定位磷酸化位点的Akt介导的磷酸化似乎是胰岛素最大限度激活mTORC1所必需的(Inoki等人，2002年;Zhang等人，2009年). 因此，胰岛素信号负性调节TSC复合物以促进Rheb依赖性mTORC1激活(图1A).

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图1

胰岛素信号刺激mTORC1而不影响TSC复合物的稳定性或Rheb-GAP活性的阻断

（A） 胰岛素通过Akt-TSC复合物-Rheb电路激活mTORC1的示意图。

（B） HeLa细胞被血清饥饿，然后用胰岛素刺激一段时间。

在用TSC2、TSC1和TBC1D7（C）或磷酸化TSC2-T1462和磷酸化TSC2-S939（D）抗体进行裂解和免疫沉淀之前，先对（C，D）HeLa细胞进行血清饥饿，然后用胰岛素刺激（15分钟）。

（E） 使用尺寸排除色谱法对（C）中处理的细胞的裂解液进行分级。根据标准曲线计算馏分的估计分子量（kDa）(图S1E).

（F） 用TSC1抗体免疫沉淀的内源性TSC复合物或IgG对照物，从（C）中处理的细胞裂解液中，使用预先加载GTP[α]的重组GST或GST-Rheb进行Rheb-GAP分析-³²P] ●●●●。通过薄层色谱（TLC）分离Rheb-bound GTP和GDP。转化为GDP的百分比（GDP/GTP+GDP）用图表表示为三个独立实验±SEM的平均值*与来自未刺激细胞的TSC1免疫沉淀相比，p<0.02。

请参见图S1中的支持数据.

尽管TSC复合物和Rheb是生长因子调节mTORC1激活状态的主要信号成分(图1A)，该法规的机械基础仍不明确。人们普遍认为，Akt磷酸化TSC2会关闭其Rheb GAP活性，但这一点从未得到证实。一些研究和模型表明，胰岛素信号通过引起复合物的分解来抑制TSC复合物(Cai等人，2006年;Inoki等人，2002年;波特等人，2002年)，而这在其他研究中尚未观察到(董和潘，2004年;Manning等人，2002年). 其他研究表明，Akt介导的TSC2磷酸化导致其降解(Dan等人，2002年;Plas和Thompson，2003年). 最后，TSC复合物-Rheb电路是如何在空间上与Ragulator-Rag复合物对氨基酸的反应中向溶酶体募集mTORC1结合的尚不清楚。在这里，通过内源性蛋白质的定位，我们证明TSC复合物在没有生长因子的情况下定位于溶酶体，并在胰岛素的作用下与该位置剧烈分离。TSC复合物的溶酶体定位需要法尼基化大黄，TSC复合体从溶酶体表面的胰岛素刺激释放需要Akt介导的TSC2磷酸化。我们的数据表明，TSC复合体的这种空间调控独立于mTORC1的空间控制，并提供了一种统一的机制，通过该机制，mTORC2在溶酶体处整合不同的生长信号。

结果

胰岛素通过诱导TSC复合物从溶酶体中分离而激活mTORC1

为了确定胰岛素信号是否可能改变TSC复合体的空间分布，我们定位了内源性TSC2，并使用了一种先前已验证的免疫荧光抗体(Dible等人，2012年). 在缺乏血清的基础条件下，TSC2的主要定位在溶酶体表面，与溶酶体标记LAMP2共定位(图2A). TSC2的其余部分在整个细胞质中广泛定位于点状结构，显示出与高尔基体的一些小重叠(图S2A)线粒体标记没有明显的共定位(图S2B)或过氧化物酶体(图S2C、D). 令人惊讶的是，在血清饥饿条件下观察到的广泛TSC2-LAMP2共定位在胰岛素的作用下急剧显著降低(图2A图，图S2E免疫印迹，以及图2B高分辨率共焦成像）。

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图2

胰岛素严重干扰TSC复合物的溶酶体定位

（A） 在免疫荧光标记内源性TSC2（红色）和LAMP2（绿色）之前，先使HeLa细胞无血清，然后用胰岛素刺激一段时间。显示代表性单元格，其中黄色或橙色像素表示合并图像中的同位化。同位化百分比和皮尔逊相关系数（PCC）用平均值±SEM（右）表示*p<1X10⁻⁶（共定位%）和*p<1X10⁻¹²（PCC），与未刺激（0分钟）相比。

（B） 细胞如（A）中所述进行处理和标记，但用单次15分钟胰岛素刺激，并通过共聚焦显微镜成像。下图显示了两幅图像中底部单元格中包含LAMP2的隔间的放大视图。共定位百分比和PCC如（A）所示*p<1X10⁻¹³（共定位%）和*p<1X10⁻¹⁰（PCC）与未刺激（0分钟）相比。

（C） 将稳定表达对照shRNA（shGFP）或靶向TBC1D7（shTBC1D6）的HeLa细胞作为（B）处理，并标记TBC1D8（红色）和LAMP1（绿色）。图中显示了具有代表性的细胞，共定位百分比如（A）所示*p<1X10⁻¹⁰.

（D） 按（B）处理的细胞被标记为TSC2（红色）和TBC1D7（绿色），共定位百分比如（A）所示。

（E） 按（B）处理的细胞和裂解物被分离成重膜和轻膜/细胞溶质部分。

请参见图S2中的支持数据.

与Akt-TSC复合物-mTORC1途径对胰岛素的剂量反应一致(图S1A)，胰岛素剂量的增加刺激了TSC2从LAMP2室的更多解离(图S2F). 此外，TSC2-LAMP2共定位平均值的标准误差随着胰岛素剂量的增加而减小，表明该反应的随机性。因此，在免疫印迹上检测到的胰岛素信号的剂量依赖性是由于单个细胞内更强的反应和更多的细胞同时随着胰岛素剂量的增加而反应。在MEF中胰岛素刺激后，观察到TSC2-LAMP1共定位的类似减少(图S2G). 我们还注意到，胰岛素刺激导致溶酶体在HeLa细胞和MEF中的细胞分布更加分散，这是之前描述的效果(Korolchuk等人，2011年). 为了确定TSC2在溶酶体定位中的丢失是否仅次于对溶酶体聚集的影响，我们使用诺可唑通过破坏微管细胞骨架来物理分散溶酶体(图S2H，I). 与胰岛素刺激不同，TSC2-LAMP2共定位不受诺卡唑诱导的溶酶体分散的影响。为了确定是否是整个TSC复合体以这种方式进行空间调控，我们验证了（通过shRNA敲除）一种TBC1D7抗体的免疫荧光，并发现在血清饥饿条件下，内源性TBC1D6的大量亚群也与LAMP1共定位(图2C). 与TSC2一样，胰岛素刺激可显著降低TBC1D7的溶酶体定位。然而，胰岛素并不影响TBC1D7与TSC2的共定位(图2D)这与他们与TSC1的相互作用所介导的联系是一致的(Dible等人，2012年)，不受胰岛素影响(图1C-E和S1B–E级). 最后，在胰岛素刺激15分钟的细胞裂解液中，含有溶酶体的重膜组分中TSC1和TSC2水平均降低，同时含有细胞溶质和轻膜室的组分也相应增加(图2E)进一步表明，是完整的TSC复合体在胰岛素作用下从溶酶体表面剧烈解离。

结合证明溶酶体定位对mTORC1激活的重要性的研究，上述发现表明，胰岛素刺激TSC复合物从溶酶体中分离可能代表胰岛素信号激活mTORC2的机制。为了进一步验证这个想法，我们通过与p18/LAMTOR1（Lyso-TSC2；图3A)通过肉豆蔻酰化和棕榈酰化部分将Ragulator复合物定位于溶酶体(Nada等人，2009年;Sancak等人，2010年). Lyso-TSC2在组装成TSC复合体的能力上与野生型TSC2没有区别(图S3A). 该融合蛋白的组成溶酶体定位在Tsc2型^−/−MEF，胰岛素诱导从溶酶体释放外源性表达的野生型TSC2，但不释放Lyso-TSC2(图3B). 重要的是，与野生型TSC2表达细胞不同，尽管野生型和Lyso-TSC2的磷酸化相似，胰岛素未能刺激Lyso-TSC表达细胞中共同表达的S6K1上T389的磷酸化(图3C). Lyso-TSC2的外源性表达，而非野生型TSC2，也减弱了在全血清培养的293E细胞中内源性和共表达S6K1的mTORC1信号(图S3B-D)并抑制S6K1的胰岛素刺激磷酸化(图3D). 因此，生长因子诱导TSC复合物从溶酶体表面分离的能力是正确刺激mTORC1信号的必要条件。

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图3

TSC2对溶酶体的强制靶向抑制胰岛素刺激的mTORC1信号

（A） 标记了FLAG的WT-TSC2和Lyso-TSC2的示意图，这是TSC2与溶酶体靶向信号p18/LAMTOR1的融合。

（B）Tsc2型^−/−MEF被编码WT-TSC2或Lyso-TSC2的慢病毒感染，并在血清中饥饿，然后胰岛素刺激（15分钟）。代表性TSC2表达细胞显示为TSC2（红色）和LAMP1（绿色）。共定位百分比用平均值±SEM（如下）表示*p<1X10⁻¹²与未模拟的WT-TSC2相比。

（C） WT-TSC2或Lyso-TSC2与HA-S6K1共转染Tsc2型^−/−MEF，然后是血清饥饿和胰岛素刺激（100 nM，15分钟）。在抗HA免疫沉淀物中检测到HA-S6K1报告子的磷酸化，磷酸化的S6K1与总S6K1的相对比率显示为标准化的未刺激WT-TSC2细胞。

（D） 293E细胞与空载体（vec）、WT-TSC2或Lyso-TSC2和HA-S6K1共同转染，并按（C）中的方法进行处理和分析，相对磷酸化S6K1水平归一化为未刺激的载体细胞。

请参见图S3中的支持数据.

胰岛素和氨基酸独立调节TSC复合物和mTORC1在溶酶体和Rheb中的定位

单独的氨基酸和胰岛素都不足以强烈刺激mTORC1(Hara等人，1998年) (图4A). 为了理解这些信号与mTORC1和TSC复合物对溶酶体表面的空间调节之间的关系，我们比较了急性胰岛素或氨基酸刺激的平行效应。如前所述(Sancak等人，2010年;Zoncu等人，2011年)，溶酶体处的mTOR群体代表mTORC1，因为mTOR-LAMP2共定位在猛禽被击倒时丢失（数据未显示）。与TSC2不同，mTOR与LAMP2的共定位不受胰岛素刺激的影响(图4B和S4A系列). 胰岛素刺激的TSC2从LAMP2室的释放与(图4B和S4A系列)或缺席(图4C)氨基酸。正如预期的那样，mTOR在两种缺失情况下用氨基酸重新喂养细胞后10分钟内转移到溶酶体(图4D)或存在(图4E)血清。相反，在这些条件下，TSC2的溶酶体定位不受氨基酸饥饿和急性再喂养的影响(图4D，E). 因此，来自氨基酸和胰岛素的急性信号独立且相互调节mTORC1和TSC复合物与溶酶体的结合。

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图4

氨基酸和胰岛素对mTORC1和TSC复合物在溶酶体中定位的相互作用

（A） HeLa细胞在没有（ss）或有透析血清（dFBS）的情况下生长，然后在用胰岛素（15分钟）、氨基酸（10分钟）或胰岛素（15 min）加氨基酸刺激（最后10分钟）之前，饥饿所有氨基酸（50分钟）。磷-S6K1显示了明暗曝光。

（B） 在用LAMP2对TSC2或mTOR进行免疫荧光联合标记之前（图图S4A). 共定域百分比用平均值±SEM表示*p<1X10⁻¹¹.

（C） 在TSC2（红色）和LAMP2（绿色）共标记和共定位量化之前，用胰岛素刺激缺乏血清（16小时）和氨基酸（50分钟）的细胞（15分钟），如（B）所示（右图）*p<1X10⁻¹¹.

（D） 在标记和量化共定位之前，用氨基酸（10分钟）刺激缺乏血清（16小时）和氨基酸（50分钟）的细胞，如（B）*p<1X10所示⁻⁸.

（E） 如（B）所示，在标记和定量共定位之前，用氨基酸刺激在10%dFBS中生长并缺乏氨基酸的HeLa细胞（16小时）（50分钟）*p<1X10⁻⁸请参见图S4中的支持数据.

由于TSC复合物通过Rheb调节mTORC1，我们试图表征内源性Rheb的亚细胞定位。鉴定出一种Rheb抗体，其免疫染色模式在siRNA介导的Rheb1和Rheb2/RhebL1的敲除后被消除(图5A). 在血清饥饿条件下，内源性Rheb在整个细胞中被检测为点状标记，在与LAMP1共定位的核周区域有集中标记，表明与mTOR和TSC2一样，内源性Reheb的一个子集定位于溶酶体。Rheb的溶酶体定位需要通过其C末端法尼基进行膜锚定，因为法尼基转移酶抑制剂（FTI）破坏了Rheb-LAMP1的共定位(图5A). FTI处理对Rheb法尼基化的影响通过SDS-PAGE中Rheb迁移率的降低而明显，这表明几乎所有细胞内的Rheb都是法尼基的，并且在FTI处理后约90%的Rheb~90变成非己基化的(图5A，螺栓）。

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图5

Rheb的一个亚群定位于溶酶体，其与TSC复合物和mTORC1的共定位分别受胰岛素和氨基酸的调节

（A） 在联合标记Rheb1（红色）和LAMP1（绿色）之前，带有或不带有FTI-277（10μM）的siRNA-介导的Rheb1-2或对照siRNAs敲低的HeLa细胞在血清中饥饿（16小时）。图中显示了具有代表性的细胞，以及平行裂解物的免疫印迹（右），显示了对Rheb水平和修饰（法尼基化（F）和非甲酰基化（UF））的影响，并以平均值±SEM表示共定位百分比*p<1X10⁻⁷.

（B） 在共同标记Rheb1和LAMP1之前，用氨基酸（10分钟）刺激缺乏血清（16小时）和氨基酸（50分钟）的HeLa细胞（图图S5A). 共定位百分比如（A）所示。

（C） 如（B）所示，在联合标记之前，先用血清饥饿细胞，然后用胰岛素刺激（15分钟）图S5B). 共定位百分比如（A）所示。

（D） 在联合标记mTOR或TSC2（红色）和Rheb1（绿色）之前，按照（B）中的方法处理细胞。图中显示了具有代表性的单元格，共定位百分比如（A）所示*p<1X10⁻⁹.

（E） 在（D）中所述的标记和分析之前，按照（C）中的方法处理细胞*p<1X10⁻⁹。请参阅图S5中的支持数据.

为了确定Rheb的溶酶体定位，如mTORC1和TSC复合物的定位，是否受到动态调节，我们检查了氨基酸和胰岛素刺激的影响。氨基酸饥饿和再喂养(图5B和第5页)急性胰岛素刺激后停用nor生长因子(图5C和5亿在HeLa和图S5C在MEF中）影响了Rheb和LAMP1的共定位。因此，大黄的溶酶体定位是稳定的，不受改变mTORC1激活状态的细胞生长条件的影响。与上述mTORC1和溶酶体TSC复合物的独立空间调节一致，急性氨基酸刺激显著增加了mTOR-Heb的共定位，但未影响TSC2-Rheb的共定域(图5D)而急性胰岛素刺激对mTOR-Heb共定位无影响，但显著降低TSC2-Rheb共定位(图5E和S5D系列共焦图像）。这些结果表明，来自氨基酸和胰岛素的融合信号对Rheb下游效应器mTORC1和Rheb上游调节器TSC复合体从Rheb亚群所在的溶酶体表面的结合和释放有不同的影响。

Rheb是TSC复合物定位到溶酶体所必需的，而不是mTORC1

由于Rheb是溶酶体中已知与TSC2相互作用的唯一蛋白质，我们确定它是否参与TSC复合物的溶酶体定位。在siRNA-介导的Rheb敲除后，Akt的胰岛素刺激激活及其TSC2的磷酸化未受影响，但观察到mTORC1信号的预期减少(图6A). 有趣的是，Rheb基因敲除后，TSC2的核周聚集及其与血清饥饿细胞典型的LAMP2的明显共定位被破坏，导致TSC2定位类似胰岛素刺激状态(图6B). 这种效应是TSC复合物特有的，因为mTOR-LAMP2共定位不受Rheb缺失的影响(图6C和S6A系列). FTI处理使Rheb从溶酶体膜上分离，也降低了TSC2-LAMP2共定位，而不影响Akt活化或TSC2磷酸化(图6D和6E). 与溶酶体表面TSC复合物和Rheb之间的主要相互作用一致，FTI处理也大大降低了TSC2-Rheb的共定位(图6F和S6B系列). mTORC1与溶酶体的结合不受FTI治疗的影响(图6G和S6C系列)尽管溶酶体中Rheb的丢失反映在mTOR-Rheb共定位的减少(图6H和S6D系列). 因此，TSC复合物在提取生长因子条件下与溶酶体结合的能力取决于Rheb及其适当的膜锚定，而mTORC1的溶酶体定位与Rheb无关。

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图6

TSC复合物而非mTORC1在溶酶体中的定位依赖于法尼基化大黄

（A） 对siRNA-介导Rheb1和2或对照siRNAs（siC）敲低的HeLa细胞进行血清饥饿处理，然后用胰岛素刺激（100 nM，15分钟）。注：siC和siRheb1/2样品来自相同的印迹和暴露。

（B） 按（A）处理的细胞共同标记TSC2（红色）和LAMP2（绿色）。显示代表性细胞，并将共定位百分比绘制为平均值±SEM（右）*p<1X10⁻¹²用于与未刺激的siC细胞进行比较。

（C） 如（A）中所处理的细胞被mTOR和LAMP2共同标记（图图S6A)并如（B）所示进行量化。

（D） 将血清饥饿的HeLa细胞（16小时）（含或不含FTI-277（FTI；10μM））置于未刺激状态或用胰岛素刺激（15分钟）。

（E） 在标记和量化共定位之前，按照（D）中的方法处理细胞，如（B）中所示（右图）*p<1X10⁻¹⁰用于与未经处理的血清饥饿的细胞进行比较。

（F） 在（D）中处理的细胞被联合标记为TSC2和Rheb1（图S6B). Colocalization量化如（B）所示*p<1X10⁻⁹与未经处理的细胞进行比较。

（G） 将（D）中处理的细胞联合标记为mTOR和LAMP2（图S6C). Colocalization量化如（B）所示。

（H） 将（D）中处理的细胞联合标记为mTOR和Rheb1（图S6D). Colocalization量化如（B）所示*p<1X10⁻⁸与未经处理的细胞进行比较。

（一） 与对照组相比，用GST或GST-Rab5A预加载无核苷酸、GTPγS或GDPβS的重组纯化GST-Rheb从血清饥饿的HeLa细胞裂解液中提取内源性TSC复合物成分。用Ponceau S染色检测GST融合诱饵蛋白。

（J） 如（I）所示进行GST-Rheb下拉，但用胰岛素刺激细胞（15分钟）。请参见图S6中的支持数据.

为了进一步表征Rheb与TSC复合物之间相互作用的分子性质，我们确定了Rheb的核苷酸结合状态如何影响这种相互作用。有趣的是，我们发现内源性TSC复合物与GDP负载的Rheb结合最为强烈(图6I)是Ras-family GAP中不常见的财产（见讨论）。此绑定依赖于TSC2(图S6E)对胰岛素刺激敏感，这削弱了内源性TSC复合物结合GDP和GTP结合Rheb的能力(图6J). 这些数据表明，与Rheb的调节相互作用有助于TSC复合体的空间控制。

PI3K-Akt途径通过TSC2磷酸化诱导TSC复合物从溶酶体中分离

作为对胰岛素的反应，Akt直接磷酸化TSC2的方式与TSC复合物从溶酶体中分离的方式相同（参见图1B,​、2A、，2安培,S2E和S2G)表明这种修饰参与了复合体的空间调控。用PI3K抑制剂沃特曼或Akts特异性抑制剂MK2206对细胞进行短暂预处理，完全阻断HeLa细胞和MEF中胰岛素刺激的Akt活化、TSC2磷酸化和mTORC1信号(图7A和S7A系列). 重要的是，胰岛素刺激的mTORC1信号的丢失与胰岛素不能诱导TSC2从这些细胞中的溶酶体分离相一致(图7B和S7B系列). 同样，胰岛素诱导的TSC1和TSC2从重膜部分到含有胞质溶胶和轻膜的部分的运动被Akt抑制所阻断(图7C). 在胰岛素刺激下，TSC复合物与重组Rheb-GDP的弱关联性也通过Akt的抑制而减弱(图S7C).

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图7

Akt介导的TSC2磷酸化导致TSC复合物从溶酶体中解离，以响应胰岛素或PTEN损失

（A） 用载体（DMSO）、沃特曼（100 nM）或MK2206（2μM）预处理血清饥饿的HeLa细胞（30分钟），然后用胰岛素刺激（15分钟）。

（B） 按（A）处理的细胞共同标记TSC2（红色）和LAMP2（绿色）。显示了具有代表性的细胞，并以平均值±SEM的形式绘制了共定位百分比*p<1X10⁻⁸用于与载体处理的细胞中的胰岛素刺激进行比较。

（C） 细胞按（A）处理，裂解物分离为重膜和轻膜/细胞溶质部分。

（D）Tsc2型^−/−表达空载体（V）、野生型TSC2（WT）或TSC2（5A）的Akt-磷酸化位点突变的MEF被血清饥饿并用胰岛素刺激（15分钟）。

（E）Tsc2型^−/−在对重组TSC2（红色）和内源性LAMP1（绿色）进行联合标记之前，将MEF作为（D）处理。Colocalization量化如（B）所示*p<1X10⁻⁸与胰岛素刺激的TSC2-WT表达细胞进行比较。

（F）Tsc2型^−/−用野生型TSC2（WT）或突变体TSC2（5A）重组的MEF在低渗缓冲液中溶解前按（D）处理，化学交联，然后用蛋白A/G琼脂糖单独（C）或TSC2抗体进行免疫沉淀。

（G） 用载体（DMSO）或MK2206（2μM）处理血清饥饿（16小时）的PC3细胞（30分钟）。

（H） 在TSC2（红色）和LAMP2（绿色）联合标记之前，PC3细胞按（G）中的方法处理。Colocalization量化如（B）所示*p<1X10⁻¹⁰.

（一） 溶酶体mTORC1和TSC复合物的空间调控模型。详见正文。请参见图S7中的支持数据.

以前的野生型研究(Inoki等人，2002年)或Tsc2型空(Zhang等人，2009年)细胞已经表明，TSC2上所有五个Akt靶向残基的磷酸化对于胰岛素反应中mTORC1信号的完全激活是必需的。为了测试这些磷酸化事件在TSC复合物空间调控中的作用，我们重组了Tsc2型零MEF，野生型TSC2（TSC2-WT）或TSC2缺乏这5个磷酸受体位点（TSC2-5A）。在表达TSC2-WT的细胞中，生长因子依赖性mTORC1信号的激活被阻断，其对胰岛素的敏感性被恢复(图7D). 在表达TSC2-5A的细胞中，mTORC1的组成性激活也被类似地阻断，但尽管适当激活Akt并向其他Akt靶点（如PRAS40）发送信号，mTORC 1信号对胰岛素无反应。与在缺乏生长因子的情况下适当抑制mTORC1信号一致，在血清饥饿条件下发现TSC2-WT和TSC2-5A与溶酶体相关的百分比相似(图7E). 与野生型MEF中的内源性TSC2一样(图S2G)，TSC2-WT的溶酶体定位被胰岛素刺激破坏。

然而，经胰岛素刺激后，TSC2-5A与溶酶体的关联保持不变(图7E). 为了进一步研究Akt位点对TSC2从溶酶体表面分离TSC复合物的影响，我们从重组的TSC2相关复合物中进行免疫纯化Tsc2型^−/−在交联剂存在下溶解的细胞。与我们的免疫荧光结果一致，胰岛素刺激从含有LAMP1的隔间释放TSC2-WT，而不是TSC2-5A(图7F). 值得注意的是，在标准裂解条件下，我们没有检测到TSC复合物与LAMP1或2的关联，这表明缺乏与这些溶酶体膜蛋白的直接相互作用。这些数据表明，胰岛素诱导TSC复合物从溶酶体中分离，随后Rheb依赖性激活mTORC1需要Akt磷酸化TSC2，从而通过PI3K-Akt途径提供TSC复合抑制机制。

PI3K-Akt通路在人类癌症中经常被激活，这通常通过PTEN抑癌基因的缺失而发生。PTEN缺乏的前列腺癌细胞（PC3，图7G)和中小微企业(图S7D)显示出Akt的生长因子非依赖性激活、TSC2的磷酸化和mTORC1的激活，这些信号传导事件被Akt抑制完全阻断。重要的是，即使在血清饥饿条件下，这些细胞也表现出TSC2从溶酶体中分离出来，Akt抑制导致TSC2快速易位到溶酶体，这表明了这种调控的可逆性(图7H和第7页). 因此，除了生理刺激外，导致癌症中PI3K-Akt通路的生长因子非依赖性激活的常见病理突变通过TSC复合物从溶酶体表面解离来诱导mTORC1信号传导。

讨论

氨基酸和生长因子的信号对于mTORC1的完全激活都是必要的，但还不够(Dibble和Manning，2013年;Hara等人，1998年;拉普兰特和萨巴蒂尼，2012年). 我们的研究结果表明，这些输入对mTORC1的整合共同调节具有统一的模型(图7I). 已经证实，通过Ragulator和Rag蛋白的氨基酸信号可以将mTORC1定位于溶酶体，而不直接刺激其活化(Kim等人，2008年;Sancak等人，2010年;Sancak等人，2008年). mTORC1定位于溶酶体使其与其必需的激活物Rheb接近(Sancak等人，2010年)以GTP结合形式可直接刺激mTORC1激酶活性(Sancak等人，2007年). 先前的研究已经将外源表达的Rheb融合蛋白定位于内膜隔室，包括内质网、高尔基体和溶酶体(Buerger等人，2006年;克拉克等人，1997年;Saito等人，2005年;Sancak等人，2010年;Takahashi等人，2005年). 我们发现，内源性Rheb的一个亚群确实通过其法尼基脂质修饰定位于与mTORC1相同的含有LAMP1/2的隔室，并且这种定位不受氨基酸或胰岛素的影响。目前唯一建立的Rheb直接调节因子是TSC复合物，我们发现该复合物在缺乏生长因子的情况下定位于溶酶体，至少部分是通过与Rheb的结合。与之前使用TSC2的孤立GAP域的研究相比(卡斯特罗等人，2003年;Long等人，2005年)，我们发现完整TSC复合体内的内源性TSC2对Rheb-GDP具有强烈的结合偏好，这是GAP蛋白的一种非典型特性，GAP蛋白通常优先结合其小G蛋白靶点的GTP结合或过渡状态(Bos等人，2007年;Chen等人，2011年;Daumke等人，2004年). 我们的数据与一个模型一致，在生长因子提取条件下，TSC复合体刺激溶酶体表面Rheb固有的GTPase活性，并通过转化为Rheb-GDP创造了一个强大的结合伙伴，将复合体保持在这个位置。在这种状态下，TSC复合物是否也充当鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂（或GDI），从而阻止Rheb上的核苷酸交换，将在未来的研究中探索。这样的模型也将有助于解释TSC复合物在溶酶体的快速积累以及我们在抑制PI3K-Akt途径时观察到的mTORC1信号传导的抑制。我们发现，胰岛素在溶酶体表面强烈刺激TSC复合物与Rheb的分离，这需要Akt直接磷酸化TSC2。这种从溶酶体Rheb诱导释放的TSC复合物允许Rheb GTP负载，并且是胰岛素适当激活mTORC1所必需的。

与之前建议的模型相比(Cai等人，2006年;Dan等人，2002年;Inoki等人，2002年;Plas和Thompson，2003年;波特等人，2002年)，我们通过对内源性TSC复合体的各种生化和免疫荧光分析证明，在mTORC1完全激活的时间范围内，急性胰岛素刺激对TSC复体完整性没有影响。生长因子对复杂装配或稳定性仍有可能产生长期影响。然而，在长达12小时的刺激过程中，还没有检测到这种影响(Manning等人，2002年)并且不能作为胰岛素和其他生长因子快速激活mTORC1的Akt依赖性基础。在我们对TSC复合体的生化表征中，我们发现内源性复合体的大小估计为2 MDa，远大于单个TSC1-TSC2-TBC1D7单元（365 kDa）的预测质量，但与四级结构中多个TSC1和TSC2亚基的证据一致(Hoogeveen-Westerveld等人，2012b). 这种大小与异三聚体单元相一致，我们无法在细胞裂解物中检测到异三聚物单元，可能形成了一个高阶五聚体结构，每个组分有五个。巧合的是，在酵母TSC1的N末端结构域的最近晶体结构中观察到了五聚体排列(Sun等人，2013年).

另一个关于TSC复合物调节的误解是，生长因子信号主要通过抑制TSC2的GAP活性发挥作用。对内源性TSC复合体的GAP分析确实揭示了胰岛素刺激细胞复合体GAP活性的轻微但显著且可重复的降低。然而，在胰岛素刺激后，TSC复合体的GAP活性基本上完好无损，表明Akt靶向位点上TSC2的磷酸化并不构成其GAP活性的开关。我们发现，即使在无细胞系统中，胰岛素和Akt信号也会削弱TSC复合物与Rheb的结合能力，因此在这些分析中测量到的GAP活性的轻微下降可能反映了这种结合效率的降低。Akt信号对Rheb释放TSC复合物和完整细胞中溶酶体的作用更强，表明这种空间调节涉及更复杂的物理相互作用。根据我们的数据，TSC复合物以一个大的寡聚体结构存在，似乎高阶复合物可能与溶酶体表面的多个Rheb蛋白同时相互作用，并且可能协同作用。虽然我们发现TSC复合物的溶酶体定位需要Rheb，但与其他溶酶体表面蛋白或脂质的相互作用也可能有助于这种定位和调节释放。目前，TSC复合体的组织结构完全未知，但值得注意的是，在TSC2的初级结构中，五个Akt磷酸化位点位于其GAP域之外。为了了解单个Akt磷酸化位点和其他调控位点的分子贡献，需要了解三种蛋白质的结构域如何在寡聚物中进行空间定位的结构信息，破坏与Rheb和溶酶体膜可能的其他成分的结合作用。

mTORC1上游有一个巨大的致癌基因和抑癌基因网络，其激活在遗传性肿瘤综合征和散发性癌症中很常见(梅农和曼宁，2009年). Rag GTPases上游的GATOR1功能缺失突变(Bar-Peled等人，2013年)，可促进肿瘤发生，导致人类肿瘤中mTORC1异常激活的大多数遗传事件直接或间接影响TSC复合体。TSC1和TSC2本身是肿瘤抑制因子，虽然在散发性癌症中很少突变，但在类癌综合征结节性硬化综合征（TSC）和淋巴管平滑肌瘤病（LAM）中被破坏，其特征是广泛的肿瘤表现出mTORC1信号升高(Crino等人，2006年). 此外，TBC1D7缺失会导致巨脑综合征，并伴有mTORC1信号增强(Capo-Chichi等人，2013年). 在TSC和LAM患者中，仅在TSC2中就发现了100多个不同的错义突变或框内缺失(Hoogeveen-Westerveld等人，2012a;Hoogeveen-Westerveld等人，2013年;Nellist等人，2005年). 似乎不影响TSC复合体稳定性或GAP活性的致病性突变可能会影响复合体在溶酶体表面的适当定位，而溶酶体是其调节Rheb的地方。在大多数mTORC1信号升高的散发性癌症中，经常激活的致癌信号通路，例如PI3K-Akt通路，通过促进TSC复合物与溶酶体的组成性分离，至少部分激活了mTORC1。反过来，靶向这些上游途径的药理学化合物将在溶酶体将TSC复合物驱动到Rheb，并抑制mTORC1的激活。

认识到这种空间调控是TSC复合体和Rheb的主要控制机制，为描述新发现的上游调控因子、突变或影响mTORC1信号的化合物的机制基础提供了一个有价值的工具。在这种情况下，研究人员可以利用影响mTORC1和TSC复合物在溶酶体向Rheb移位的独立机制。mTOR溶酶体定位的改变将表明对Ragulator-Rag分支的影响，而TSC2定位的改变则表明对TSC复合物上游或Rheb本身的影响。例如，细胞ATP水平降低通过多种独立途径抑制mTORC1信号传导，包括那些涉及AMPK的途径(Dibble和Manning，2013年). 我们发现广泛使用的AMPK活化化合物A769662(Cool等人，2006年)，阻断TSC复合物与溶酶体的胰岛素刺激分离，并抑制mTORC1激活，而不影响mTOR定位（数据未显示）。然而，使用敲除或敲除AMPKα1和α2的细胞，我们惊讶地发现，该化合物对mTORC1信号传导的影响与AMPK无关。有趣的是，最近的一项研究表明，偏心肌肉收缩激活了mTORC1，这与小鼠组织切片中TSC2和LAMP2的共定位减少有关(雅各布斯等人，2013年). 最后，我们的研究结果表明，GAP蛋白的空间调控可能是其他类别小G蛋白的一般控制机制，其中GAP蛋白受到磷酸化的剧烈调控，而对GAP活性没有已知影响，包括Akt的几个直接靶点(Chen等人，2011年;Miinea等人，2005年).

实验程序

补充材料

致谢

脚注

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